生物化學(xué)生化筆記版

1、 1.1.1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 考點(diǎn)： 組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸的類別、分類依據(jù)及幾種特殊氨基酸的分類； 氨基酸的理化性質(zhì)、成肽反應(yīng)及體內(nèi)重要的生物活性肽； 蛋白質(zhì)的分類及分子結(jié)構(gòu)； 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)(包括一級(jí)結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu))與功能的關(guān)系； 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、分離純化的基本方法及其原理； 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定(即多肽鏈中氨基酸序列分析)和空間結(jié)構(gòu)的測(cè)定。 重點(diǎn)： 氨基酸的分類及理化性質(zhì)，蛋白質(zhì)的一級(jí)和空間結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系，分離純化蛋白質(zhì)的 原理和方法。 難點(diǎn)： 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，這也是眾多研究者花費(fèi)多年才解決的難題，我們只需弄清楚其要步 驟及各步的基本原理和方法即可。 基本知識(shí)與理論： 一

2、、蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能(了解即可) 蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，沒有蛋白質(zhì)就沒有生命，生物體結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，其蛋白質(zhì)種類和功 能越繁多，其主要的生物學(xué)功能是： （一）催化和調(diào)節(jié)能力 某些蛋白質(zhì)是酶，催化生物體內(nèi)的物質(zhì)代謝反應(yīng)。 某些蛋白質(zhì)是激素，具有一定的調(diào)節(jié)功能，如胰島素調(diào)節(jié)糖代謝、體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也常通過某 些蛋白質(zhì)介導(dǎo)。 （二）轉(zhuǎn)運(yùn)功能 某些蛋白具有運(yùn)載功能，如血紅蛋白是轉(zhuǎn)運(yùn)氧氣和二氧化碳的工具，血清白蛋白可以運(yùn)輸自 由脂肪酸及膽紅素等。 (三）收縮或運(yùn)動(dòng)功能 某些蛋白質(zhì)賦予細(xì)胞與器官收縮的能力，可以使其改變形狀或運(yùn)動(dòng)。如骨骼肌收縮靠肌動(dòng)蛋 白和肌球蛋白。 （四)防御功能 如 疫球蛋白，可抵抗外 的有

3、害物質(zhì)，保護(hù)機(jī)體。 （五）營養(yǎng)和儲(chǔ)存功能 如鐵蛋白可以儲(chǔ)存鐵。 (六）結(jié)構(gòu)蛋白 許多蛋白質(zhì)起支持作用，給生物結(jié)構(gòu)以強(qiáng)度及保護(hù)，如韌帶含彈性蛋白，具有雙向抗拉強(qiáng) 度。 （七）其他功能 如病毒和噬菌體是核蛋白，病毒可以致病。 二、蛋白質(zhì)的分子組成 （一）元素組成 組成蛋白質(zhì)分子的主要元素有碳、氫、氧、氮、硫。有些還含有少量磷或金屬元素。各種蛋 白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16，且蛋白質(zhì)是體內(nèi)的主要含氮物，因此可以根據(jù)生物樣 品的含氮量推算出蛋白質(zhì)的大致含量。 （二）氨基酸 氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位，存在于自然界的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質(zhì)的 氨基酸僅有20種，且均屬L-氨基酸 （甘氨酸

4、除外）即左旋氨基酸，因?yàn)楦拾彼釤o手性碳 原子(與四個(gè)不同的原子或基團(tuán)相連的碳原子)，大多數(shù)有手性碳原子的是手性分子，手性分 子有旋光活性。根據(jù)它們的側(cè)鏈R的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可分為四類： 1.非極性疏水性氨基酸：這類氨基酸的特征是在水中的溶解度小于極性氨基酸。 2.極性中性氨基酸： 這類氨基酸的特征是比非極性氨基酸 溶于水，且羧基數(shù)等于氨基數(shù)，故為中性氨基酸，但 因?yàn)轸然婋x能力較大，故其實(shí)際上具有弱酸性。 3.酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸。這兩種氨基酸都含有兩個(gè)羧基，在生理?xiàng)l件下帶負(fù)電， 故為酸性氨基酸。 4.堿性氨基酸：賴氨酸、精氨酸和組氨酸。這類氨基酸在生理?xiàng)l件下帶正電，故為堿性氨基 酸。 還要

5、記住這20種氨基酸的英文縮寫符號(hào)，尤其是三字符號(hào)，并且這四種類別的氨基酸中 還有幾種特殊的氨基酸，也 記住它們的獨(dú)特特征。 它們是芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸分子中含有芳香環(huán) 含硫氨基酸：甲硫氨酸、半胱氨酸分子中含硫元素，甲硫氨酸也叫蛋氨酸。 亞氨基酸：脯氨酸，其氨基處于環(huán)中，為亞氨基酸 支鏈氨基酸：纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，這三種均含有支鏈 其中有八種氨基酸人體內(nèi)不能自身合成，必須從食物中獲得，稱為必 氨基酸，它們是纈氨 酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。 三、氨基酸的理化性質(zhì) （一）兩性電離及等電點(diǎn) 氨基酸分子中含有堿性的-氨基和酸性的-羧基，能與酸

6、或堿類物質(zhì)結(jié)合成鹽，故它是一種 兩性電解質(zhì)。在某一pH值的溶液中氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢(shì)與程度相等，成為 兼性離子，呈電中性，此時(shí)溶液的pH稱為該氨基酸的等電點(diǎn)(pI)。這里有一個(gè)等電點(diǎn)的計(jì) 算問題： 1.側(cè)鏈R為非極性基團(tuán)或雖為極性但不解離的，此種氨基酸的等電點(diǎn)主要由-氨基和-羧基的解離常數(shù)的負(fù)對(duì)數(shù)pK1，pK2決定，pI=12(pK1+pK2) 2.側(cè)鏈基團(tuán)可以解離，則由-氨基，-羧基及R基團(tuán)解離情況共同決定，只 寫出電離式， 取其兼性離子兩邊的pK值的平均值即可。如賴氨酸其電離式為： 由電離式可以看出，其兼性離子兩邊pK值分別是pK-NH3+和pK-NH +而與-羧基無關(guān)故其pI

7、=12(8.95+10.537)=9.74 （二）紫外吸收性質(zhì) 色氨酸、酪氨酸在280nm波長附近有最大的紫外吸收峰，由于大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這類氨基 酸，所以測(cè)定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值，是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便方法。 （三）茚三酮反應(yīng)：氨基酸+茚三酮水合物還原茚三酮+氨，還原茚三酮+氨+茚三酮 藍(lán)紫色化合物，此化合物最大吸收峰在570nm波長處，由于此吸收峰值的大小與氨基酸釋放出的氨量成正比，因此可以作為氨基酸定量分析的方法。 四、肽 (一）肽鍵 兩分子氨基酸可由一分子所含的氨基與另一分子所帶的羧基脫去一分子水縮合成二肽，兩個(gè) 氨基酸之間產(chǎn)生的酰胺鍵稱為肽鍵，具有不典型雙鍵性質(zhì)。

8、由10個(gè)以內(nèi)的氨基酸縮合而成 的肽稱為寡肽，更多的氨基酸相連而構(gòu)成多肽。pr是具有更大分子量的多肽鏈，但多肽和pr 在分子量上很難劃出明確界限，實(shí)際應(yīng)用中只有一個(gè)習(xí)慣上的劃分。肽鏈中的氨基酸分子因脫水縮合而基團(tuán)不全，稱為氨基酸殘基。多肽鏈中自由氨基末端稱為N端，自由羧基末端稱 為C端，命名從N端指向C端。 （二）生物活性肽 1.谷胱甘肽 由谷氨酸和甘氨酸和半胱氨酸組成的三肽。第一個(gè)肽鍵比較特殊，由谷氨酸-羧基與半胱氨 酸的氨基組成。分子中半胱氨酸的巰基是該化合物的主要功能基團(tuán)。此巰基具有還原性，要記住谷胱甘肽的生理作用：作為體內(nèi)重要的還原劑；保護(hù)蛋白質(zhì)或酶 遭氧化，使它們處在活性狀態(tài)可還原細(xì)胞

9、內(nèi)產(chǎn)生的H ，避 細(xì)胞受損其巰基具有嗜核特性，能與外源的致癌劑或藥物等結(jié)合，從而阻斷它們與DNA、RNA或蛋白質(zhì)結(jié)合，保護(hù)機(jī)體 遭損 害。 2.多肽類激素及神經(jīng)肽。體內(nèi)有許多激素屬寡肽或多肽，如催產(chǎn)素、促腎上腺皮質(zhì)激素，促甲狀腺激素等。神經(jīng)肽是在神經(jīng)傳導(dǎo)過程中起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的肽類，如腦啡肽、-內(nèi)啡肽等。 五pr的分類 pr的分類分單純pr、結(jié)合pr，后者除aa外，還含有非pr部分即輔基，絕大部分輔基以共價(jià)健與pr部分相連，根據(jù)形狀分纖維pr及球狀pr 六、蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu) (要注意構(gòu)成各級(jí)結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵) 可分為一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)四個(gè)層次，后三者統(tǒng)稱為高級(jí)結(jié)構(gòu)或空間構(gòu)象。蛋白質(zhì) 的空間構(gòu)

10、象涵蓋了蛋白質(zhì)分子中每一個(gè)原子在三維空間的相對(duì)位置，并非所有pr都有四級(jí)結(jié)構(gòu)，由二條或二條以上多肽鏈形成的pr才有四級(jí)結(jié)構(gòu)。 （一）蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)分子中氨基酸的排列順序。主要化學(xué)鍵是肽鍵和二硫鍵。一級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。氨基酸排列順序的差別意味著從多肽鏈骨架伸出的側(cè)鏈R基團(tuán)的性質(zhì)和順序?qū)τ诿恳环N蛋白質(zhì)是特異的 因?yàn)镽基團(tuán)大小不同，所帶電荷數(shù)目不同，對(duì)水的親和力不相同，所以蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象也不同。 （二）蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，也就是該段肽鏈主鏈骨架原子的相對(duì)空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的

11、構(gòu)象。維系二級(jí)結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵主要是氫鍵。二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式包括：-螺旋結(jié)構(gòu)、一折疊、-轉(zhuǎn)角和無 則卷曲。 1.肽單元。參與肽鍵的6個(gè)原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，且C1、C2在平面上所處的位置為反式構(gòu)型，此6個(gè)原子即構(gòu)成了肽單元，其基本結(jié)構(gòu)為 圖中的A、B鍵是單鍵，可自由旋轉(zhuǎn)，也正由于這兩個(gè)單鍵的自由旋轉(zhuǎn)角度，決定了相鄰肽單元之間的相對(duì)空間位置。其中的肽鍵有一定程度雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。 2.-螺旋。多肽鏈主鏈圍繞中心軸有規(guī)律的螺旋式上升，每隔3.6個(gè)殘基螺旋上升一圈，每個(gè)氨基酸殘基向上平移0.15nm，故螺距為0.54nm。螺旋的走向?yàn)橛沂致菪?螺旋的每個(gè)肽鍵的NH和第四個(gè)肽

12、鍵的羰基氧形成氫鍵，氫鍵的方向與螺旋長軸基本平行，側(cè)鏈R基團(tuán)則伸向螺旋外。 3.-折疊。多肽鏈充分伸展，每個(gè)肽單元以C為旋轉(zhuǎn)點(diǎn)折疊成鋸齒狀結(jié)構(gòu)，側(cè)鏈R基團(tuán)交錯(cuò) 位于鋸齒狀結(jié)構(gòu)的上下方。可由兩條以上肽鏈或一條肽鏈內(nèi)的若干肽段折疊成鋸齒狀結(jié)構(gòu)。 平行肽段間靠鏈間肽鍵羰基氧和亞氨基氫形成氫鍵，使構(gòu)象穩(wěn)定，此氫鍵方向與折疊的長軸 垂直。兩條平行肽鏈走向可相同或相反，由一條肽鏈折返形成的-折疊多為反式，反式平行較順式平行更為穩(wěn)定。 4.-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲。-轉(zhuǎn)角常發(fā)生于肽鏈進(jìn)行180度回折時(shí)的轉(zhuǎn)角上，通常由4個(gè)氨基酸殘基組成，其第一個(gè)殘基的羰基氧與第四個(gè)殘基的氨基氫可形成氫鍵。-轉(zhuǎn)角第二個(gè)殘基常為脯氨酸，

13、因?yàn)槠銷原子位于環(huán)中，形成肽鍵N原子上已沒有H，不能再形成氫鍵，故走向轉(zhuǎn)折-轉(zhuǎn)角常發(fā)生在蛋白質(zhì)分子的表面，這與蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能有關(guān)。 無規(guī)卷曲用 闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結(jié)構(gòu)。 5.模序。指在許多蛋白質(zhì)分子中，可發(fā)現(xiàn)兩個(gè)或三個(gè)具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個(gè)具有特殊功能的空間結(jié)構(gòu)，稱為模序。實(shí)際上它是一種超二級(jí)結(jié)構(gòu)。一個(gè)模序總有其特征性的氨基酸序列，并發(fā)揮特殊的功能。常見的-螺旋 環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)及鋅指結(jié)構(gòu)，前者可結(jié)合Ca2+，后者可結(jié)合Zn2+，使-螺旋能鑲嵌于DNA的大溝中。因此含此結(jié)構(gòu)的pr可與DNA或RNA結(jié)合，這對(duì)于pr調(diào)控DNA的轉(zhuǎn)錄和pr翻譯過程是必要的。一段肽

14、鏈 其氨基酸殘基的側(cè)鏈適合形成-螺旋或-折疊，就會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，aa殘基帶相同 的電荷或側(cè)鏈太大，都會(huì)妨礙二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，此外還有一個(gè)分子伴侶的概念，其作用就是 使肽鏈正確折疊，從而形成正確的空間構(gòu)象。 （三）蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu) 指整條肽鍵中全部氨基酸殘基的相對(duì)空間位置，也就是整條肽鏈所有原子在三維空間的排布 位置。三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定主要靠疏水鍵、鹽鍵、二硫鍵、氫鍵和范德華力等次級(jí)鍵。其 中疏水鍵是最主要的穩(wěn)定力量。疏水鍵是蛋白質(zhì)分子中疏水基團(tuán)之間的結(jié)合力，酸性和堿性 氨基酸的R基團(tuán)可以帶電荷，正負(fù)電荷互相吸引形成鹽鍵，與氫原子共用電子對(duì)形成的鍵為氫鍵。 分子量大的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)其整條肽

15、鏈中?？煞指畛啥嗾郫B得轉(zhuǎn)為緊密的結(jié)構(gòu)域，實(shí)際上結(jié) 構(gòu)域也是一種介于二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的結(jié)構(gòu)層次，每個(gè)結(jié)構(gòu)域執(zhí)行一定的功能。 （四）蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)是由有生物活性的兩條或多條肽鏈組成，肽鏈與肽鏈之間不通過共價(jià)鍵相 連，而由非共價(jià)鍵維系。每條多肽鏈都有其完整的三級(jí)結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的亞基，這種蛋白 質(zhì)分子中各個(gè)亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。 在四級(jí)結(jié)構(gòu)中，各亞基之間的結(jié)合力主要是疏水作用，氫鍵和離子鍵也參與維持四級(jí)結(jié)構(gòu)。 含有四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，單獨(dú)的亞基一般沒有生物學(xué)功能，只有完整的四級(jí)結(jié)構(gòu)才有生物學(xué) 功能。 七、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 (一)

16、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 要明白三點(diǎn)： 1.一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象和功能的基礎(chǔ)，空間構(gòu)象遭破壞的多肽鏈只要其肽鍵未斷，一級(jí)結(jié)構(gòu) 未被破壞，就能恢復(fù)到原 的三級(jí)結(jié)構(gòu)，功能依然存在。 2.即使是不同物種之間的多肽和蛋白質(zhì)，只要其一級(jí)結(jié)構(gòu)相似，其空間構(gòu)象及功能也越相 似。 3.物種越接近，其同類蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)越相似，功能也相似。 但一級(jí)結(jié)構(gòu)中有些氨基酸的作用卻是非常重要的，若蛋白質(zhì)分子中起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基 缺失或被替代，都會(huì)嚴(yán)重影響其空間構(gòu)象或生理功能，產(chǎn)生某種 病，這種由蛋白質(zhì)分子發(fā) 生變異所導(dǎo)致的 病，稱為“分子病”。 (二)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)多種多樣的功能與各種蛋白質(zhì)特定的空

17、間構(gòu)象密切相關(guān)。其構(gòu)象發(fā)生改變，功能活性 也隨之改變。以肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)為例闡述蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。 Mb與Hb都是含有血紅素輔基的蛋白質(zhì)。攜帶氧的是血紅素中的Fe +，F(xiàn)e 有6個(gè)配位鍵，其中四個(gè)與吡咯環(huán)N配位結(jié)合，一個(gè)與蛋白質(zhì)的組氨酸殘基結(jié)合，另一個(gè)即可與氧結(jié)合。而血紅素與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定結(jié)合主要靠以下兩種作用：一是血紅素分子中的兩個(gè)丙酸側(cè)鏈與肽鏈中氨基酸側(cè)鏈相連，另一作用即是肽鏈中的組氨酸殘基與血紅素中Fe2+配位結(jié)合。 Mb只有一條肽鏈，故只結(jié)合一個(gè)血紅素，只攜帶1分子氧，其氧解離曲線為直角雙曲線，而Hb是由四個(gè)亞基組成的四級(jí)結(jié)構(gòu)，共可結(jié)合4分子氧，其氧解離曲線為

18、“S”形曲線，從曲線的形狀特征可知，Hb第一個(gè)亞基與O2結(jié)合，可促進(jìn)第二、第三個(gè)亞基與O2的結(jié)合，前三個(gè)亞基與O2結(jié)合，又大大促進(jìn)第四個(gè)亞基與O2結(jié)合，這種一個(gè)亞基與其配體結(jié)合后，能影響蛋白質(zhì)分子中另一亞基與配體結(jié)合能力的效應(yīng)，稱協(xié)同效應(yīng)，O 與Hb之間是促進(jìn)作用，稱正協(xié)同效應(yīng)。之所以會(huì)有這種效應(yīng)，是因?yàn)槲唇Y(jié)合O2時(shí)，Hb結(jié)構(gòu)緊密，此時(shí)Hb與O2親和力小，隨著O2的結(jié)合，其亞基之間鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)變得松弛，此種狀態(tài)Hb與O2親和力即增加。這種一個(gè)氧分子與Hb亞基結(jié)合后引起亞基構(gòu)象變化的效應(yīng)稱變構(gòu)效應(yīng)，有關(guān)此效應(yīng)會(huì)在后面酶一章中詳細(xì)解釋。肌紅蛋白只有一條肽鏈，不存在協(xié)同效應(yīng)。由此可見，Hb與Mb

19、在空間結(jié)構(gòu)上的不同，決定了它們?cè)隗w內(nèi)發(fā)揮不同的生理功能。 八、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化 (一)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)pr既具有aa的相關(guān)性質(zhì)，又具有作為生物大分子的一些獨(dú)特的性質(zhì)。 1.蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn)，這與aa的性質(zhì)相似，其氨基、羧基及側(cè)鏈的某些基團(tuán)皆可 解離。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電 荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)溶液的pH大于等電點(diǎn)時(shí)，該蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，反之帶正電荷。體內(nèi)各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，但大多數(shù)接近于pH5.0，所以在人體體液pH7.4的環(huán)境下，大多數(shù)蛋白質(zhì)解離成陰離子，帶負(fù)電。 2.蛋白質(zhì)的膠

20、體性質(zhì)這是pr作為生物大分子才有的性質(zhì)可將蛋白質(zhì)溶液看作膠體溶液。pr作為溶液穩(wěn)定存在的兩大因素：一是蛋白質(zhì)顆粒表面大多為親水基團(tuán)，可吸引水分子，使顆粒表面形成一層水化膜，從而阻斷蛋白質(zhì)顆粒的相互聚集，防止溶液中蛋白質(zhì)的沉淀析出；二是蛋白質(zhì)顆粒表面可帶相同電荷顆粒之間相互排斥不 聚集沉淀，也可以起穩(wěn)定顆粒的作 用。若去除蛋白質(zhì)顆粒這兩個(gè)穩(wěn)定因素，蛋白質(zhì)極易從溶液中沉淀。 3.蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固這也是pr區(qū)別于aa的特有性質(zhì)。(1)變性：蛋白質(zhì)在某些理化 因素的作用下，其空間結(jié)構(gòu)受到破壞，從而改變其理化性質(zhì)，并失去其生物活性，稱為變 性。一般認(rèn)為蛋白質(zhì)變性并不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，故若蛋白質(zhì)

21、變性較輕，在去除變性因素 后，其仍可恢復(fù)原有的構(gòu)象和功能，稱復(fù)性。但若其空間構(gòu)象遭到嚴(yán)重破壞，則去除變性因 素也不能復(fù)性，稱不可逆變性。引起變性的因素有各種物理或化學(xué)因素。蛋白質(zhì)變性后因其 空間結(jié)構(gòu)受到破壞，其性質(zhì)也受影響，如 沉淀，粘度增加，作為酶其催化活性喪失等。雖 然變性后蛋白質(zhì)失去水化膜，其疏水側(cè)鏈暴露，但只要其溶液pH值不等于蛋白質(zhì)酶等電 點(diǎn)，蛋白質(zhì)仍可不沉淀，故變性后，蛋白質(zhì)溶解度減少卻并不一定沉淀。醫(yī)學(xué)上消毒滅菌，就是基于蛋白質(zhì)變性的原理，而生物制品的制備和保存則必須防止蛋白質(zhì)變性。 （2）沉淀：蛋白質(zhì)在溶液中的穩(wěn)定因素是水化膜及電荷，因而凡是能消除蛋白質(zhì)表面的水 化膜并中和電荷

22、的試劑均可以引起蛋白質(zhì)的沉淀。常用的有中性鹽、有機(jī)溶劑、某些生物堿 試劑、大分子酸類及重金屬鹽類等。 （3）凝固：蛋白質(zhì)經(jīng)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿作用發(fā)生變性后，仍能溶解于強(qiáng)堿或強(qiáng)酸溶液中，若將pH調(diào)至等電點(diǎn)，則變性蛋白質(zhì)立即結(jié)成絮狀的不溶解物，此絮狀物仍可溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中，如再加熱則絮狀物可變成較堅(jiān)固的凝塊，此凝塊不 再溶于強(qiáng)酸與強(qiáng)堿中，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的凝固作用。如雞蛋煮熟后本 流動(dòng)的蛋清變成了固體，實(shí)際上凝固是蛋白質(zhì)變性后進(jìn)一步發(fā)展的不可逆的結(jié)果。 4.蛋白質(zhì)的紫外吸收。由于蛋白質(zhì)分子中含有有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸，因此在 280nm波長處有特征性吸收峰，這與aa相似。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的吸收

23、光度值與其 濃度成正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測(cè)定。 5.蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng) 茚三酮反應(yīng)：與氨基酸作用原理相似。 雙縮脲反應(yīng)：肽鍵+硫酸銅稀堿溶液紫色、紅色物，氨基酸不出現(xiàn)此反應(yīng)，故可檢 測(cè)蛋白質(zhì)水解程度。 （二）蛋白質(zhì)的分離與純化 蛋白質(zhì)的分離純化過程就是巧妙利用蛋白質(zhì)分子在大小、形狀、所帶電荷種類與數(shù)量、極性 與非極性氨基酸比例、溶解度、吸附性質(zhì)以及對(duì)其他生物大分子親和力上的差異，將雜蛋白 除去的過程，即利用蛋白質(zhì)物理、化學(xué)性質(zhì)的差異，將不同的蛋白質(zhì)采用恰當(dāng)?shù)姆椒ǚ珠_， 常用的方法如下： 1.根據(jù)蛋白質(zhì)兩性電離及等電點(diǎn)分離的方法： 等電點(diǎn)沉淀法：因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在其等電點(diǎn)的pH值附近 沉淀析出，故

24、利用各種蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同，即可將蛋白質(zhì)從混合溶液中分開。 電泳：指蛋白質(zhì)在一定pH情況下帶電荷，在電場(chǎng)中能由電場(chǎng)一極向另一極移動(dòng)的現(xiàn)象。這實(shí)際上也利用了蛋白質(zhì)分子、形狀的不同，因?yàn)橛蝿?dòng)快慢與蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)、數(shù)目、分子、形狀有關(guān)，對(duì)帶相同性質(zhì)電荷的蛋白質(zhì) 說，帶電多、分子小及為球狀分子的蛋白質(zhì)游動(dòng) 率大，故不同蛋白質(zhì)得以分離。根據(jù)支撐物不同，可分為薄膜電泳和凝膠電泳等。不同支持物，分辨率不同，如正常人血清蛋白電泳僅分出五條區(qū)帶，而聚丙烯酰胺凝膠電泳可分出30多條帶。電泳結(jié)束后，用蛋白質(zhì)顯色劑呈色，即可看到一條條已經(jīng)分離的蛋白質(zhì)條帶。 離子交換層析：在某一特定pH值時(shí)，混合蛋白質(zhì)溶液中各種

25、蛋白質(zhì)所帶電荷數(shù)目及性質(zhì) 不同，事 在層析柱中裝上離子交換劑，其所帶電荷性質(zhì)與蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)相反，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合溶液流經(jīng)層析柱時(shí)，即可被吸附于柱上，隨后用與蛋白質(zhì)帶相同性質(zhì)電荷的洗脫劑洗脫，蛋白質(zhì)可被置換下 ，由于各種蛋白質(zhì)帶電量不同，離子交換劑結(jié)合的緊密度不同，帶電量小的蛋白質(zhì) 被洗脫下 ，增加洗脫液離子強(qiáng)度，帶電量多的也被洗脫下 ，可將蛋白質(zhì)分離。 2.利用蛋白質(zhì)分子量不同分離的方法 透析：利用特殊膜制成透析袋，此膜只允許小分子化合物透過，而蛋白質(zhì)是高分子化合物故留在袋內(nèi)，故把袋置于水中，蛋白質(zhì)溶液中的小分子雜質(zhì)可被去除，如去除鹽析后蛋白質(zhì)中混雜的鹽類。也常利用此方法濃縮蛋白質(zhì)。即袋外放吸水

26、劑，小分子的水即可透出，蛋白質(zhì)溶液可被濃縮。 分子篩：也叫凝膠過濾，是層析的一種。層析柱內(nèi)填充帶有網(wǎng)孔的凝膠顆粒。蛋白質(zhì)溶液加于柱上，小分子蛋白進(jìn)入孔內(nèi)，大分子蛋白不能進(jìn)入孔內(nèi)而直接流出，小分子因在孔內(nèi)被滯留而隨后流出，從而蛋白質(zhì)得以分離。 超離心：蛋白質(zhì)膠體溶液與氯化鈉等真溶液不同之處在于：蛋白質(zhì)在強(qiáng)大離心場(chǎng)中，在溶液中會(huì)逐漸沉降，各種蛋白質(zhì)沉降所 離心力場(chǎng)不同，故可用超 離心法分離蛋白質(zhì)及測(cè)定其分子量，因其結(jié)果準(zhǔn)確又不使蛋白質(zhì)變性，故是目前分離生物高分子常用的方法。 3.與蛋白質(zhì)的沉淀的性質(zhì)相關(guān)的分離方法： 鹽析：硫酸銨、硫酸鈉等中性鹽因能破壞蛋白質(zhì)在溶液中穩(wěn)定存在的兩大因素，故能使蛋 白

27、質(zhì)發(fā)生沉淀。不同蛋白質(zhì)分子顆粒大小不同，親水程度不同，故鹽析所 要的鹽濃度不 同，從而將蛋白質(zhì)分離，如用硫酸銨分離清蛋白和球蛋白，在半飽和的硫酸銨溶液中，球蛋 白即可從混合溶液中沉淀析出除掉，而清蛋白在飽和硫酸銨中才會(huì)沉淀。鹽析的優(yōu)點(diǎn)是不會(huì) 使蛋白質(zhì)發(fā)生變性。 丙酮沉淀：丙酮可溶于水，故能與蛋白質(zhì)爭水破壞其水化膜，使蛋白質(zhì)沉淀析出，在pH 值和離子強(qiáng)度適當(dāng)?shù)那闆r下更佳，但丙酮使蛋白質(zhì)變性，故應(yīng)低溫快 分離，還可用其他有 機(jī)溶劑。 重金屬鹽沉淀：因其帶正電荷，可與蛋白質(zhì)負(fù)離子結(jié)合形成不溶性蛋白鹽沉淀，可利用此 性質(zhì)以大量清蛋白搶救重金屬鹽中毒的人。 (三)多肽鏈中氨基酸序列分析 主要步驟及原理如

28、下： 1.純化蛋白質(zhì)：用于序列分析的蛋白質(zhì)應(yīng)是分子大小均一，電游呈現(xiàn)一條帶具有一定純度的 樣品。 2.分析蛋白質(zhì)的氨基酸組成：用酸、堿等將蛋白質(zhì)肽鏈水解為游離氨基酸，再用電泳、層析 等方法分離、鑒定所有游離氨基酸的種類和含量，現(xiàn)在可用氨基酸自動(dòng)分析儀 快 測(cè)定。 3.測(cè)定肽鏈中N末端和C末端為何種氨基酸；若蛋白質(zhì)由兩條以上肽鏈組成，通過末端氨基酸的測(cè)定還可估計(jì)蛋白質(zhì)中的肽鏈數(shù)目。 N末端氨基酸測(cè)定：二硝基氟苯、丹磺酰氯都可與末端氨基反應(yīng)，再用鹽酸等將肽鏈水 解，將帶有二硝基氟苯或丹磺酰氯的氨基酸水解下 ，即可分離鑒定出為何種氨基酸，因丹 磺酰氯具強(qiáng)烈熒光更 鑒別。 C末端氨基酸測(cè)定：用相應(yīng)的羧

29、肽酶將C末端氨基酸水解下 ，因各種羧肽酸水解氨基酶的專一性不同，故可對(duì)C末端氨基酸做出鑒定。 4.將鏈間、鏈內(nèi)二硫鍵打開，否則會(huì)阻礙蛋白水解溶劑的作用，常用巰基化合物還原法。 5.選擇適當(dāng)?shù)拿富蚧瘜W(xué)試劑將肽鏈部分水解成適合作序列分析的小肽段，常用的方法有：胰蛋白酶法：水解賴氨酸或精氨酸的羧基形成的肽鍵，故若蛋白質(zhì)分子中有4個(gè)精氨酸或 賴氨酸殘基，可得5個(gè)肽段。 胰凝乳蛋白酶法：水解芳香族氨基酸羧基側(cè)的肽鍵 溴化氰法：水解甲硫氨酸羧基側(cè)的肽鍵。 6.測(cè)定各肽段的氨基酸排列順序： 一般采用Edman降解法。 因PITC(異硫氰酸苯酯)只與N末端氨基酸作用，用冷稀酸將此末端殘基水解下 ，鑒定為何種氨

30、基酸衍生物，殘留的肽段N末端可繼續(xù)與PITC反應(yīng)，依次逐個(gè)鑒定出氨基酸的排列順序。 7.多肽鏈用兩種方法分別裂解成幾組肽段，并測(cè)定每一方法中每一肽段的氨基酸排列順序，用肽段重疊法確定整條肽鏈的氨基酸順序，若用兩種方法找不出重疊肽段，就用第三種、第四種方法，直到找出重疊肽段。 8.確定二硫鍵位置： 用電泳法將拆開二硫鍵的肽段條帶與未拆開二硫鍵的條帶進(jìn)行對(duì)比即可定位二硫鍵的位置。如此以 ，一個(gè)完整蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)即可被測(cè)定。 (四)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測(cè)定 常用的方法有X射線晶體衍射法和二維核磁共振技術(shù)，還可根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列預(yù)測(cè)其三維空間結(jié)構(gòu)。 1.1.2 核酸的結(jié)構(gòu)與功能 考點(diǎn)： 核酸的分子

31、組成； DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)及其功能； 幾種主要RNA(mRNA、tRNA)的結(jié)構(gòu)與功能； DNA的理化性質(zhì)及應(yīng)用。 重點(diǎn)： DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu) 雙螺旋結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)；DNA的變性復(fù)性特點(diǎn)及此特點(diǎn)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用是。 基本知識(shí)與理論： 一、核酸的化學(xué)組成 核酸是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子。包括兩類：一類為脫氧核糖核酸 （DNA），另一類為核糖核酸 （RNA）。DNA存在于細(xì)胞核和線粒體內(nèi)，攜帶遺傳信息；RNA存 在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，參與細(xì)胞內(nèi)遺傳信息的表達(dá)。核酸的基本組成單質(zhì)是核苷酸，而核苷酸又是由堿基、戊糖、磷酸組成。 (一)堿基 構(gòu)成核苷酸的堿基主要有五種，分屬嘌呤和嘧啶兩類

32、。嘌呤類化合物包括腺嘌呤A和鳥嘌呤G兩種。嘧啶類化合物有三種，胞嘧啶C和胸腺嘧啶T尿嘧啶U。嘌呤和嘧啶環(huán)中均含有共軛雙鍵，因此對(duì)波長260nm左右的紫外光有較強(qiáng)吸收，這一性質(zhì)可用于對(duì)核酸、核苷酸、及堿基進(jìn)行定性定量分析。 (二)戊糖與核苷、核苷酸 戊糖是核苷酸的另一個(gè)主要成分，RNA和DNA主要區(qū)別有兩點(diǎn)：一是構(gòu)成DNA的堿基為A、T、G、C，而RNA的堿基為A、U、C、G，二是構(gòu)成DNA的核苷酸的戊糖是-D2-脫氧核糖，而構(gòu)成DNA的核苷酸的戊糖為-D核糖。即RNA糖環(huán)上2號(hào)碳原子處連的是-OH，而DNA此處連的是-H。表示堿基和糖環(huán)上各原子次序時(shí)，在堿基雜環(huán)上標(biāo)以順序1，2， 3；在糖環(huán)上

33、標(biāo)以l，2，3以作區(qū)別。堿基與戊糖通過糖苷鍵連接成核苷。連接位置是C-1。核苷與磷酸通過磷酸酯鍵連接成核苷酸連接位置是C-5。此處可連接一個(gè)、二個(gè)、三個(gè)磷酸基團(tuán)，稱為核苷一磷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸。體內(nèi)還有一種核苷酸，即 C-3與C-5與同一磷酸基團(tuán)相連，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。 二、DNA的結(jié)構(gòu)與功能 DNA與蛋白質(zhì)一樣，也有其一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)。 （一） DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu) 指DNA分子中核苷酸的排列順序。由于核苷酸的差異主要表現(xiàn)在堿基上，因此也叫做堿基序列。 四種核苷酸按一定排列順序，通過磷酸二酯鍵連成主要核苷酸鏈，連接都是由前一核苷酸3-OH與下一核苷酸5-磷酸基形成3-5磷酸二酯

34、鍵，故核苷酸鏈的兩個(gè)末端分別是5-游離磷酸基和3-游離羥基，書寫應(yīng)從5到3。 （二）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu) 即雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，要與蛋白質(zhì)的-螺旋相區(qū)別。 1.Chargaff 則 DNA分子中腺嘌呤與胸腺嘧啶的含量相等，鳥嘌呤與胞嘧啶的含量相等；因此DNA中嘌呤與嘧啶的總數(shù)相等：即AG=CT 2.雙螺旋結(jié)構(gòu)模型 1953年Watson和Crick正式提出了關(guān)于DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的右手雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，主要內(nèi)容 有： （1）DNA分子由兩條反向平行的多聚核苷酸鏈圍繞同一中心軸盤曲而成，兩條鏈均為右手 螺旋，鏈呈反平行走向，一條走向是53，另一條是35。 （2）DNA鏈的骨架由交替出現(xiàn)的親水的脫氧核糖基和磷酸

35、基構(gòu)成，位于雙螺旋的外側(cè)，堿 基配對(duì)位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)。 （3）兩條多聚核苷酸鏈以堿基之間形成氫鍵配對(duì)而相連，即A與T配對(duì)，形成兩個(gè)氫鍵，G與C配對(duì)，形成三個(gè)氫鍵。堿基相互配對(duì)又叫堿基互補(bǔ)。RNA中若也有配對(duì)區(qū)，A是與U以兩個(gè)氫鍵配對(duì)互補(bǔ)。 (4)堿基對(duì)平面與螺旋軸幾乎垂直，相鄰堿基對(duì)沿軸轉(zhuǎn)36，上升0.34nm。每個(gè)螺旋結(jié)構(gòu) 含10對(duì)堿基，螺旋的螺距為3.4nm，直徑是2.0nm。DNA兩股鏈之間的螺旋形成凹槽：一 條淺的，叫小溝；一條深的，叫大溝。大溝是蛋白質(zhì)識(shí)別DNA的堿基序列發(fā)生相互作用的 基礎(chǔ)，使蛋白質(zhì)和DNA可結(jié)合而發(fā)生作用。 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)要與pr的相區(qū)別：DNA是兩條核苷酸鏈通

36、過堿基之間氫鍵相連而成，而蛋白質(zhì)的-螺旋是一條肽鏈自身盤曲而成，其氫鍵是其內(nèi)部第一位肽鍵的N-H與第四個(gè)肽鍵的羰基氧形成的。 （5）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定主要由互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵和堿基堆積力 維持。堿基堆積 力是堿基對(duì)之間在垂直方向上的相互作用，可以使DNA分子層層堆積，分子內(nèi)部形成疏水 核心，這對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定是很有利的，堿基堆積力對(duì)維持DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)起主要作用。 3.DNA結(jié)構(gòu)的多樣性 DNA右手雙螺旋結(jié)構(gòu)是DNA分子在水性環(huán)境和生理?xiàng)l件下最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，但并不是不變 的，當(dāng)改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度或相對(duì) 度時(shí)，DNA結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，除了WastonCrick模 型 （BDNA）外，還存在Z

37、DNA和ADNA （三）DNA三級(jí)結(jié)構(gòu) 真核生物DNA分子很大，DNA鏈很長，但卻要存在于小小的細(xì)胞核內(nèi)，因此DNA必須在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上緊密折疊，這就形成了三級(jí)結(jié)構(gòu)。 1.超螺旋 原核生物DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu) 絕大部分原核生物DNA是共價(jià)閉合的環(huán)狀雙螺旋分子，此環(huán)形分子可再次螺旋形成超螺 旋，真核生物線粒體、葉綠體DNA也為環(huán)形分子，能形成超螺旋，非環(huán)形DNA分子在一定條件下局部也可形成超螺旋。 2.真核細(xì)胞基因組DNA 真核細(xì)胞核內(nèi)染色體即是DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)的主要表現(xiàn)形式。組蛋白H 2A 、H2B、H3、H4各兩分子組成組蛋白八聚體。DNA雙螺旋纏繞其上構(gòu)成核心顆粒，顆粒之間再以DNA和組蛋白H

38、1連成核小體，核小體再經(jīng)多步旋轉(zhuǎn)折疊形成棒狀染色體，存在于細(xì)胞核中。 (四)DNA的功能 DNA的基本功能就是作為生物遺傳信息復(fù)制的模板和基因轉(zhuǎn)錄的模板，是生命遺傳繁殖的 物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個(gè)體生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。 三、RNA的結(jié)構(gòu)與功能 RNA通常以單鏈形式存在，這與DNA雙鏈形成螺旋不同，但也可以有局部的二級(jí)結(jié)構(gòu)或三 級(jí)結(jié)構(gòu)。RNA分子比DNA分子小，它的功能多樣，種類較多，主要有信使RNA、核蛋白體RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、小核RNA及核不均一RNA等。各類RNA在遺傳信息表達(dá)為氨基酸序列過程中發(fā)揮不同的作用。 （一）信使RNA （mRNA） 在細(xì)胞核內(nèi)以DNA單鏈為模板轉(zhuǎn)錄生成hnRNA,hnRNA

39、經(jīng)過剪切變?yōu)槌墒斓膍RNA,出核后 在胞質(zhì)內(nèi)為蛋白質(zhì)合成提供模板。成熟mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 1.具有5端帽子結(jié)構(gòu) 即在5端加上一個(gè)7-甲基鳥苷；且原 第一個(gè)核苷酸C 也是甲基化，這種mGpppGm即為帽子結(jié)構(gòu)，其形成過程如下： 2.3端多聚腺苷酸尾 在mRNA3端有一段多聚腺苷酸節(jié)段，是在轉(zhuǎn)錄后切掉一段多余的RNA后逐個(gè)添加上去的，這個(gè)多聚尾可能與mRNA從核內(nèi)向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位及mRNA的穩(wěn)定性有關(guān)。 3.生物體內(nèi)mRNA種類多，含量少，代謝活躍，在各種RNA分子中，mRNA半衰期最短，這是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成 度的調(diào)控點(diǎn)之一。 (二)核蛋白體RNA(rRNA)的結(jié)構(gòu)與功能 rRNA是細(xì)胞內(nèi)含量最多

40、的RNA，與核糖體蛋白共同構(gòu)成核糖體 蛋白質(zhì)的合成部位，參與蛋白質(zhì)的合成。核蛋白體由大亞基和小亞基組成。 1.原核生物：小亞基由16SrRNA和20多種蛋白質(zhì)組成。 大亞基由5S、23SrRNA與30余種蛋白質(zhì)組成。 2.真核生物：小亞基由18SrRNA與30余種蛋白質(zhì)組成。 大亞基由5S、5.8S、28SrRNA和近50種蛋白質(zhì)構(gòu)成。 (三)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)的結(jié)構(gòu)與功能 1.tRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu) tRNA是細(xì)胞內(nèi)分子量最小的一類核酸，含有大量稀有堿基：如甲基化的嘌呤、雙氫尿嘧啶、次黃嘌呤和假尿嘧啶核苷。假尿嘧啶核苷與一般的嘧啶核苷區(qū)別在于以雜環(huán)上C-5而非N-1與糖環(huán)C-1連成糖苷鍵。t

41、RNA的作用是攜帶相應(yīng)的氨基酸將其轉(zhuǎn)運(yùn)到核蛋白體上以供蛋白質(zhì)合成。 2.tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu) 呈三葉草樣二級(jí)結(jié)構(gòu)：一些能局部互補(bǔ)配對(duì)的區(qū)域形成局部對(duì)鏈，不能配對(duì)的部分膨出成環(huán) 狀。此結(jié)構(gòu)從5末端起第一個(gè)環(huán)為二氫尿嘧啶環(huán) （T），第二個(gè)環(huán)為反密碼子環(huán)，因其環(huán)中部的三個(gè)堿基可與mRNA中三聯(lián)體密碼子形成堿基互補(bǔ)配對(duì)，在蛋白質(zhì)合成過程中解讀密碼子，把正確的氨基酸引入合成位點(diǎn)。第三個(gè)環(huán)為假尿嘧啶環(huán) （DHU），所有tRNA3末端為CCA-OH結(jié)構(gòu)，與氨基酸在此縮合成氨基酰-tRNA，起到轉(zhuǎn)運(yùn)氨基的作用。 3.tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu) tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)呈倒L形，T與DHU在二級(jí)結(jié)構(gòu)上各處一方，但在三級(jí)結(jié)構(gòu)上卻

42、相距很近，維系tRNA三級(jí)結(jié)構(gòu)主要是依賴核苷酸之間形成的各種氫鍵。 （四）其他類型的RNA 如小核RNA （snRNA）參與hnRNA的加工。還有一類RNA分子本身具有自我催化功能，可完成rRNA的剪接。這種具有催化作用的RNA被稱為核酶。要與核酸酶區(qū)別，后者是指可水解核酸的酶，故按照底物不同可分為DNA酶和RNA酶。 四、核酸的理化性質(zhì)及其應(yīng)用 （一）核酸的一般理化性質(zhì) 核酸為多元酸，具有較強(qiáng)的酸性。DNA是線性高分子，粘度極大，在機(jī)械力作用下 斷裂，因此提取DNA過程中應(yīng)注意不能過度用力，比如劇烈震蕩吹打等。由于核酸所含 的嘌呤和嘧啶分子中都有共軛雙鍵，使核酸分子在紫外260nm波長處有最

43、大吸收峰，這個(gè) 性質(zhì)可用于核酸的定量測(cè)定。這要與pr在280mm 波長處有最大的吸收峰相區(qū)別，又因?yàn)?分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)核酸提取過程中，蛋白質(zhì)是最常見的雜質(zhì)，故常用UD260/UD280 檢測(cè)提取的核酸純度如何。 （二) DNA的變性、復(fù)性和雜交 1.變性，這是DNA最重要的一個(gè)性質(zhì)。 DNA雙鏈之間以氫鍵連接，氫鍵是一種次級(jí)鍵，能量較低， 受破壞，在某些理化因素 作用下，DNA分子互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)松散，變成單鏈，即為DNA變性。DNA變性只涉及二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，不伴隨一級(jí)共價(jià)鍵的斷裂。監(jiān)測(cè)DNA是否變性的一個(gè)最常用的指標(biāo)是DNA在紫外區(qū)260nm波長處的吸收光值變化。因?yàn)?/p>

44、DNA變性時(shí)，DNA雙鏈發(fā)生解離，共軛雙鍵更充分暴露，故DNA變性，DNA在260nm處的吸收光度值增加，并與解鏈程度有一定的比例關(guān)系，這種關(guān)系叫做DNA的增色效應(yīng)。DNA的變性從開始到解鏈完全，是在一個(gè)相當(dāng)窄的溫度內(nèi)完成的，在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值增加達(dá)到最大增加值的50時(shí)的溫度叫做DNA的解鏈溫度 （Tm）。一種DNA分子的Tm值的大小與其所含堿基中的 GC的比例相關(guān)也與DNA分子大小及變性條件有關(guān)，G+C的比例越高， DNA分子越長，溶液離子強(qiáng)度越高，Tm值越大。加熱、低鹽及強(qiáng)酸、強(qiáng)堿均可使DNA變性。 2.復(fù)性 變性DNA在適當(dāng)條件下，兩條互補(bǔ)鏈可重新恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這種現(xiàn)象稱

45、為復(fù)性。 熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程也叫退火，一般認(rèn)為，比Tm值低25的 溫度是DNA復(fù)性的最佳條件。 3.DNA復(fù)性的實(shí)際應(yīng)用 雜交：通過變性DNA的復(fù)性性質(zhì)，我們可知道，DNA單鏈之間、RNA單鏈之間、一條DNA和一條RNA鏈之間只要存在序列互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域，不管是整條鏈互補(bǔ)，還是部分序列互補(bǔ)，即可重新形成整條雙鏈或部分雙鏈，這即為核酸分子雜交，這在分子生物學(xué)研究中有極大的應(yīng)用，比如：可用于在基因組中對(duì)特異基因的定位及檢測(cè)，PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因等，很多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)應(yīng)用的都是核酸分子雜交的原理，如Southern Blot, Northern Blot,包括PCR技術(shù)等

46、。 五、核酸酶 指水解核酸的酶，根據(jù)底物不同分DNA酶、RNA酶，根據(jù)作用位點(diǎn)不同分核酶外切酶和核 酸內(nèi)切酶，其中限制性核酸內(nèi)切酶在分子生物學(xué)技術(shù)中的應(yīng)用尤為重要。 1.1.3 酶 考點(diǎn)： 酶的定義、分子結(jié)構(gòu)與功能； 酶促反應(yīng)的特點(diǎn)與機(jī)制； 酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，即研究各種因素對(duì)酶促反應(yīng) 度的影響； 酶活性的測(cè)定； 酶活性及含量的調(diào)節(jié)； 同工酶變構(gòu)酶的定義； 輔酶與維生素。 重點(diǎn)： 酶的活性中心的組成，因?yàn)檫@是理解酶作用機(jī)制的基礎(chǔ)；酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，尤其是米氏方程、Km含義，雙倒數(shù)曲線及各類抑制劑對(duì)Km、Vmax的影響；對(duì)同工酶、變構(gòu)酶的理解。 基本理論與知識(shí)： 一、酶的概念 酶通常的定義是指由活細(xì)胞

47、合成的對(duì)其特異底物起高效催化作用的蛋白質(zhì)，是機(jī)體內(nèi)催化各 種代謝反應(yīng)最主要的催化劑，但現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)存在核酶，其本質(zhì)為RNA而非蛋白質(zhì)，主要參與RNA的剪接。 根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分單體酶、寡聚酶、多酶體系和多功能酶。 二、酶的分子組成 根據(jù)分子組成，酶分為單純酶和結(jié)合酶 單純酶：僅由氨基酸組成。 結(jié)合酶：包括兩部分 蛋白質(zhì)部分，稱酶蛋白，決定反應(yīng)的特異性。 非蛋白質(zhì)部分，多為小分子有機(jī)化合物或金屬離子，決定反應(yīng)的種類與性質(zhì)。 輔助因子又分兩種： 輔基：與酶蛋白結(jié)合緊密，不能通過透析超濾方法除去，反應(yīng)中不離開酶蛋白。 輔酶：與酶蛋白結(jié)合疏松，可用透析、超濾方法去除，反應(yīng)中可離開酶蛋白，將攜帶的質(zhì)子或

48、基團(tuán)轉(zhuǎn)移出去。 金屬離子多為酶的輔基，可分為金屬酶、金屬激活酶，小分子有機(jī)化合物有的屬于輔酶，有的屬于輔基。結(jié)合酶兩部分結(jié)合在一起形成的復(fù)合物稱全酶，只有全酶才有催化作用。 三、酶的活性中心 酶分子中與酶的活性密切相關(guān)的化學(xué)基團(tuán)叫做酶的必 基團(tuán)。這些必 基團(tuán)在一級(jí)結(jié)構(gòu)上可能相距很遠(yuǎn)，但在空間結(jié)構(gòu)上彼此靠近，組成具有特定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域，能與底物特異地結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物，這一區(qū)域叫做酶的活性中心，對(duì)結(jié)合酶 說，輔基或輔酶參與酶活性中心的組成。 酶是一類催化劑，具有一般催化劑的特點(diǎn)，但酶是蛋白質(zhì)，又具有其自身的特點(diǎn)： 1.酶促反應(yīng)具有極高的效率，酶能比一般催化劑更有效地降低反應(yīng)的活化能，使底物只

49、 較少的能量便能進(jìn)人活化狀態(tài)。 2.酶促反應(yīng)具有高度特異性，一種酶只作用于一種或一類化合物或一定的化學(xué)鍵，進(jìn)行一種類型的反應(yīng)，得到一定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物，這種現(xiàn)象稱為酶的特異性。分絕對(duì)特異性，相對(duì)特異性和立體異構(gòu)特異性。 3.酶促反應(yīng)的可調(diào)節(jié)性：酶促反應(yīng)受多種因素的調(diào)控，以適應(yīng)機(jī)體不斷變化的內(nèi)外環(huán)境和生命活動(dòng)的要。 五、酶促反應(yīng)的機(jī)制 （一）酶-底物復(fù)合物的形成和誘導(dǎo)契合假說：酶分子構(gòu)象與作用物結(jié)構(gòu)并不一定完全吻合，當(dāng)兩者接近時(shí)其結(jié)構(gòu)相互誘導(dǎo)、相互變形和相互適應(yīng)，進(jìn)而相互緊密結(jié)合，即可更利于 反應(yīng)的進(jìn)行。底物在酶的誘導(dǎo)下發(fā)生變形，處于不穩(wěn)定狀態(tài)， 于受酶的攻擊，底物這種不穩(wěn)定狀態(tài)叫做過渡態(tài)。 （二）鄰

50、近效應(yīng)與定向排列 酶在反應(yīng)中將諸底物結(jié)合到酶的活性中心，使它們相互接近并形成有利于反應(yīng)的正確定向關(guān)系。實(shí)際上是將分子間的反應(yīng)變成類似于分子內(nèi)的反應(yīng)，大大提高反應(yīng)效率。 （三）多元催化 多元催化指酶同時(shí)具有酸和堿的特性。因?yàn)槊阜肿又泻胁煌δ芑鶊F(tuán)，它們pK值不同，解離度不同，故可起酸的催化作用，也可起堿的催化作用，這種多功能基團(tuán)的協(xié)同作用可極大地提高酶的催化作用。 (四）表面效應(yīng) 酶的活性中心內(nèi)多為疏水環(huán)境，底物與酶反應(yīng)常在酶分子的內(nèi)部疏水環(huán)境中進(jìn)行，疏水環(huán)境排斥了介于底物與酶分子之間的水膜，也消除了水分子對(duì)酶和底物功能基團(tuán)的干擾，有利于底物與酶分子間的直接接觸。 總之，一種酶的催化反應(yīng)常常是

51、多種催化機(jī)制的綜合作用，這是酶促反應(yīng)提高效率的原因。 六、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究的是酶促反應(yīng) 度及其影響因素，這些因素包括酶濃度、底物濃度、 pH、溫度、抑制劑、激活物等。 注意酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)中的反應(yīng) 度一般指反應(yīng)剛開始的 度，即初 度。 (一)底物濃度對(duì)反應(yīng) 度的影響 1.在其他因素不變情況下，底物濃度的變化對(duì)反應(yīng) 度(統(tǒng)一用初 度來比較)的影響的作圖 呈矩形雙曲線。在底物濃度較低時(shí)，V隨 S的增加而急劇上升，兩者呈正比關(guān)系，因?yàn)?此時(shí)尚有大量游離酶分子可被利用。隨著底物濃度的增加，反應(yīng) 度不再呈正比加 ，因?yàn)?此時(shí)酶已大部分與底物結(jié)合，所含游離酶不多，故隨底物濃度的增加，可再利

52、用的酶量有 限，故反應(yīng) 度增加的幅度下降。若繼續(xù)增加底物濃度，反應(yīng) 度不再上升，此時(shí)酶的活性 中心已被底物飽和。為解釋酶促反應(yīng) S與V的關(guān)系，提出了著名的米氏方程式，即：V=Vmax SKm+ S當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí)，KmS，分母S可不計(jì)，此時(shí)V=Vmax SKm，Vmax、Km對(duì)同一底物、同一酶、相同反應(yīng)環(huán)境 說是一常數(shù)，故反應(yīng) 度與底物濃度成正比。當(dāng)?shù)孜餄舛群芨邥r(shí)，KmS，Km可不計(jì)，V=Vmax，反應(yīng)速度達(dá)最大速度，再增加S，也不影響反應(yīng)速度。故從米氏方程中，即可看出底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響。 2.Km的含義： Km是酶的特征常數(shù)，它只與酶的結(jié)構(gòu)、酶所催化的底物和反應(yīng)環(huán)境有關(guān)，與酶濃度無關(guān)。

53、對(duì)于同一底物，不同的兩酶有不同的Km值，對(duì)于同一酶，不同底物也有不同的Km值。由米氏方程，當(dāng)V=12Vmax時(shí)，可得Km=S，由此可見，Km值表示酶促反應(yīng)度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。 1/Km可近似表示酶對(duì)底物親和力的大小，1/m越大表示二者親和力越大，表示不 要 很高的底物濃度，便可得到最大反應(yīng) 度，要注意的是只有在中間產(chǎn)物解離成反應(yīng)物的 度 大大超過其分解成產(chǎn)物 度時(shí)才適用。 3.要求Km、Vmax，根據(jù)底物濃度對(duì) 度的矩形曲線求有很大難度，故將米氏方程要采取 適當(dāng)變換，作出直線圖，方可更容 準(zhǔn)確地求出Km、Vmax值，雙倒數(shù)作圖法是最常用的 方法。將米氏方程取倒數(shù)：1 V=KmVm

54、ax1 S+1 Vmax （二）酶濃度對(duì)反應(yīng) 度的影響。 在酶促反應(yīng)系統(tǒng)中，當(dāng)?shù)孜餄舛却蟠蟪^酶的濃度，使酶被底物飽和時(shí)，反應(yīng) 度與酶的濃度變化成正比。很顯然若底物濃度很小，酶的濃度本 就很大，再增加酶濃度，對(duì)促進(jìn)反應(yīng)沒什么意義。所以我們研究酶濃度對(duì)反應(yīng) 度的影響，一般不考慮這種情況。 （三）溫度對(duì)反應(yīng) 度的影響 酶是蛋白質(zhì)，溫度對(duì)酶促反應(yīng) 度具有雙重影響，溫度升高一方面可加快反應(yīng) 度，同時(shí)也增加酶的變性。故當(dāng)溫度升高到一定程度時(shí)，酶開始變性，反應(yīng) 度也開始下降低。溫度一般會(huì)使酶活性破壞，故生化實(shí)驗(yàn)中，要保持酶活性，常采用低溫貯存，一些菌種也須低溫保存。酶促反應(yīng) 度最快時(shí)的環(huán)境溫度稱為酶促反應(yīng)

55、的最適溫度。 （四）pH對(duì)反應(yīng) 度的影響 酶活性受其反應(yīng)環(huán)境的pH影響因?yàn)槊富钚灾行哪承┗鶊F(tuán)必須在某一解離狀態(tài)，酶才會(huì)發(fā)揮最大催化活性，此外，底物也一樣，在某一解離狀態(tài)，才會(huì)與酶有最大親和力，故 一定 pH值，且不同的酶對(duì)pH有不同要求。酶活性最大時(shí)的pH為酶的最適pH值。 （五）抑制劑對(duì)反應(yīng) 度的影響 能減弱或停止酶作用的物質(zhì)稱為酶的抑制劑。要注意的是必須不引起酶蛋白變性才可，某種物質(zhì)使酶發(fā)生變性失活不屬于抑制劑范疇。若抑制劑與酶結(jié)合牢固不能用簡單的透析或超濾法去除，此類抑制劑為不可逆抑制劑；若用簡單的透析和超濾法去除抑制劑，酶又重新表現(xiàn)原有活性的抑制劑稱為可逆性抑制。 1.不可逆抑制作用

56、此類抑制劑通常以共價(jià)健與酶的活性中心上的必 基團(tuán)相結(jié)合，使酶失活，根據(jù)抑制劑與酶結(jié)合的專一性，可分為專一性抑制劑和非專一性抑制劑。 2.可逆抑制作用 此類抑制劑通常以非共價(jià)鍵與酶或酶 底物復(fù)合物可逆性結(jié)合，使酶活性降低或消失?？赡嫘砸种谱饔玫念愋涂煞譃橐韵氯N： （1）競爭性抑制作用：競爭性抑制是在酶作用體系中有與酶的底物結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)存在，能與底物競爭與酶活性中心的結(jié)合，使有活性的酶數(shù)量減少。如磺胺類藥物通過競爭性抑制二氫葉酸還原酶，干擾核酸合成，從而影響細(xì)菌生長繁殖，發(fā)揮其抑菌作用。只要S足夠高，Vmax仍可達(dá)到，但此時(shí) 較高的S。故競爭性抑制使Km增加，Vmax不變。 （2）非競爭性抑制作用