口蹄疫亞洲I型抗體液相阻斷ELISA作業(yè)指導書

1、 第二章 作業(yè)指導書 第 1 頁 共 3 頁 口蹄疫 A 型抗體液相阻斷 ELISA 第一版 第 0 次修改 起草人： 作業(yè)指導書 2011 年 04 月 日頒布、實施 SQSYK-ZYB-004-1.0 1適用范圍 試劑盒來自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，適用于亞洲 I 型口蹄疫抗體檢測。 2. 器材準備 2.1 移液器： 5-50ul 移液器、 0.2-10ul 移液器、 50-200ul 移液器、 50-300ul 移液器各一把。 2.2 移液槍頭。 2.3 抗原抗體反應板：微量血凝板（ U 型、 V 型均可） 5 塊，試劑盒配備兩塊，用于被檢血清的稀釋和抗原抗體反應。 2.4 超純水，

2、無離子水或蒸餾水。 3. 試劑準備 3.1 包被緩沖液（ PH9.6） 將試劑盒配備的碳酸鹽緩沖液膠囊 1 粒小心打開，將膠囊內(nèi)粉末小心倒入 100ml 無離 子水中溶解即可。 4存放， 1 月內(nèi)有效。 3.2 洗滌液（ PBST） 將本試劑盒配備的 25 倍濃縮 PBST液（可能有結(jié)晶形成， 用時微熱溶化） 用無離子水或蒸餾水做 1:25 稀釋。（如果 PH降低，務必用 NaOH調(diào)制 7.4 ） 3.3 底物溶液 取 1 片檸檬酸 - 磷酸鹽片劑（試劑盒配備）溶于 100ml 無離子水中，溶解后，取 50ml 溶液，再加 1 片鄰苯二胺（ OPD）片劑，充分溶解，分裝（ 瓶或 瓶），避光 -

3、20 保存。用前避光溶化，臨用時每 1ml 上述溶液加 10ul3%的雙氧水（ H2O2 ）。務必加雙氧水！ 4. 操作步驟 4.1 用包被緩沖液稀釋亞洲 I 型口蹄疫病毒兔抗血清至工作濃度（ 1:1000 ） , 在 ELISA 板上 每孔加 50ul ，振蕩，封板或置濕盒內(nèi)，室溫過夜。 4.2 抗原抗體 （陰陽性對照血清及待檢血清） 反應根據(jù)不同的需要， 選擇圖 1-2 中的一種布 局在抗原抗體反應板上操作。 圖 196 孔酶標板檢測 10 份樣品布局圖 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A S11：8 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 +1:32

4、 B 1:16 1:64 C 1:32 1:128 D 1:64 1:256 E 1:128 1:512 F 1:256 1:1024 G 1:2048 H 1:512 1:1024 1:4096 圖 1 為抗體滴度測定（定量）檢測 10 份樣品布局圖；圖 2 為抗體滴度測定（定量）檢測 20 份樣品布局圖。 1:4 1:8 病毒 抗原 對照 作業(yè)指導書 第二章 第 2 頁 共 3 頁 口蹄疫 A 型抗體液相阻斷 ELISA 第一版 第 0 次修改 起草人： 作業(yè)指導書 2011 年 04 月 日頒布、實施 SQSYK-ZYB-004-1.0 圖 296 孔酶標板檢測 20 份樣品布局圖 1

5、2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A S11：32 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 +1:32 1:4 B 1:64 1:64 1:8 C 1:128 1:128 D 1:256 1:256 E S111:32 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 1:512 病毒 F 1:64 1:1024 抗原 G 1:128 1:2048 對照 H 1:256 1:4096 以圖 1 為例，在 U 型血凝板上按 孔量用 PBST 將待檢血清從 1:4 開始做 2 倍連續(xù) 稀釋至 1:512。同時，按圖示稀釋陰陽性對照血清，然后每孔

6、加入 50ul 用 PBST 稀釋到使用 濃度的亞洲 I 型口蹄疫病毒抗原（ 1:8，即 1 份病毒抗原加 7 份 PBST ），病毒抗原對照孔加 100ul 。振蕩混勻，封板， 4過夜。加入病毒抗原后血清的稀釋度變?yōu)閺?1:8 開始的 2 倍稀 釋。 4.3 用洗滌液（ 1 PBST）連續(xù)洗 ELISA 板 5 次，在吸水紙上甩干，再將抗原抗體混合物從 抗原抗體反應板上按次序轉(zhuǎn)移至 ELISA 板上的相對應孔，每孔 50ul ，封板， 37溫育 1 小 時。 4.4 同上洗版 5 次，甩干。用豚鼠兔抗血清稀釋液稀釋亞洲 I 型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工 作濃度（ 1:1000 ），每孔加 50

7、ul ，封板， 37溫育 1 小時。 4.5 同上洗版 5 次，甩干。用 1 PBST稀釋兔抗豚鼠酶結(jié)合物至工作濃度（ 1:1000 ），每孔 加 50ul ，封板， 37溫育 1 小時。 4.6 同上洗版 5 次，每孔加 50ul 底物溶液（務必加雙氧水） ， 37溫育 15 分鐘。每孔再加 50ul 終止液終止反應，立即在 492nm波長下讀取光吸收值（ D 值）。 492nm 5 結(jié)果判定 5.1 試驗認可標準 每塊板設4 孔病毒抗原對照，病毒抗原對照不加任何血清，直接用 PBST 稀釋至使用濃 度，與血清 病毒抗原復合物同步加入ELISA 板孔，孔，病毒抗原對照D492nm 值應在 1

8、.5 0.5 范圍內(nèi)。陽性對照抗體效價應在1:1024 1 滴度以內(nèi)，陰性對照血清抗體效價應1:8 。 5.2病毒抗原對照平均D492nm值 50%計算（臨界值） 抗原對照孔是4 孔，棄去最高和最低D492nmOD值，計算剩余2 孔的平均D492nm，再除以 2， 作業(yè)指導書 口蹄疫 A 型抗體液相阻斷 ELISA 作業(yè)指導書 SQSYK-ZYB-004-1.0 即 50%對照值。該值即為臨界值，表示阻斷 5.3結(jié)果判定 第二章 第3頁共3頁 第一版 第 0 次修改起草人： 2011 年 04 月日頒布、實施 50%反應的對照D492nm值。 以病毒抗原對照平均D492nm值的 50%為臨界值，被檢血清稀釋孔D492nm值大于臨界值的孔 為陰性孔，小于或等于臨界值的孔為陽性孔，陽性孔的D492nm 值等于臨界值時所對應的稀釋 度為該份血清的抗體滴度。例如病毒抗原對照平均D492nm值為 1.2 ，則其 50%為 0.6 。若某一 待檢血清在1:128 時 D492nm值為 0.6 ，則該份待檢血清的抗體滴度為1:128 。若臨界值處于兩 個滴度之間，如處于1: