循環(huán)腫瘤DNActDNA檢測(cè)策略及臨床意義

1、循環(huán)腫瘤循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)檢測(cè)策略及臨床檢測(cè)策略及臨床 意義意義 2015.06.12 l腫瘤診療的困境：早期診斷 困難，錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)； 易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，預(yù)后差；放化 療易產(chǎn)生耐受；缺乏有效的 治療靶點(diǎn)等。 l早診早治，實(shí)時(shí)監(jiān)控、靶向 用藥及個(gè)體化診療是提高腫 瘤遠(yuǎn)期生存率、降低死亡率 的關(guān)鍵。 腫瘤診斷方法腫瘤診斷方法 l血清標(biāo)志物：蛋白類(lèi)（癌胚抗原，糖類(lèi)抗原，甲胎蛋 白等），核酸類(lèi)（microRNA, LncRNA） l影像學(xué)診斷(超聲，CT，MRI，PET，PET-CT) l循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell , CTC） l循環(huán)腫瘤DNA（ circu

2、lating tumor DNA，ctDNA） 循環(huán)腫瘤循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA) l人體血液循環(huán)系統(tǒng)中不斷流動(dòng)的攜帶一 定特征（包括突變，缺少，插入，重排， 拷貝數(shù)異常，甲基化等）來(lái)自腫瘤基因 組的DNA片段； l來(lái)源：1、來(lái)自于壞死的腫瘤細(xì)胞；2、 來(lái)自于凋亡的腫瘤細(xì)胞；3、循環(huán)腫瘤 細(xì)胞；4、來(lái)自于腫瘤細(xì)胞分泌的外排 體； l含量低，約占整個(gè)循環(huán)DNA的1%，甚 至只有0.01%。 ctDNActDNA發(fā)展簡(jiǎn)史發(fā)展簡(jiǎn)史 l1948年首次發(fā)現(xiàn)人體血液中存在著循環(huán)DNA，癌癥患者的循環(huán)腫 瘤DNA則發(fā)現(xiàn)于1977年。 l1994年發(fā)現(xiàn)這些DNA含有癌癥的標(biāo)志性突變，證明其來(lái)自于腫瘤。 l鑒

3、于腫瘤DNA會(huì)流入血液，香港中文大學(xué)的盧煜明（Dennis Lo） 教授推測(cè)胎兒DNA應(yīng)該也能進(jìn)入血液。1997年證明孕婦血液中攜 帶著男性胎兒的Y染色體。該發(fā)現(xiàn)允許醫(yī)生們?cè)趹言谐跗谕ㄟ^(guò)無(wú) 創(chuàng)方式檢測(cè)胎兒的性別，甚至篩查唐氏綜合癥等發(fā)育疾病。這是 產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的一次革命。 ctDNA優(yōu)勢(shì)優(yōu)勢(shì) l無(wú)創(chuàng)、無(wú)損、實(shí)時(shí)、多次； l當(dāng)不能獲得腫瘤組織信息時(shí)，可以開(kāi)展“液體活檢”； l假陽(yáng)性率低，靈敏度高，準(zhǔn)確度高，可用于腫瘤的早期診斷； l能夠?qū)δ[瘤的演化和適應(yīng)性改變進(jìn)行監(jiān)控； l能夠?qū)δ[瘤病人的治療效果進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控（尤其在追蹤腫瘤轉(zhuǎn)歸、轉(zhuǎn)移 和復(fù)發(fā)等方面），并進(jìn)行個(gè)性化的治療方案指導(dǎo)（如個(gè)性化靶向藥物

4、用 藥，個(gè)性化化療等）。 一類(lèi)具備廣泛應(yīng)用前景的腫瘤標(biāo)志物，可無(wú)創(chuàng)的用于腫瘤早期診 斷、發(fā)展過(guò)程監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷、以及個(gè)性化用藥指導(dǎo)。 ctDNActDNA檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)技術(shù) 敏感度 已知突變位點(diǎn)檢測(cè) （突變率 2%） l全基因組測(cè)序 l全外顯子測(cè)序 lRNA末端平行分析 法 l全基因組甲基化測(cè)序 數(shù)字?jǐn)?shù)字PCR l 將一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每個(gè)反應(yīng)器中包含或 不包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( DNA模板) ，實(shí)現(xiàn)“單分子模板PCR擴(kuò) 增”，擴(kuò)增結(jié)束后，通過(guò)陽(yáng)性反應(yīng)器的數(shù)目“數(shù)出”目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。 陰性微滴比例推算 起始靶分子的絕對(duì)量 泊松分布 一個(gè) 待分析的PCR反應(yīng)體

5、系 成千上萬(wàn)個(gè) 獨(dú)立的PCR反應(yīng)體系 : : 靶標(biāo)分 子 : : 有限稀釋 : 陽(yáng)性微滴（1 1） : 陰性微滴（0 0） 泊松分布 PCR擴(kuò)增 優(yōu)點(diǎn)：可絕對(duì)定量，靈敏度可達(dá)單個(gè)核酸分子，檢測(cè)限低至0.001%； 缺點(diǎn)：只能檢測(cè)已知的突變位點(diǎn)，通量低； l利用數(shù)字PCR監(jiān)測(cè)肺癌病人中第一 次服用埃羅替尼抗腫瘤藥物后的 血漿EGFR突變情況。 l經(jīng)過(guò)治療后，所有病人的EGFR突 變都出現(xiàn)下降，其中有8個(gè)病人突 變完全消失。 l有6個(gè)病人的EGFR突變?cè)诤罄m(xù)出 現(xiàn)上升，提前揭示疾病進(jìn)展。另 外3個(gè)病人的EGFR突變沒(méi)有變化， 病情無(wú)明顯進(jìn)展。 數(shù)字PCR可以用于評(píng)估和監(jiān)測(cè)血漿中ctDNA的特異突變

6、 l 結(jié)合數(shù)字PCR與流式技術(shù)，利用特異性PCR引物擴(kuò)增目標(biāo)突變區(qū)后，與磁 珠（磁珠上固定有特異的PCR 引物）混合進(jìn)行油包水單分子擴(kuò)增反應(yīng)。反 乳化作用后，利用不同顏色的熒光探針結(jié)合磁珠上的PCR產(chǎn)物，發(fā)出紅色 或綠色熒光。使用流式細(xì)胞儀分析磁珠顏色來(lái)確定突變情況。 BEAMing技術(shù) l利用腫瘤組織進(jìn)行sanger測(cè) 序定義腫瘤組織的基因突 變； l再利用Beaming技術(shù)檢測(cè)18 例癌癥病人中192份血漿樣 本中ctDNA的突變情況， 檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.005%。 術(shù)前:13.4% 術(shù)后:0.015% 術(shù)后(48天):0.11% 術(shù)后(244天):0.66% ctDNA: P = 0.

7、006 CEA: P = 0.03 Comparison of ctDNA, CEA and imaging dynamics in individual study subjects l病人都經(jīng)過(guò)多次手術(shù)和化療 l第一次手術(shù)進(jìn)行局部切除時(shí)， ctDNA含量并沒(méi)有降低；第 二次手術(shù)完全切除時(shí)， ctDNA含量大幅下降。 lctDNA能實(shí)時(shí)顯示病人體內(nèi) 腫瘤負(fù)荷的動(dòng)態(tài)信息，以及 治療的效果（手術(shù)及化療）。 標(biāo)記擴(kuò)增深度測(cè)序（標(biāo)記擴(kuò)增深度測(cè)序（TAM-Seq） l 二步擴(kuò)增： 預(yù)擴(kuò)增：利用特異性引物進(jìn)行15偱 環(huán)的目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增 標(biāo)簽擴(kuò)增：利用通用不同特性的接 頭標(biāo)簽進(jìn)行二次擴(kuò)增 l 雙向重復(fù)測(cè)序：

8、提高測(cè)序精度 l 突變頻率檢出率可達(dá)2% l 敏感性和特異性高于97% l 成本較低，利于臨床應(yīng)用 l設(shè)計(jì)了48對(duì)引物去擴(kuò)增TP53， EGFR，BARF，KRAS等癌 癥相關(guān)基因的5995bp突變區(qū) 域 l同時(shí)可對(duì)10個(gè)特異的癌癥突 變位點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)控 l用于確定多發(fā)癌癥患者的復(fù) 發(fā)病灶 l用于監(jiān)控癌癥患者的腫瘤動(dòng) 態(tài)發(fā)展 癌癥個(gè)體化深度測(cè)序癌癥個(gè)體化深度測(cè)序 (CAPP-Seq) l該方法利用定制化的突變位點(diǎn) 庫(kù)作為”篩選器”， 對(duì)樣本進(jìn) 行靶向捕獲后再進(jìn)行超深度測(cè) 序（可達(dá)到10000X），其對(duì) 腫瘤的ctDNA檢測(cè)靈敏度更高， 特異性更強(qiáng)，與全外顯子測(cè)序 等相比經(jīng)濟(jì)可行。 l Stage

9、I 檢出率50% l Stage II-IV 檢出率100% l 特異性可達(dá)到96% l 突變檢出率0.02% lSelector 區(qū)域：139個(gè)基因的521個(gè)外顯 子和13個(gè)內(nèi)含子，約125K，占人基因 組的0.004% l測(cè)序覆蓋深度10000X l腫瘤的早期診斷 l動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)生發(fā) 展及療效 l評(píng)估腫瘤的異質(zhì)性 l評(píng)估腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn) l靶向檢測(cè)耐藥突變，跟 蹤獲得性耐藥的發(fā)展， 進(jìn)行個(gè)性化用藥指導(dǎo) ctDNA的臨床應(yīng)用的臨床應(yīng)用 ctDNA ctDNA的分析指標(biāo)的分析指標(biāo) 4 cfDNA含量含量 1 2 3 5 ctDNA突變頻率突變頻率 微衛(wèi)星雜合性微衛(wèi)星雜合性 cfDNA完整性

10、完整性 ctDNA甲基化頻率甲基化頻率 ctDNA的分析指標(biāo)的分析指標(biāo) 4 cfDNA含量含量 1 2 3 5 ctDNA突變頻率突變頻率 微衛(wèi)星雜合性微衛(wèi)星雜合性 cfDNA完整性完整性 ctDNA甲基化頻率甲基化頻率 l乳腺癌病人（尤其在轉(zhuǎn)移性 乳腺癌）的血漿cfDNA的完 整性顯著下調(diào)，而血漿 cfDNA的濃度顯著上調(diào)，可 作為早期診斷的標(biāo)志物，具 有較好的敏感度和特異性。 l肝癌病人的血漿中存在兩種不同長(zhǎng)度的DNA分子：短鏈DNA分子（180bp ）； l短鏈DNA分子與ctDNA突變率及拷貝數(shù)異常相關(guān)，且與ctDNA濃度正相關(guān)； l長(zhǎng)鏈DNA分子不攜帶腫瘤相關(guān)ctDNA特征，且與ct

11、DNA濃度負(fù)相關(guān)。 l 肝癌病人血漿中線粒體DNA的含量顯著高于健康人、乙肝及肝硬化患者，對(duì) 肝癌的診斷具有較高的靈敏性和特異性，分別達(dá)80%和94%，可作為肝癌診斷 的有效分子標(biāo)記。 Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Mar 17;112(11):E1317-25. doi: 10.1073/pnas.1500076112. Epub 2015 Feb 2. Lengthening and shortening of plasma DNA in hepatocellular carcinoma patients. 線粒體DNA可用于肝癌的診斷 J Clin Pat

12、hol 2013;66:775-778 AmericanJournalofClinicalPathology2015;143(1):18-24. PLoSOne.2015;10(4):e0108247. ctDNA的分析指標(biāo)的分析指標(biāo) 4 cfDNA含量含量 1 2 3 5 ctDNA突變頻率突變頻率 微衛(wèi)星雜合性微衛(wèi)星雜合性 cfDNA完整性完整性 ctDNA甲基化頻率甲基化頻率 l 利用數(shù)字PCR檢測(cè)640例不同癌癥病人的血漿ctDNA，在超過(guò)75%的病人血液中 檢測(cè)到ctDNA，原發(fā)癌檢出率約為50%。 l在結(jié)腸癌，胃癌，胰腺癌，乳腺癌中，ctDNA檢出率分別為73%, 57%, 48%

13、, 50% 。 l 相對(duì)于原發(fā)癌，ctDNA在轉(zhuǎn)移癌中檢出率更高，且分期越高，ctDNA檢出率也更高； l可用于耐藥突變的檢測(cè)； lctDNA是普遍適用的、敏感和特異的標(biāo)志物,可用于不同類(lèi)型癌癥患者的臨床監(jiān)測(cè)。 NEnglJMed2013;368:1199-1209 l在30例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患 者接受系統(tǒng)性治療的不 同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定血液中的 ctDNA，CA 15-3， CTC 細(xì)胞的含量，比較三者 之間的敏感度。 Comparison of Circulating Tumor DNA, CA 15-3, and Circulating Tumor Cells as Blood- Based Bio

14、markers 靈敏度： 偱環(huán)腫瘤DNA：85% CA 15-3：59% 靈敏度： 偱環(huán)腫瘤DNA：90% 偱環(huán)腫瘤細(xì)胞：67% Comparison of Circulating Biomarkers to Monitor Tumor Dynamics and Predict Survival. l結(jié)論：相對(duì)于蛋白類(lèi)診斷標(biāo)志物CA15-3及血液中的偱環(huán)腫瘤細(xì)胞，ctDNA在監(jiān)測(cè)腫 瘤的動(dòng)態(tài)發(fā)展中具有更高的靈敏度。 l血漿中ctDNA的含量與預(yù)后密切相關(guān)，含量越高，病人的5年生存率越低（P0.001）。 lctDNA含量的增高及CTC數(shù)目的增加，病人的預(yù)后顯著變差，而CA15-3沒(méi)有預(yù)后判斷功

15、能。 l監(jiān)測(cè)ctDNA的突變率 比監(jiān)測(cè)cfDNA濃度， 對(duì)胃癌動(dòng)態(tài)發(fā)展的監(jiān) 控靈敏度更高。 l 利用區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù)檢測(cè)乳腺癌原發(fā)瘤及肝臟轉(zhuǎn)移瘤的基因突變情況，并 監(jiān)控血液中ctDNA在治療過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化。 l ctDNA在監(jiān)測(cè)腫瘤的動(dòng)態(tài)發(fā)展中具有更高的靈敏度和特異性； l ctDNA能比蛋白類(lèi)標(biāo)志物CA15.3更早的預(yù)測(cè)腫瘤動(dòng)態(tài)發(fā)展情況。 l相對(duì)于傳統(tǒng)的影像學(xué)及蛋白類(lèi)血清標(biāo)志物，通過(guò)評(píng)估ctDNA的突變頻率能更早、 更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者腫瘤經(jīng)治療后的動(dòng)態(tài)發(fā)展情況。 ctDNA的分析指標(biāo)的分析指標(biāo) 4 cfDNA含量含量 1 2 3 5 ctDNA突變頻率突變頻率 微衛(wèi)星雜合性微衛(wèi)星雜合性

16、 cfDNA完整性完整性 ctDNA甲基化頻率甲基化頻率 l利用亞硫酸氫鹽平行測(cè)序檢測(cè)不 同腫瘤患者（肝癌，乳腺癌，肺 癌，鼻咽癌等）血漿DNA甲基化 發(fā)生情況及血漿DNA拷貝數(shù)異常 情況，用于腫瘤的診斷及腫瘤負(fù) 荷的監(jiān)測(cè)； l血漿中甲基化癌癥診斷靈敏度為74% ，特異性為94%，具有較好的癌癥診斷應(yīng) 用價(jià)值。 Percentage of bins showing hypomethylation in HCC patients and chronic hepatitis B virus (HBV) carriers with cirrhosis l血漿DNA的甲基化程度在肝癌患者顯著上升，可用

17、于肝癌的診斷；靈敏度為81%， 特異性為94%； l血漿DNA拷貝數(shù)異常用于肝癌診斷，靈敏度為81%，特異性為88%。 Clin Cancer Res July 1, 2004 10; 4420 Journal of Thoracic Oncology: 2011 6 :1632-1638 World J Gastroenterol. 2011 Nov 28; 17(44): 49174921. Int. J. Cancer: 131, 11531157 (2012) ONCOLOGY REPORTS 32: 505-512, 2014 ctDNA的分析指標(biāo)的分析指標(biāo) 4 cfDNA含量含量

18、1 2 3 5 ctDNA突變頻率突變頻率 微衛(wèi)星雜合性微衛(wèi)星雜合性 cfDNA完整性完整性 ctDNA甲基化頻率甲基化頻率 l血漿中短鏈DNA分子發(fā)生 雜合性喪失的頻率顯著高于 長(zhǎng)鏈DNA分子。 l血漿中短鏈DNA的 cyclin D2 基因（D12S1725）的微 衛(wèi)星雜合性缺失，患者的預(yù) 后顯著變差，可作為乳腺癌 患者重要的預(yù)后標(biāo)志物。 l 在卵巢癌患者中，短鏈DNA微衛(wèi)星雜合性缺失的頻率達(dá)到67%, 化療后下調(diào)達(dá)到45%。 l血漿中 M6P/IGF2R (D6S1581) 的雜合性缺失與卵巢癌患者的生存率相關(guān)，有雜合性缺 失的病人預(yù)后較差 (p = 0.030)。 ctDNA在腫瘤診斷

19、與預(yù)后領(lǐng)域的應(yīng)用 ctDNA臨床應(yīng)用面臨的挑戰(zhàn)臨床應(yīng)用面臨的挑戰(zhàn) 1 2 3 4 l發(fā)展適合臨床應(yīng) 用的ctDNA檢測(cè)技 術(shù)(快速、精準(zhǔn)、 低成本) l個(gè)體化的ctDNA標(biāo)志物 lctDNA在腫瘤個(gè)性化 精準(zhǔn)治療領(lǐng)域的應(yīng)用 2015.06.12 l利用數(shù)字PCR監(jiān)測(cè)肺癌病人中第一 次服用埃羅替尼抗腫瘤藥物后的 血漿EGFR突變情況。 l經(jīng)過(guò)治療后，所有病人的EGFR突 變都出現(xiàn)下降，其中有8個(gè)病人突 變完全消失。 l有6個(gè)病人的EGFR突變?cè)诤罄m(xù)出 現(xiàn)上升，提前揭示疾病進(jìn)展。另 外3個(gè)病人的EGFR突變沒(méi)有變化， 病情無(wú)明顯進(jìn)展。 數(shù)字PCR可以用于評(píng)估和監(jiān)測(cè)血漿中ctDNA的特異突變 Comparison of ctDNA, CEA and imaging dynamics in individual study subjects l病人都經(jīng)過(guò)多次手術(shù)和化療 l第一次手術(shù)進(jìn)行局