(完整版)銀杏葉黃酮類化合物的提取研究進(jìn)展

1、銀杏葉黃酮類化合物的提取研究進(jìn)展銀杏樹(shù)Ginkgo biloba L.又稱白果樹(shù)、公孫樹(shù)，是我國(guó)古老的樹(shù)種之一，具有活化石”的美稱。由于其生長(zhǎng)規(guī)律特殊，抗病能力強(qiáng)而受到國(guó)內(nèi)外的重視。有關(guān)銀杏葉的有效成分及療效的研究日益受到重視，已開(kāi)發(fā)出保健品、化妝品、藥品等多達(dá)100多種，形成國(guó)際市場(chǎng)上銷售額20多億美元的新興產(chǎn)業(yè)。銀杏葉的化學(xué)成分有黃酮類、萜類、內(nèi)酯類、酚酸類以 及生物堿、聚異戊二烯等化合物。黃酮類為銀杏葉的主要有效成分之一，含量隨品種、產(chǎn)地、樹(shù)齡、不同的采摘時(shí)間而不同。黃酮類化合物優(yōu)異的抗氧化、抗病毒、防治心血管疾病、增 強(qiáng)免疫力等作用而受世人矚目。藥學(xué)研究表明，有 38種銀杏黃酮類化合物

2、從銀杏葉中分離出來(lái)，其中黃酮類化合 物主要有3類：黃酮（醇）及其昔28種：如槲皮黃酮等；黃烷醇類：如兒茶素等4種；雙黃酮：如白果雙黃酮等 6種（兒茶素）。1銀杏葉黃酮的提取分離1.1溶劑提取法目前國(guó)內(nèi)外掀起了研究開(kāi)發(fā)銀杏葉熱。國(guó)內(nèi)銀杏葉常用溶劑例如乙醇、丙酮、醋酸乙酯、水以及某些極性較大的混合溶劑浸泡銀杏葉進(jìn)行提取，溶劑提取方法一般有：煎煮、冷浸、回流、滲施等經(jīng)典方法。1.1.1水提取樹(shù)脂分離法有關(guān)水浸提銀杏黃酮苷的文獻(xiàn)報(bào)道不多。肖順昌等報(bào)道了用16倍量沸水分3次浸提銀杏葉，得到的水溶液，經(jīng)冷藏、分離雜質(zhì)得溶液，然后用Do1型吸附樹(shù)脂吸附得到濃度達(dá) 38%的黃酮苷。胡敏等研究水浸提銀杏葉黃酮苷

3、并用樹(shù)脂精制 的工藝，探討了影響黃酮苷浸出的主要因素以及最適的精制方法，結(jié)果表明：水為提取劑， 在90C水溶回流浸提銀杏葉 2次，4h/次，經(jīng)沉淀，過(guò)濾，濃縮后，用樹(shù)脂精制、冷凍干 燥后，制得總黃酮苷含量高的提取物、產(chǎn)品得率為銀杏葉干重的1.2 %-1.5 %。水提取成本低，沒(méi)有任何環(huán)境污染，產(chǎn)品安全性高，但是水對(duì)有效成分的選擇性差， 提取率低。1.1.2有機(jī)溶劑浸提法一般的有機(jī)溶劑浸提法。田呈瑞等研究了乙醇浸提銀杏葉黃酮的方法。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)， 確定乙醇提取銀杏葉總黃酮的最佳條件為：銀杏葉粉碎至50-60目，以70%乙醇按照液固比 6: 1的比例，于80C條件下提取2次，1h/次，

4、 銀杏葉總黃酮提取率可達(dá) 87.6 %。醇（酮）提一鉛化物沉淀法。 張永恒等研究了乙醇回流提取銀杏葉，濃縮液經(jīng)蒸餾水提取，再經(jīng)乙醚萃取，飽和醋酸鉛沉淀法，制備銀杏葉黃酮苷原。醇提一樹(shù)脂吸附法。王成章等對(duì)黃酮含量較低的銀杏葉的提取和純化進(jìn)行了研究、研究了不同的浸提溶劑（水、甲醇、乙醇、丙酮）、浸提溫度（室溫、400-500 C、600-700 C ）、 浸提時(shí)間對(duì)黃酮浸出率的影響，在以60% -70 %的乙醇為浸提劑，液固比為& 1 -6 : 1, 60-70 C熱浸泡、3-lh兩次，可以使黃酮的浸出率高達(dá)約85%，選用A-1和A-2混合樹(shù)脂吸附分離，可以制得高含量的銀杏黃酮苷。吉云秀等研究了用

5、35 %的乙醇浸提銀杏葉，液固比為10: 1, 50C浸提10 min，氨水調(diào)節(jié)PH除雜，浸提液用 D101型樹(shù)脂吸附分離的最佳條 件，確定出最優(yōu)的吸附一解吸工藝條件：吸附流速為3ml/min。吸附原液pH值為8.3。采用2倍樹(shù)脂床體積的70%乙醇解吸，解吸流速為1.5ml /min，操作溫度為室溫。采用此提取純化工藝所得黃酮類化合物的含量為26.2 %、黃酮類化合物提取收率為64.4 %。醇（酮）浸提一酮/銨鹽萃取法。梁紅等比較了不同溶劑提取銀杏葉黃酮類化合物的效率，用70%的乙醇作為提取溶劑，結(jié)合用3%的（NH4）2S04進(jìn)行二次提取，提取液用飽和的（NH4）2SO4溶液兩次濃縮，黃酮的提

6、純效果非常明顯。醇（酮）提取一硅藻土過(guò)濾法。熊遠(yuǎn)福等對(duì)銀杏葉總黃酮提取精制技術(shù)進(jìn)行了研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，在最佳浸提條件：浸提劑乙醇70%，銀杏葉與浸提劑用量比1: 5，浸提時(shí)間3.5h , 60C下浸提2次，最佳精制條件為：每100g銀杏葉用硅藻土 2.5g、丙烯酸樹(shù)脂80g,洗脫劑乙醇濃度 70%，應(yīng)用該工藝條件進(jìn)行浸提與精制，精品收率2.25 %，總黃酮含量達(dá)28.8 %。以上方法獲得的銀杏葉提取物精品雖然總黃酮（或黃酮苷）含量較高，但由于使用了鹵代烴、甲苯和鉛化物等有毒物質(zhì)，殘留在產(chǎn)品中，影響產(chǎn)品質(zhì)量，安全性低。1.2超臨界流體（SFE）萃取法 超臨界流體是最近幾年才發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)

7、，超臨界萃取和傳統(tǒng)的溶劑萃取相比，超臨界萃取在35-40 C進(jìn)行操作，以 CO2為萃取介質(zhì)，具有溶質(zhì)、溶劑易于分離，萃取速度高等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于提取或精致熱敏性和易氧化的物質(zhì)。 由于所用的萃取劑是氣體，容易除去，所得產(chǎn)品無(wú)殘留毒性，這種方法適用與醫(yī)藥和食品工 業(yè)。張從貴等探討了乙醇提取，超臨界CO2分離銀杏葉中的藥用成分，結(jié)果表明超臨界C02分離銀杏黃酮的效果不是很好，萃余物得率僅為0.5 %。鄧啟煥等探討了超臨界萃取銀杏葉有效成分的影響因素，在最佳條件下：萃取壓力為20MPa時(shí)間90 min ,液體比3.5 %,流量15L,粒度5目，溫度40C，銀杏黃酮的含量為28%，高于國(guó)際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)。佳紅

8、等采用SFE-HPLC測(cè)定銀杏葉粗提物中銀杏黃酮的含量，確定了超臨界流體萃取的最佳條件：壓 力為41364Pa，溫度為60 C，靜態(tài)萃取時(shí)間為 4min、動(dòng)態(tài)萃取體積為 4ml，改性劑加入 O.2 m1的乙醇。因?yàn)槌R界萃取的設(shè)備較大，操作困難等問(wèn)題，難以用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。1.3超聲波輔助提取法近年來(lái)超聲技術(shù)用于提取植物種的藥效成分成為研究的一 個(gè)方向。研究表明，利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、高的加速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、攪拌作用 等，都可以加速藥物有效成分進(jìn)入溶劑，從而提高提出率，縮短提取時(shí)間、并且免去高溫對(duì)提出成分的影響。郭國(guó)瑞等研究了單因素溫度和時(shí)間對(duì)超聲提取銀杏黃酮的影響，確定了超聲提取

9、銀杏黃酮的最佳條件：時(shí)間 55min，料液比1/30，溫度50C，此時(shí)提取率為 82.3 %。王廷峰 等對(duì)連續(xù)熱回流和超聲法提取銀杏黃酮做了比較性研究，連續(xù)熱回流條件：70 %的乙醇，液固比約6： 1，索氏提取器提取 2次，lh /次，提取率為80.9 %，通過(guò)三因素實(shí)驗(yàn)研究了超聲提取的最佳條件：50- 60目的銀杏葉，70%的乙醇，液固比約 6: 1,超聲頻率40KHZ處理時(shí)間為10min，靜置時(shí)間為I2h，銀杏黃酮的提取率為 86.7 %，連續(xù)熱回流和超聲法提 取銀杏黃酮的沒(méi)有太大差異，但是超聲法提取明顯縮短了時(shí)間、減少了溶劑用量。該方法提取速度快，提取率高，節(jié)省溶劑、能耗是一種理想的提取

10、銀杏黃酮的方法。1.4微波法微波技術(shù)是一種新的、有發(fā)展前景的新工藝，微波技術(shù)在提取植物有效成份中的應(yīng)用，近年來(lái)得到了很大發(fā)展。 微波具有穿透力強(qiáng)、 選擇性高、加熱效率高等特點(diǎn)。微波幅射(MWI)可以大大加快反應(yīng)速度，反應(yīng)時(shí)間以分、秒計(jì)微波技術(shù)應(yīng)用于植物細(xì)胞破 壁，有效地提高了收率，亦取得了令人可喜的進(jìn)展。李嶸等將微波法與傳統(tǒng)水提法結(jié)合，縮短了提取時(shí)間，大大提高了銀杏葉黃酮的提取率，液固比30: 1,時(shí)間30min，提取率達(dá)到62.3 %。段蕊等確定了微波提取銀杏黃酮的最佳條件：銀杏葉用175W微波強(qiáng)度處理5min后，以體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇，在70C下提取1h,得到提取物中黃酮類物質(zhì)的質(zhì)量濃度比

11、未 經(jīng)微波處理的高出I8.8 %。2銀杏黃酮類化臺(tái)物的測(cè)定方法目前、有關(guān)銀杏葉黃酮類化合物的測(cè)定國(guó)內(nèi)外沒(méi)有公開(kāi)普遍的控制質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，常用絡(luò)合分光光度法、氣相色譜法、HPLC- UV法、薄層掃描法、庫(kù)侖滴定法、毛細(xì)管電泳法等。2.1絡(luò)合分光光度法國(guó)內(nèi)使用較多的是“絡(luò)合一分光光度法”。黃酮母核在NaNo2的堿性溶液中，與A1(NO2)2絡(luò)合后產(chǎn)生黃色絡(luò)合物，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)溶液、 在UV510 nm處作紫外分光光度法的比色測(cè)定。雷天乾等對(duì)分光光度法和高效液相色譜測(cè)銀杏葉提取物總黃酮 含量的測(cè)定方法，作了比較分光光度法的結(jié)果較HPLC偏高，如果乘以校正因子 O.78，結(jié)果與HPLC接近。此法的測(cè)試設(shè)備價(jià)廉

12、，操作簡(jiǎn)便易學(xué)，但因樣品組分復(fù)雜，受雜質(zhì)干擾，定 量測(cè)定誤差較大。22 HPLC-UV法HPLC是測(cè)定銀杏葉及制劑中黃酮類化合物的有效方法，多采用反 相C18柱，梯度洗脫，紫外檢測(cè)。秦燕等采用梯度洗脫，流動(dòng)相10mmol兒的磷酸鹽緩沖液(pH= 2.0)-甲醇(50 : 50)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm,外標(biāo)法定量，建立了HPLC測(cè)定銀杏提取物中三種黃酮類化合物的優(yōu)化方法。佳紅等用SFE-HPLC測(cè)定銀杏粗體物中黃酮的含量，流動(dòng)相甲醇-0.4 %的磷酸(60 : 40)，流速Iml /min、檢測(cè)波長(zhǎng)：266nmo方子季等建立了高效 液相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定銀杏總黃酮的含量、以水楊酸為內(nèi)標(biāo)物，甲醇-

13、0.4 %磷酸(1:1)為流動(dòng)相，于254nm出測(cè)定銀杏葉制品中總黃酮的含量。2.3薄層掃描法 李俊等利用苷元與苷的極性不同，采用高效硅膠薄層板二次展開(kāi)法，掃描測(cè)定5種黃酮成分。將精制樣品液點(diǎn)樣于薄層板上，薄層板在層析缸內(nèi)用展開(kāi)劑I :石油醚(bp.60- 90 C)-乙醚-甲酸-醋酸乙酪(60 : 30: 6: 4)的上層飽和5min、分離槲皮素、 山柰素和異鼠李素，當(dāng)樣品都分離得較好時(shí)，取出薄層板，揮干溶劑，掃描測(cè)定槲皮素、山 柰素和異鼠李素的含量。以展開(kāi)劑H:氯仿 -甲醇-水(6 : 4: 2)的下層-乙酸(15 : 1)對(duì)同一 薄層板進(jìn)行展開(kāi)分離慚皮苷、異鼠李苷，揮干溶劑，掃描測(cè)定槲皮

14、苷、異鼠李苷的含量。李 吉來(lái)等用硅膠 G薄層板點(diǎn)樣精制樣品，以氯仿-苯-無(wú)水乙醇-冰乙酸-水(5.5 : 2: 1 : 0.5 : 1)4-10 C放置的下層溶液為展開(kāi)劑，上行展開(kāi)后，晾干，薄層掃描法測(cè)定異鼠李素、山柰素和槲皮素三種黃酮。2.4庫(kù)侖滴定法 胡衛(wèi)兵等探討了庫(kù)侖滴定法測(cè)定銀杏葉中總黃酮含量的條件。銀杏葉經(jīng)乙醇回流提取，聚酰銨柱分離純化，以2mol/L HCl-1mol/L BKr- 無(wú)水EtOH(v(HCl):v(KBr) : v (EtOH) ; 3: 3: 2混合液為電解液，死停法確定滴定終點(diǎn)，以蘆丁為對(duì)照品，計(jì) 算出銀杏黃酮的含量。2.5毛細(xì)管電泳法 毛細(xì)管電泳以高效、快速、

15、用樣量少、耗溶劑少、重現(xiàn)性好、不易污染等優(yōu)點(diǎn)，近幾年用于分析天然產(chǎn)物得到較大的發(fā)展。毛細(xì)管電泳的原理是在緩沖體系中引入表面活性劑，利用溶質(zhì)在水相和膠束相中的分配差異進(jìn)行分離。Pittea P 對(duì)毛細(xì)管電泳(CE)和HPLC這兩種方法分析銀杏黃酮做了比較，作者認(rèn)為用梯度洗脫的HPLC不但不 簡(jiǎn)便而且速度慢。Yuhua Cao。等建立了快速、高效、高靈敏度、相對(duì)簡(jiǎn)單的毛細(xì)管電泳一電極法測(cè)定銀杏黃酮的方法，采用+30KV工作電壓，70cm長(zhǎng)、2.5卩m內(nèi)徑的熔融石英毛細(xì)管柱，在毛細(xì)管的出口處裝有一個(gè)直徑為300卩m碳盤工作電極，含有三電極(碳盤工作電極、鉑輔助電極、飽和汞參比電極)的單元與BASLC-4C電流測(cè)定儀相連，通過(guò)記錄圖形完成電色 層分析，在最佳條件下分離并鑒定了表兒茶素、兒茶素、蘆丁、芹黃素、木犀草素、槲皮黃 酮6種銀杏葉黃酮類化合物。4應(yīng)用銀杏葉黃酮具有顯著的藥理活性、目前對(duì)銀