單克隆抗體和抗體工程

1、第四章第四章 單克隆抗體和單克隆抗體和 抗體工程抗體工程 第四章第四章 抗體制藥抗體制藥 第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 第二節(jié)第二節(jié) 單克隆抗體單克隆抗體 第三節(jié)第三節(jié) 鼠源性單克隆抗體的改造鼠源性單克隆抗體的改造 第四節(jié)第四節(jié) 基因工程抗體和抗體工程基因工程抗體和抗體工程 第五節(jié)第五節(jié) 抗體診斷試劑抗體診斷試劑 第六節(jié)第六節(jié) 抗體治療藥物抗體治療藥物 第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 一、單克隆抗體一、單克隆抗體 u1890年：年：Behring和北里柴三郎等發(fā)現(xiàn)了和北里柴三郎等發(fā)現(xiàn)了 白喉抗毒素，并建立了血清療法，開(kāi)抗體白喉抗毒素，并建立了血清療法，開(kāi)抗體 制藥之先河。制藥之先河。 u1937年：年：Ti

2、selius等人用電泳法將血清蛋等人用電泳法將血清蛋 白分為白蛋白、甲種（白分為白蛋白、甲種（ ）球蛋白、乙種）球蛋白、乙種 （ ）球蛋白和丙種（）球蛋白和丙種（ ）球蛋白，并證）球蛋白，并證 明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。 u20世紀(jì)世紀(jì)60年代初期：抗原決定簇，精制單年代初期：抗原決定簇，精制單 價(jià)血清。價(jià)血清。 u1975年：年：Khler和和Milstein等，單克隆等，單克隆 抗體，其具有高度特異性、均一性，以抗體，其具有高度特異性、均一性，以 及來(lái)源穩(wěn)定可大量生產(chǎn)等特點(diǎn)。及來(lái)源穩(wěn)定可大量生產(chǎn)等特點(diǎn)。 u1984年：人年：人-鼠嵌合抗體鼠嵌合

3、抗體 u1984年至今：?jiǎn)慰寺】贵w的鼠源性及年至今：?jiǎn)慰寺】贵w的鼠源性及 分子過(guò)大的問(wèn)題得以解決，可僅作為與分子過(guò)大的問(wèn)題得以解決，可僅作為與 抗原特異性結(jié)合試劑?？乖禺愋越Y(jié)合試劑。 單克隆抗體的應(yīng)用單克隆抗體的應(yīng)用 n用于疾病的診斷和治療：用于疾病的診斷和治療： 利用單克隆抗體檢測(cè)與某些疾病相關(guān)的抗原，利用單克隆抗體檢測(cè)與某些疾病相關(guān)的抗原， 輔助臨床診斷，輔助臨床診斷， 用放射性核素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行腫瘤顯像，用放射性核素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行腫瘤顯像， 進(jìn)行免疫鑒定。進(jìn)行免疫鑒定。 用于臨床治療用于臨床治療-如針對(duì)如針對(duì)T T淋巴細(xì)胞共有的分化淋巴細(xì)胞共有的分化 抗原抗原CD3CD3的單克

4、隆抗體，用作免疫抑制劑。的單克隆抗體，用作免疫抑制劑。 n單克隆抗體還可作為載體藥物可對(duì)腫瘤進(jìn)行定單克隆抗體還可作為載體藥物可對(duì)腫瘤進(jìn)行定 向治療。向治療。 u免疫導(dǎo)向療法成功障礙：免疫導(dǎo)向療法成功障礙： （1 1）鼠源性單克隆抗體的免疫原性；）鼠源性單克隆抗體的免疫原性； （2 2）完整的抗體分子分子量過(guò)大，難以）完整的抗體分子分子量過(guò)大，難以 穿透實(shí)體腫瘤組織，達(dá)不到有效的治療穿透實(shí)體腫瘤組織，達(dá)不到有效的治療 濃度。濃度。 基因工程技術(shù)基因工程技術(shù) n制備出改形抗體、單鏈抗體、單域抗體、最制備出改形抗體、單鏈抗體、單域抗體、最 小識(shí)別單位等很多類(lèi)型的抗體或抗體單位。小識(shí)別單位等很多類(lèi)型的

5、抗體或抗體單位。 基本消除了單克隆抗體的鼠源性，基本消除了單克隆抗體的鼠源性， n相對(duì)分子質(zhì)量只有完整抗體分子的相對(duì)分子質(zhì)量只有完整抗體分子的1/801/801/31/3， n鼠源性單克隆抗體的生物學(xué)活性如激活補(bǔ)體、鼠源性單克隆抗體的生物學(xué)活性如激活補(bǔ)體、 促進(jìn)吞噬功能（免疫調(diào)理）、抗體依賴(lài)細(xì)胞促進(jìn)吞噬功能（免疫調(diào)理）、抗體依賴(lài)細(xì)胞 介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用等，只保留同抗原特異性介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用等，只保留同抗原特異性 結(jié)合的活性。結(jié)合的活性。 n 抗體（抗體（antibody）：由）：由B細(xì)胞產(chǎn)生的免疫蛋細(xì)胞產(chǎn)生的免疫蛋 白，它能識(shí)別抗原的某一特定位點(diǎn)?？贵w分白，它能識(shí)別抗原的某一特定位點(diǎn)?？贵w分 子

6、由兩個(gè)完全相同的重鏈分子以及兩個(gè)完全子由兩個(gè)完全相同的重鏈分子以及兩個(gè)完全 相同的輕鏈組成。相同的輕鏈組成。 n B細(xì)胞（細(xì)胞（B cell）：由骨髓細(xì)胞分化而來(lái)的能）：由骨髓細(xì)胞分化而來(lái)的能 產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞。產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞。 n 單克隆抗體單克隆抗體:是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞 融合，通過(guò)有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)融合，通過(guò)有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì) 胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而生產(chǎn)的。胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而生產(chǎn)的。 第二節(jié)第二節(jié) 單克隆抗體及其制備單克隆抗體及其制備 一、抗體的結(jié)構(gòu)與功能一、抗體的結(jié)構(gòu)與功能 n Light and heavy C

7、hain， n 可變區(qū)（可變區(qū)（variable region），簡(jiǎn)稱(chēng)），簡(jiǎn)稱(chēng)V區(qū)，區(qū)， n 3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)個(gè)互補(bǔ)決定區(qū) （complementaruty- determining region,CDR） n 重鏈分子上有重鏈分子上有3個(gè)恒定區(qū)個(gè)恒定區(qū) constant region, C區(qū)區(qū) （CH1,CH2和和CH3）, n 輕鏈上有一個(gè)恒定區(qū)輕鏈上有一個(gè)恒定區(qū) （CL）。）。 重鏈重鏈 輕鏈輕鏈 n用木瓜蛋白酶處理，將抗體分解成用木瓜蛋白酶處理，將抗體分解成3個(gè)部分個(gè)部分 (2個(gè)個(gè)Fab片段和片段和1個(gè)個(gè) Fc片段片段)； nFab：一條完整的輕鏈和重鏈的可變區(qū)，輕鏈：一條完整的輕鏈和重

8、鏈的可變區(qū)，輕鏈 和重鏈恒定區(qū)。和重鏈恒定區(qū)。CL和和CH1之間以二硫鍵連接；之間以二硫鍵連接； n保存有抗原結(jié)合活性和特異性。保留保存有抗原結(jié)合活性和特異性。保留VH和和VL 即可完全獲得原抗體的抗原結(jié)合活性，即可完全獲得原抗體的抗原結(jié)合活性，F(xiàn)v nFc：兩條重鏈的：兩條重鏈的CH2和和CH3區(qū)域，二硫鍵連區(qū)域，二硫鍵連 接，沒(méi)有抗原接合活性，但是抗體結(jié)合上抗接，沒(méi)有抗原接合活性，但是抗體結(jié)合上抗 原后激活免疫反應(yīng)的主要部位。原后激活免疫反應(yīng)的主要部位。 n 接受抗原刺激后，能接受抗原刺激后，能分泌分泌針對(duì)該抗原的針對(duì)該抗原的 特異性抗體特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。，在體液免疫中

9、具有重要功能。 n B淋巴細(xì)胞本身是一種淋巴細(xì)胞本身是一種終末分化細(xì)胞終末分化細(xì)胞， 通常不再進(jìn)行細(xì)胞分裂，存活一段時(shí)間后通常不再進(jìn)行細(xì)胞分裂，存活一段時(shí)間后 便會(huì)死亡便會(huì)死亡短命細(xì)胞短命細(xì)胞 一、雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的一、雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的3個(gè)技術(shù)關(guān)鍵個(gè)技術(shù)關(guān)鍵 1. B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的特性：淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的特性： B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 (B lymphocytes)： 二、雜交瘤細(xì)胞系的生產(chǎn)二、雜交瘤細(xì)胞系的生產(chǎn) 骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞 (myeloma cells): n 惡性增殖的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，只要營(yíng)養(yǎng)條件適惡性增殖的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，只要營(yíng)養(yǎng)條件適 合可永遠(yuǎn)分裂和存活合可永遠(yuǎn)分裂和存活長(zhǎng)命細(xì)胞長(zhǎng)

10、命細(xì)胞。 n 經(jīng)篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細(xì)經(jīng)篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細(xì) 胞株胞株沒(méi)有抗體分泌物沒(méi)有抗體分泌物。 2. 細(xì)胞融合技術(shù)：細(xì)胞融合技術(shù)： 脾細(xì)胞脾細(xì)胞 (B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞) 骨髓瘤細(xì)骨髓瘤細(xì) 胞胞 雜交瘤細(xì)雜交瘤細(xì) 胞胞 長(zhǎng)命不分泌抗體長(zhǎng)命不分泌抗體 分泌抗體短命分泌抗體短命 分泌抗體長(zhǎng)命分泌抗體長(zhǎng)命 (Khler和和Milstein, Jerne) 1984年年Nobel生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 3.雜交瘤細(xì)胞的篩選雜交瘤細(xì)胞的篩選 脾細(xì)胞 (B淋巴細(xì)胞) 骨髓瘤細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞脾細(xì)胞/脾細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞/ 骨髓瘤細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞脾細(xì)胞 篩選出 不能長(zhǎng)期存活不能長(zhǎng)

11、期存活 次黃嘌呤鳥(niǎo) 嘌呤磷酸核苷 轉(zhuǎn)移酶缺陷型 HAT培養(yǎng)基篩選原理培養(yǎng)基篩選原理(1)(1) n細(xì)胞融合的選擇培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：細(xì)胞融合的選擇培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分： 氨甲蝶呤氨甲蝶呤(Aminopterin，A):可阻斷正常的可阻斷正常的 DNA合成（嘌呤及合成（嘌呤及TMP合成受抑制）合成受抑制） 次黃嘌呤次黃嘌呤(Hypoxanthine，H):是是HGPRT的底的底 物物,為為DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原合成提供原料（核苷酸旁路合成原 料）；料）； 胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷(Thymidine，T):胸苷激酶胸苷激酶(TK) 的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，為的作用下生成胸

12、腺嘧啶核苷酸，為DNA合成合成 提供原料。提供原料。 核苷酸合成途徑核苷酸合成途徑-生物合成途徑（生物合成途徑（D D途徑途徑 - -主要途徑）主要途徑） n主途徑：主途徑：由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合 成成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成 過(guò)程。過(guò)程。 n葉酸葉酸作為重要的作為重要的輔酶輔酶參與這一過(guò)程。參與這一過(guò)程。 nHAT培養(yǎng)液中培養(yǎng)液中氨基喋呤氨基喋呤是一種葉酸的拮抗物，是一種葉酸的拮抗物， 可以阻斷可以阻斷DNA合成的合成的“D途徑途徑”。 n輔助途徑：輔助途徑：是在是在次黃嘌呤次黃嘌呤和和胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核

13、苷 存在的情況下，經(jīng)存在的情況下，經(jīng)次黃嘌呤次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化磷酸核糖轉(zhuǎn)化 酶酶（HGPRT）和）和胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶（TK） 的催化作用合成的催化作用合成DNA，兩種酶缺一不可兩種酶缺一不可。 核苷酸合成途徑核苷酸合成途徑-生物合成途徑（旁生物合成途徑（旁 途徑途徑-S-S途徑途徑 ） 篩選：篩選：HAT培養(yǎng)基篩選原理培養(yǎng)基篩選原理 內(nèi)源性途徑內(nèi)源性途徑(D-主要途徑主要途徑 谷氨酰胺谷氨酰胺 or 單磷酸尿苷酸單磷酸尿苷酸 外源性途徑外源性途徑(旁路途徑旁路途徑) (Hypoxanthine Guznine Phosphoribosyl Transferase) 次嘌呤次嘌

14、呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 ( HGPRT ) 胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶 (Thymidine kinase, TK) B淋巴細(xì)胞：淋巴細(xì)胞： HGPRT+， TK+ 骨髓瘤細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞： HGPRT-， TK- 存活存活 死亡死亡 外源性途徑外源性途徑(S-旁路途徑旁路途徑) 1、未融合的效應(yīng)、未融合的效應(yīng)B細(xì)胞和兩個(gè)效應(yīng)細(xì)胞和兩個(gè)效應(yīng)B細(xì)胞融合細(xì)胞融合 nB淋巴細(xì)胞：淋巴細(xì)胞： HGPRT+， TK+ n在在HAT培養(yǎng)液中，未融合的效應(yīng)培養(yǎng)液中，未融合的效應(yīng)B細(xì)胞和兩細(xì)胞和兩 個(gè)效應(yīng)個(gè)效應(yīng)B細(xì)胞融合的細(xì)胞融合的“D途徑途徑”被氨基喋呤被氨基喋呤 阻斷阻斷 n雖雖“S途徑

15、途徑”正常，但因缺乏在體外培養(yǎng)液正常，但因缺乏在體外培養(yǎng)液 中增殖的能力，一般中增殖的能力，一般10d左右會(huì)死亡。左右會(huì)死亡。 n骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞HGPRTHGPRT ， ， TKTK n在在HAT培養(yǎng)液中，因此自身沒(méi)有培養(yǎng)液中，因此自身沒(méi)有“S途徑途徑” n“D途徑途徑”又被氨基喋呤阻斷，所以在又被氨基喋呤阻斷，所以在 HAT培養(yǎng)液中也不能增殖而很快死亡。培養(yǎng)液中也不能增殖而很快死亡。 2 2、骨髓瘤細(xì)胞以及自身融合細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞以及自身融合細(xì)胞 n骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞HGPRT-，TK- n既具有效應(yīng)既具有效應(yīng)B細(xì)胞的細(xì)胞的“S途徑途徑”，又具有骨，又具有骨 髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)液中長(zhǎng)

16、期增殖的特性。髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)液中長(zhǎng)期增殖的特性。 n在在HAT培養(yǎng)液中，選擇性存活下來(lái)，并不培養(yǎng)液中，選擇性存活下來(lái)，并不 斷增殖。斷增殖。 3 3、雜交瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞 漿細(xì)胞自 發(fā)或誘發(fā) 突變 脾B細(xì)胞用 SRBC免疫(注 射X蛋白) 不能在HAT培養(yǎng)基上 生長(zhǎng)的骨髓細(xì)胞 ( 帶有X蛋白的抗體) 細(xì)胞融合 轉(zhuǎn)到HAT培養(yǎng)基 上 非融合細(xì)胞死亡 雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng) 在多孔塑料板孔內(nèi)培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞 (HAT培養(yǎng)液) 培養(yǎng)2周 雜交瘤細(xì)胞可繼續(xù)繁殖 優(yōu)良雜交瘤細(xì)胞 檢測(cè)單克隆抗體 接種動(dòng)物,大量 生產(chǎn)單克隆抗 體 細(xì)胞大量培養(yǎng) 罐大量生產(chǎn)克 隆抗體 冷凍保藏 淘汰不合格的細(xì)胞 親代死亡 三、篩選

17、陽(yáng)性克隆與克隆化三、篩選陽(yáng)性克隆與克隆化 （1 1）篩選陽(yáng)性克隆：）篩選陽(yáng)性克?。?n產(chǎn)生特定抗原的抗體產(chǎn)生細(xì)胞只占所有脾產(chǎn)生特定抗原的抗體產(chǎn)生細(xì)胞只占所有脾 細(xì)胞的細(xì)胞的5%5%左右。左右。 n篩選技術(shù)：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)和篩選技術(shù)：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)和 放射免疫技術(shù)。放射免疫技術(shù)。 n免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù)均適用于免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù)均適用于可溶可溶 性抗原及顆粒性抗原的抗體檢測(cè)性抗原及顆粒性抗原的抗體檢測(cè)。 n免疫熒光技術(shù)適用于細(xì)胞抗原的抗體檢測(cè)。免疫熒光技術(shù)適用于細(xì)胞抗原的抗體檢測(cè)。 1、精制破傷風(fēng)毒素抗原（、精制破傷風(fēng)毒素抗原（ ）吸附）吸附 （約（約10 g/ml

18、，4，3h） 洗滌洗滌 2、加雜交瘤培養(yǎng)上清液（、加雜交瘤培養(yǎng)上清液（ ） （4，1h） 3、加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊、加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊 抗鼠抗體（抗鼠抗體（ ） （4，1h） 洗滌洗滌 洗滌洗滌 4、加酶作用底物，呈色孔為陽(yáng)、加酶作用底物，呈色孔為陽(yáng) 性克隆孔性克隆孔 ELISA用于破傷風(fēng)抗體的篩選用于破傷風(fēng)抗體的篩選 雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞 培養(yǎng)細(xì)胞向培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞向培養(yǎng) 基中分泌抗體基中分泌抗體 收集培養(yǎng)基收集培養(yǎng)基 預(yù)先包埋好目預(yù)先包埋好目 標(biāo)抗原的培養(yǎng)標(biāo)抗原的培養(yǎng) 板板 抗原與抗體的結(jié)合抗原與抗體的結(jié)合 E E E E E 加入二抗加入二抗 顯色說(shuō)明有抗體的顯色說(shuō)明有抗體的 存在

19、存在 在酶的情況下在酶的情況下,與二抗與二抗 結(jié)合的分子產(chǎn)生特殊的結(jié)合的分子產(chǎn)生特殊的 顏色顏色 (ELISA) （2）克隆化）克隆化有限稀釋法和軟瓊脂法有限稀釋法和軟瓊脂法 n篩選出來(lái)的陽(yáng)性克隆中，可能含有不分泌抗體篩選出來(lái)的陽(yáng)性克隆中，可能含有不分泌抗體 的細(xì)胞或有多株分泌抗體的細(xì)胞的細(xì)胞或有多株分泌抗體的細(xì)胞 ，而且剛剛?cè)?，而且剛剛?cè)?合獲得的雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定，染色體容易丟失合獲得的雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定，染色體容易丟失 ，因此應(yīng)盡早克隆化。，因此應(yīng)盡早克隆化。 n雜交瘤細(xì)胞要經(jīng)過(guò)大約雜交瘤細(xì)胞要經(jīng)過(guò)大約3次的克隆化，才能達(dá)次的克隆化，才能達(dá) 到到100%孔內(nèi)均為抗體陽(yáng)性細(xì)胞克隆?？變?nèi)均為抗體

20、陽(yáng)性細(xì)胞克隆。 n常用的克隆化方法有常用的克隆化方法有有限稀釋法有限稀釋法和和軟瓊脂法軟瓊脂法。 n有限稀釋法：是把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后，有限稀釋法：是把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后， 加入到加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每個(gè)孔中在理孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每個(gè)孔中在理 論上只含有一個(gè)細(xì)胞。論上只含有一個(gè)細(xì)胞。 n第一次克隆化時(shí)也要應(yīng)用第一次克隆化時(shí)也要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后的培養(yǎng)液，以后的 克隆化可用不含克隆化可用不含HT的的RPMI1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)液。 n單個(gè)細(xì)胞難以存活，克隆化時(shí)也需加入飼養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞難以存活，克隆化時(shí)也需加入飼養(yǎng) 細(xì)胞輔助其生長(zhǎng)。細(xì)胞輔助其生長(zhǎng)。 n軟瓊脂法：在培養(yǎng)液中加入軟瓊脂法：在

21、培養(yǎng)液中加入0.5%0.5%左右的瓊脂糖左右的瓊脂糖 凝膠，細(xì)胞分裂后形成小球樣團(tuán)塊。凝膠，細(xì)胞分裂后形成小球樣團(tuán)塊。 n培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用毛細(xì)吸管將小球吸培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用毛細(xì)吸管將小球吸 出，團(tuán)塊打碎后，移入出，團(tuán)塊打碎后，移入9696孔板中繼續(xù)培養(yǎng)?？装逯欣^續(xù)培養(yǎng)。 n這種方法可以吸出大量克隆細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，因這種方法可以吸出大量克隆細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，因 初代細(xì)胞很不易增殖，所以用軟瓊脂法進(jìn)行克初代細(xì)胞很不易增殖，所以用軟瓊脂法進(jìn)行克 隆化容易成功。隆化容易成功。 三、雜交瘤細(xì)胞的鑒定三、雜交瘤細(xì)胞的鑒定 1）染色體鑒定染色體鑒定:正常小鼠脾細(xì)胞的染色體數(shù)目為正常小鼠脾細(xì)胞的染色體

22、數(shù)目為 40,而小鼠骨髓瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目的變異較大而小鼠骨髓瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目的變異較大， 可以有可以有6268 條染色體。條染色體。 2）特性鑒定特性鑒定:對(duì)單克隆抗體的親和力的鑒定是最重對(duì)單克隆抗體的親和力的鑒定是最重 要的要的,一般采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定一般采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法。法。 3）類(lèi)別鑒定類(lèi)別鑒定:可以用相應(yīng)的抗血清及雙向免疫擴(kuò)散可以用相應(yīng)的抗血清及雙向免疫擴(kuò)散 法進(jìn)行鑒定法進(jìn)行鑒定 ; 4）單克隆抗體的純度鑒定單克隆抗體的純度鑒定:可以用有還原劑或者無(wú)可以用有還原劑或者無(wú) 還原劑條件下的還原劑條件下的 SDS- PAGE 電泳進(jìn)行鑒定。電泳進(jìn)行鑒定。 四、單克隆

23、抗體的大量制備四、單克隆抗體的大量制備 （1）體外培養(yǎng)法可獲得）體外培養(yǎng)法可獲得10 g/ml的抗體；的抗體； （2）動(dòng)物體內(nèi)誘生法，可獲得）動(dòng)物體內(nèi)誘生法，可獲得520mg/ml的抗體。的抗體。 -目前多采用此法生產(chǎn)制備單克隆抗體。目前多采用此法生產(chǎn)制備單克隆抗體。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： n操作簡(jiǎn)便、比較經(jīng)濟(jì)、所得抗體量多、操作簡(jiǎn)便、比較經(jīng)濟(jì)、所得抗體量多、所得單克所得單克 隆抗體量較多且效價(jià)亦高，隆抗體量較多且效價(jià)亦高， n還可有效地保存雜交瘤細(xì)胞株和分離已污染雜菌還可有效地保存雜交瘤細(xì)胞株和分離已污染雜菌 的雜交瘤細(xì)胞株，的雜交瘤細(xì)胞株， 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： n小鼠腹水中混有來(lái)自小鼠的多種雜蛋白，給純

24、化小鼠腹水中混有來(lái)自小鼠的多種雜蛋白，給純化 帶來(lái)難度。帶來(lái)難度。 n大量培養(yǎng)方法：大量培養(yǎng)方法： n利用懸浮培養(yǎng)方式利用懸浮培養(yǎng)方式可增加細(xì)胞生長(zhǎng)空間，雜可增加細(xì)胞生長(zhǎng)空間，雜 交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，單克隆抗體產(chǎn)量得到提交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，單克隆抗體產(chǎn)量得到提 高。高。 n連續(xù)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度連續(xù)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度可達(dá)可達(dá)2.0 107細(xì)胞細(xì)胞 /ml，收集的單克隆抗體可達(dá)到收集的單克隆抗體可達(dá)到400 g/ml左左 右。右。 n微載體懸浮培養(yǎng)法，增大單位體積的表面積，微載體懸浮培養(yǎng)法，增大單位體積的表面積， 利于雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞密度可達(dá)利于雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞密度可達(dá)108細(xì)胞細(xì)胞 /ml

25、。并能收獲更多的單抗。并能收獲更多的單抗。 五、單克隆抗體的純化五、單克隆抗體的純化 動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備單克隆抗體具體方法及過(guò)程動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備單克隆抗體具體方法及過(guò)程 1、澄清和沉淀處理、澄清和沉淀處理 n小鼠腹水中含有紅細(xì)胞、細(xì)胞碎塊、纖維蛋白小鼠腹水中含有紅細(xì)胞、細(xì)胞碎塊、纖維蛋白 凝塊及脂質(zhì)等，應(yīng)首先用離心力凝塊及脂質(zhì)等，應(yīng)首先用離心力1000g離心離心 5min，去除殘留的小顆粒物質(zhì)；去除殘留的小顆粒物質(zhì)； n再用再用0.2 m的微孔濾膜過(guò)濾，除掉污染的細(xì)菌、的微孔濾膜過(guò)濾，除掉污染的細(xì)菌、 支原體和脂質(zhì)；用飽和硫酸銨沉淀抗體，支原體和脂質(zhì)；用飽和硫酸銨沉淀抗體，50% 飽和硫酸銨

26、能回收飽和硫酸銨能回收90%以上的單克隆抗體。以上的單克隆抗體。 2、分離、分離 主要分離方法有凝膠過(guò)濾、陰離子交換層析、親主要分離方法有凝膠過(guò)濾、陰離子交換層析、親 和層析等。和層析等。 2、分離、分離 （1）凝膠過(guò)濾）凝膠過(guò)濾 （2）陰離子交換）陰離子交換 （3）親和層析）親和層析 第三節(jié)第三節(jié) 基因工程抗體及其制備基因工程抗體及其制備 (Genetic engineering antibody) 基因工程抗體：基因工程抗體：根據(jù)研究者的意圖，采用基根據(jù)研究者的意圖，采用基 因工程方法，在基因水平，對(duì)免疫球蛋白基因工程方法，在基因水平，對(duì)免疫球蛋白基 因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)

27、因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn) 行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。 主要包括：嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗主要包括：嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗 體、雙價(jià)抗體和雙特異性抗體。體、雙價(jià)抗體和雙特異性抗體。 一、一、單單克隆克隆抗抗體靶向制劑體靶向制劑 纖溶酶原纖溶酶原 纖溶酶原激活纖溶酶原激活 劑劑(tPA) 纖溶酶纖溶酶 血纖維蛋白原血纖維蛋白原 血纖維血纖維 蛋白蛋白 降解降解 產(chǎn)物產(chǎn)物 降解降解 產(chǎn)物產(chǎn)物 2 2、耦聯(lián)了、耦聯(lián)了tPAtPA的血纖維蛋白的單克隆抗體的血纖維蛋白的單克隆抗體 纖溶酶原纖溶酶原 纖溶酶纖溶酶 抗血纖維抗血纖維 蛋白抗體蛋白抗體 血塊血塊 (1)

28、(1)藥物與單抗直接偶聯(lián)藥物與單抗直接偶聯(lián) n通過(guò)化學(xué)反應(yīng)在通過(guò)化學(xué)反應(yīng)在藥物分子的氨基藥物分子的氨基和和抗體分子抗體分子 的的羧羧基之間基之間形成形成酰胺酰胺鍵鍵, ,但由于但由于酰胺酰胺鍵很穩(wěn)定鍵很穩(wěn)定, , 藥物與抗體分子結(jié)合后無(wú)法釋放出來(lái)藥物與抗體分子結(jié)合后無(wú)法釋放出來(lái), ,因此其因此其 藥用活性幾乎完全無(wú)法發(fā)揮出來(lái)。藥用活性幾乎完全無(wú)法發(fā)揮出來(lái)。 n用用氧化劑氧化劑把藥物分子上的糖基氧化成把藥物分子上的糖基氧化成羰羰基基, ,然然 后利用后利用羰羰基與抗體分子的氨基反應(yīng)形成西佛氏基與抗體分子的氨基反應(yīng)形成西佛氏 堿堿, ,最后還原。這樣制成的靶向制劑可以保留最后還原。這樣制成的靶向制

29、劑可以保留 一定的藥物活性一定的藥物活性, ,同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)證明同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)證明, ,藥物顯示藥物顯示 出一定的選擇性。出一定的選擇性。 (2)藥物通過(guò)小分子與單抗連接藥物通過(guò)小分子與單抗連接 n通過(guò)一些小分子交聯(lián)劑通過(guò)一些小分子交聯(lián)劑,把藥物分子上的某把藥物分子上的某 些基團(tuán)與抗體分子上的某些基團(tuán)連接起來(lái)些基團(tuán)與抗體分子上的某些基團(tuán)連接起來(lái)。 (3)藥物通過(guò)大分子與抗體相連藥物通過(guò)大分子與抗體相連 n將較多的藥物分子接連在一種大分子聚合將較多的藥物分子接連在一種大分子聚合 物上物上,然后再與單克隆抗體交聯(lián)。然后再與單克隆抗體交聯(lián)。 二、雜交人二、雜交人- -鼠單克隆抗體鼠單克隆抗體 n鼠源單克

30、隆抗體在臨床上的應(yīng)用前景很廣鼠源單克隆抗體在臨床上的應(yīng)用前景很廣, n鼠源的抗體有其局限性鼠源的抗體有其局限性:被清除出人的循環(huán)系被清除出人的循環(huán)系 統(tǒng)統(tǒng); n鼠源抗體一般無(wú)法有效地激發(fā)宿主的免疫防衛(wèi)鼠源抗體一般無(wú)法有效地激發(fā)宿主的免疫防衛(wèi) 系統(tǒng)系統(tǒng), n在大多數(shù)情況下在大多數(shù)情況下,還會(huì)引發(fā)人對(duì)于鼠源抗體本還會(huì)引發(fā)人對(duì)于鼠源抗體本 身的免疫反應(yīng)身的免疫反應(yīng), 人的抗鼠反應(yīng)人的抗鼠反應(yīng) (human antimouse resmse), 也就是產(chǎn)生人的抗鼠抗體也就是產(chǎn)生人的抗鼠抗體 (human antimouse antibody, 簡(jiǎn)稱(chēng)簡(jiǎn)稱(chēng) HAMA)。 Chimeric Antibodi

31、es vHuman Fc regions vMouse V regions 三、人源化抗體三、人源化抗體(humanized antibody) 1. 將小鼠的將小鼠的CDR序列移植到人抗體可變區(qū)序列移植到人抗體可變區(qū) 框架中，產(chǎn)生的抗體稱(chēng)為框架中，產(chǎn)生的抗體稱(chēng)為CDR移植抗體。移植抗體。 2.將小鼠將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在基因，在 小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)， 產(chǎn)生大量完全人源化抗體產(chǎn)生大量完全人源化抗體 人源單克隆抗體人源單克隆抗體 n化學(xué)偶聯(lián)的單抗靶向制劑產(chǎn)率很低化學(xué)偶聯(lián)的單抗靶向制劑產(chǎn)率很低; n偶聯(lián)分子其連接位置也是

32、隨機(jī)的偶聯(lián)分子其連接位置也是隨機(jī)的; n藥物分子的酶活性和其他生物活性部分、藥物分子的酶活性和其他生物活性部分、 甚至全部喪失。甚至全部喪失。 n嵌合抗體嵌合抗體的的可變區(qū)可變區(qū)100% 都是鼠源的都是鼠源的，對(duì)對(duì) 人體仍然有一定的免疫原性。人體仍然有一定的免疫原性。 傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)是很難獲得人源單克隆傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)是很難獲得人源單克隆 抗體主要原因抗體主要原因: n人一鼠淋巴細(xì)胞的融合細(xì)胞中人源的染人一鼠淋巴細(xì)胞的融合細(xì)胞中人源的染 色體不穩(wěn)定色體不穩(wěn)定,得到的人源單克隆抗體極少得到的人源單克隆抗體極少; n沒(méi)有沒(méi)有能有效代替鼠的骨髓瘤細(xì)胞的人的能有效代替鼠的骨髓瘤細(xì)胞的人的 骨髓瘤細(xì)胞

33、骨髓瘤細(xì)胞; n倫理上倫理上,無(wú)法對(duì)人進(jìn)行多種抗原的免疫。無(wú)法對(duì)人進(jìn)行多種抗原的免疫。 獲得人源抗體的方法獲得人源抗體的方法I n先分離出正在活躍產(chǎn)生抗體的人先分離出正在活躍產(chǎn)生抗體的人B 細(xì)胞細(xì)胞, n通過(guò)熒光標(biāo)記選擇能產(chǎn)生特殊抗體的通過(guò)熒光標(biāo)記選擇能產(chǎn)生特殊抗體的B cell, n病毒轉(zhuǎn)化病毒轉(zhuǎn)化,使之能在培養(yǎng)條件下正常生長(zhǎng)。使之能在培養(yǎng)條件下正常生長(zhǎng)。 n其中的一些轉(zhuǎn)化的其中的一些轉(zhuǎn)化的 B 細(xì)胞就可以分泌出能與細(xì)胞就可以分泌出能與 特異性抗原結(jié)合的單抗。特異性抗原結(jié)合的單抗。 n產(chǎn)率很低產(chǎn)率很低,抗體對(duì)于抗原的結(jié)合能力也較差?？贵w對(duì)于抗原的結(jié)合能力也較差。 獲得人源抗體的方法獲得人源抗

34、體的方法II n將人源免疫干細(xì)胞導(dǎo)人缺失大部分免疫細(xì)胞的將人源免疫干細(xì)胞導(dǎo)人缺失大部分免疫細(xì)胞的 小鼠體內(nèi)小鼠體內(nèi), n這種小鼠遇到抗原時(shí)這種小鼠遇到抗原時(shí),會(huì)產(chǎn)生人源的抗體。會(huì)產(chǎn)生人源的抗體。 獲得人源抗體的方法獲得人源抗體的方法III n將改造過(guò)的人的抗體基因?qū)耸笈咛ハ抵袑⒏脑爝^(guò)的人的抗體基因?qū)耸笈咛ハ抵?, 以得到能在免疫后產(chǎn)生人的抗體的轉(zhuǎn)基因鼠。以得到能在免疫后產(chǎn)生人的抗體的轉(zhuǎn)基因鼠。 n改造過(guò)的抗體改造過(guò)的抗體，除了構(gòu)成抗原結(jié)合部位的輕重除了構(gòu)成抗原結(jié)合部位的輕重 鏈各鏈各3個(gè)個(gè)CDR區(qū)是鼠源外區(qū)是鼠源外,其余均為人源的其余均為人源的。 Humanized Antibodies

35、nCloned human gene nInsert sequences from mouse monoclonal antibody for CDR1-3 segments nPCR amplified segments Isolation of CDR Segments nPCR amplification of CDR segments from mouse monoclonal antibody to desired target nInsert into cDNA clone of human antibody nProduce human antibody with desired

36、 CDRs and antigen specificity 四、抗體融合蛋白四、抗體融合蛋白 n一種是將抗體的可變區(qū)域與一非抗體蛋白融一種是將抗體的可變區(qū)域與一非抗體蛋白融 合，使融合蛋白繼承有抗體分子的結(jié)合特異合，使融合蛋白繼承有抗體分子的結(jié)合特異 性。性。 n另一種是用非免疫球蛋白的序列替換抗體的另一種是用非免疫球蛋白的序列替換抗體的 可變區(qū)，如用可變區(qū)，如用CD4、白細(xì)胞介素、白細(xì)胞介素3和腫瘤壞和腫瘤壞 死因子等。死因子等。 五、抗體酶五、抗體酶 n 抗體酶抗體酶(abzyme)(abzyme)：應(yīng)用于單克隆技術(shù)生產(chǎn)：應(yīng)用于單克隆技術(shù)生產(chǎn) 的兼具抗體及酶催活性的工程蛋白質(zhì)。也就的兼具抗

37、體及酶催活性的工程蛋白質(zhì)。也就 是說(shuō)，其行為如同蛋白酶一樣，能夠催化化是說(shuō)，其行為如同蛋白酶一樣，能夠催化化 學(xué)反應(yīng)的一類(lèi)新型的抗體。學(xué)反應(yīng)的一類(lèi)新型的抗體。 n抗體酶的制備抗體酶的制備( (自學(xué)自學(xué)) ) Immunotoxins nProtein toxin connected to Fv region nSingle-chain or S-S linked Fv region nToxin localized to antigen-expressing cells 六、單鏈抗體六、單鏈抗體(single chain antibody) n單鏈抗體：用基因工程方法，將抗體重單鏈抗體：用基因

38、工程方法，將抗體重 鏈和輕鏈可變區(qū)通過(guò)一個(gè)連接肽連接而鏈和輕鏈可變區(qū)通過(guò)一個(gè)連接肽連接而 成的重組蛋白。成的重組蛋白。 n特點(diǎn)：能保持與抗原結(jié)合的性能，分子特點(diǎn)：能保持與抗原結(jié)合的性能，分子 量小，穿透性強(qiáng)，體內(nèi)循環(huán)半衰期短，量小，穿透性強(qiáng)，體內(nèi)循環(huán)半衰期短， 免疫原性低。免疫原性低。 單鏈抗體單鏈抗體 nFv片段抗體片段抗體(single chain Fv fragment,scFv) n要獲得正確的抗原結(jié)合構(gòu)象要獲得正確的抗原結(jié)合構(gòu)象,VL銜接物銜接物VH; 單鏈抗體的應(yīng)用前景單鏈抗體的應(yīng)用前景 n體積小體積小,免疫原性較低免疫原性較低,不易引起人體的免疫排不易引起人體的免疫排 斥斥,滲透

39、性好滲透性好,能有效地穿透致密的腫瘤屏障能有效地穿透致密的腫瘤屏障, 有利于基因治療。有利于基因治療。 n構(gòu)建雙功能分子構(gòu)建雙功能分子生物導(dǎo)彈生物導(dǎo)彈 單鏈抗體的應(yīng)用單鏈抗體的應(yīng)用： n 用于腫瘤的導(dǎo)向治療用于腫瘤的導(dǎo)向治療 n 腫瘤的影像分布腫瘤的影像分布 n 基因治療基因治療 細(xì)胞內(nèi)抗體：在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)特異性識(shí)別某細(xì)胞內(nèi)抗體：在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)特異性識(shí)別某 一基因產(chǎn)物的抗體，可干擾該基因產(chǎn)物一基因產(chǎn)物的抗體，可干擾該基因產(chǎn)物 的生物活性。的生物活性。 n 研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 七、嵌合抗體七、嵌合抗體 (chimeric antibody) n嵌合抗體：從雜交瘤細(xì)胞分離

40、出功能性嵌合抗體：從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性 可變區(qū)基因，與人可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，恒定區(qū)基因連接， 插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表 達(dá)人達(dá)人-鼠嵌合抗體。鼠嵌合抗體。 n特點(diǎn)：減少了鼠源性抗體的免疫原性，特點(diǎn)：減少了鼠源性抗體的免疫原性， 同時(shí)保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的同時(shí)保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的 能力。能力。 八、雙價(jià)抗體與雙特異性抗體八、雙價(jià)抗體與雙特異性抗體 (bispecific antibody) v許多抗原抗體反應(yīng)要求雙價(jià)的抗原結(jié)合位許多抗原抗體反應(yīng)要求雙價(jià)的抗原結(jié)合位 點(diǎn)，使抗原分子上的兩個(gè)表位交聯(lián)或使兩點(diǎn)，使抗原分子

41、上的兩個(gè)表位交聯(lián)或使兩 個(gè)抗原分子連接。個(gè)抗原分子連接。 v將識(shí)別腫瘤抗原的抗體和將識(shí)別腫瘤抗原的抗體和 識(shí)別細(xì)胞毒性識(shí)別細(xì)胞毒性 免疫效應(yīng)細(xì)胞表面分子的抗體連結(jié)在一起，免疫效應(yīng)細(xì)胞表面分子的抗體連結(jié)在一起， 可使效應(yīng)細(xì)胞更容易與腫瘤細(xì)胞結(jié)合識(shí)別，可使效應(yīng)細(xì)胞更容易與腫瘤細(xì)胞結(jié)合識(shí)別， 取得殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。取得殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。 九、單克隆抗體的改造和應(yīng)用九、單克隆抗體的改造和應(yīng)用 n單克隆抗體與殺傷單克隆抗體與殺傷 性藥物耦聯(lián)性藥物耦聯(lián)破壞特破壞特 定的目標(biāo)細(xì)胞定的目標(biāo)細(xì)胞; n單克隆抗體與藥物單克隆抗體與藥物 前體耦聯(lián)前體耦聯(lián)在酶的作在酶的作 用下用下,可轉(zhuǎn)化為具殺可轉(zhuǎn)化為具殺 傷活

42、性的藥物傷活性的藥物,殺傷殺傷 靶細(xì)胞靶細(xì)胞 轉(zhuǎn)基因的方法在雜交瘤細(xì)胞中生產(chǎn)完全轉(zhuǎn)基因的方法在雜交瘤細(xì)胞中生產(chǎn)完全 的人源單克隆抗體的人源單克隆抗體 n輕鏈和重鏈各由位于兩條染色體上的兩組輕鏈和重鏈各由位于兩條染色體上的兩組 基因分別編碼?；蚍謩e編碼。 n通過(guò)重排產(chǎn)生大量的各不相同的輕鏈和重通過(guò)重排產(chǎn)生大量的各不相同的輕鏈和重 鏈分子。鏈分子。 n再通過(guò)輕鏈和重鏈分子之間的排列組合而再通過(guò)輕鏈和重鏈分子之間的排列組合而 形成幾乎無(wú)限的多的抗體分子。形成幾乎無(wú)限的多的抗體分子。 1 1 2 2 3 34 4 5 51 12 23 34 45 5 93939 9 4 4 9 9 5 5 2828

43、2 2 9 9 3 3 0 0 1 12 23 3 4 45 56 6 VHDH JHCH VH(1/9 5) DH(1/3 0) JH(1/6)CH(1/5) 基因重排后 得到的重鏈 A 74747 7 5 5 7 7 6 6 1 12 23 3 4 45 5 VKJk 1 1 2 2 3 34 45 5 Ck C Ck k Vk(1/76)Jk(1/5)Ck B 基因重排后 得到的輕鏈 ES細(xì)胞 人重鏈基因 YAC 人輕鏈基因 YAC H H 抗體基 因敲除 的小鼠 抗體基 因敲除 的小鼠 h hH H h 只表達(dá)人重鏈的 純合轉(zhuǎn)基因鼠 只表達(dá)人輕鏈的 純合轉(zhuǎn)基因鼠 hAbhAb 只表達(dá)人

44、源抗體的純合轉(zhuǎn)基因鼠 第四節(jié)第四節(jié) 基因工程抗體和抗體工程基因工程抗體和抗體工程 一、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基本方法一、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基本方法 1、獲得目的基因、獲得目的基因 2、抗體庫(kù)技術(shù)的載體：現(xiàn)在普遍使用噬、抗體庫(kù)技術(shù)的載體：現(xiàn)在普遍使用噬 菌粒（菌粒（phagemid）載體，其中的載體，其中的pHEN1 為新一代載體，轉(zhuǎn)化效率高，有利于提為新一代載體，轉(zhuǎn)化效率高，有利于提 高庫(kù)容量。高庫(kù)容量。 3、淘篩：抗原固定化后，對(duì)噬菌粒群的吸、淘篩：抗原固定化后，對(duì)噬菌粒群的吸 附、洗滌和洗脫后再感染擴(kuò)增，與輔助噬附、洗滌和洗脫后再感染擴(kuò)增，與輔助噬 菌體超感染獲得大容量次級(jí)文庫(kù)，再反復(fù)菌體超感

45、染獲得大容量次級(jí)文庫(kù)，再反復(fù) 與抗原吸附，經(jīng)幾輪淘篩后，淘汰了非目與抗原吸附，經(jīng)幾輪淘篩后，淘汰了非目 的克隆，且使目的克隆大量擴(kuò)增。的克隆，且使目的克隆大量擴(kuò)增。 四、表達(dá)與鑒定：目的克隆經(jīng)過(guò)鑒定后，再四、表達(dá)與鑒定：目的克隆經(jīng)過(guò)鑒定后，再 導(dǎo)入感受態(tài)菌株，進(jìn)行可溶性表達(dá)，其產(chǎn)導(dǎo)入感受態(tài)菌株，進(jìn)行可溶性表達(dá)，其產(chǎn) 物用物用western blot分析確定后，就完成了分析確定后，就完成了 全過(guò)程。全過(guò)程。 二、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的特點(diǎn)二、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的特點(diǎn) 1、模擬天然全套抗體庫(kù)、模擬天然全套抗體庫(kù) n抗體文庫(kù)抗體文庫(kù) 1011庫(kù)容，能包含庫(kù)容，能包含B細(xì)胞全部克細(xì)胞全部克 隆。隆。 n建庫(kù)

46、的外源基因來(lái)自人外周血、骨髓或脾建庫(kù)的外源基因來(lái)自人外周血、骨髓或脾 臟的淋巴細(xì)胞提取的臟的淋巴細(xì)胞提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的反轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA擴(kuò)增，使用的通用引物采自多個(gè)人擴(kuò)增，使用的通用引物采自多個(gè)人 體，具有人的種屬普遍性。體，具有人的種屬普遍性。 nVH和和VL隨機(jī)重組增加抗體的多樣性。隨機(jī)重組增加抗體的多樣性。 2、避開(kāi)了人工免疫和雜交瘤技術(shù)、避開(kāi)了人工免疫和雜交瘤技術(shù) 3、可獲得高親和力的人源化抗體、可獲得高親和力的人源化抗體 n在噬菌體抗體庫(kù)中，在噬菌體抗體庫(kù)中，VH和和VL基因的隨機(jī)基因的隨機(jī) 重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟過(guò)程，所重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟過(guò)程，所 用抗體

47、基因又都是來(lái)自人體，用抗體基因又都是來(lái)自人體， n因此產(chǎn)生的抗體必然都是高親和力的。因此產(chǎn)生的抗體必然都是高親和力的。 三、基因工程抗體的表達(dá)三、基因工程抗體的表達(dá) 1、原核細(xì)胞表達(dá)、原核細(xì)胞表達(dá) 2、真核細(xì)胞表達(dá)、真核細(xì)胞表達(dá) 3、轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)、轉(zhuǎn)基因植物表達(dá) 4、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá) 第五節(jié)第五節(jié) 抗體診斷試劑抗體診斷試劑 一、血清學(xué)鑒定用的抗體類(lèi)試劑一、血清學(xué)鑒定用的抗體類(lèi)試劑 1、鑒定病原菌的抗體試劑：診斷血清制備、鑒定病原菌的抗體試劑：診斷血清制備 步驟：步驟： （1）制備細(xì)菌抗原，）制備細(xì)菌抗原，O（菌體）抗原，菌體）抗原，H （鞭毛）抗原；鞭毛）抗原； （2）免疫動(dòng)物

48、和制備抗體血清）免疫動(dòng)物和制備抗體血清 2、乙型肝炎病毒表面抗原（、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反的反 向被動(dòng)血凝診斷試劑向被動(dòng)血凝診斷試劑 3、妊娠診斷試劑、妊娠診斷試劑 4、抗、抗ABO血型系統(tǒng)血清血型系統(tǒng)血清 二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類(lèi)試劑二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類(lèi)試劑 1、熒光抗體診斷試劑、熒光抗體診斷試劑 n熒光色素如異硫氰酸熒光素（熒光色素如異硫氰酸熒光素（FITC）等標(biāo)記抗等標(biāo)記抗 體球蛋白，即成為熒光抗體。體球蛋白，即成為熒光抗體。 n用熒光抗體浸染含有抗原物質(zhì)的組織切片或細(xì)用熒光抗體浸染含有抗原物質(zhì)的組織切片或細(xì) 胞，熒光抗體與抗原集合，在熒光顯微鏡下成胞，熒光抗體與抗原集合，在熒光顯微鏡下成 為可發(fā)光的可視物，從而達(dá)到診斷或定位的目為可發(fā)光的可視物，從而達(dá)到診斷或定位的目 的。的。 （1）熒光抗體的制備）熒光抗體的制備 （2）免疫熒光測(cè)定法有直接和間接兩種方法。）免疫熒光測(cè)定法有直接和間接兩種方法。 2、免疫酶抗體診斷試劑、