細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞cytokine-inducedkillerCIK

1、DC-CIK 聯(lián)合化療治療晚期胃癌的近期療效觀察【摘要】 目的 探討樹(shù)突狀細(xì)胞( dendritic cell ， DC )共培養(yǎng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞 ( cytokine-induced killer,CIK )聯(lián)合化療治療晚期胃癌患者的近期療效。 方法 選取 28 例確 診的晚期胃癌患者采用 DC-CIK 聯(lián)合化療為聯(lián)合治療組， 選取臨床資料相近的同期進(jìn)行單純 化療的 28 例的晚期胃癌患者為對(duì)照組，觀察兩組患者治療前后外周血中 T 細(xì)胞亞群 ,細(xì)胞 因子及卡氏評(píng)分( Karnofsky KPS )的變化，臨床療效，并記錄其不良反應(yīng)。 結(jié)果 聯(lián)合治療 組患者治療后CD3+,CD4+,CD

2、56+和CD4+/CD8+的比例無(wú)明顯變化(P 0.05),對(duì)照組CD3+,CD4+和CD4+/CD8+的比例治療后明顯下降(P0.05);聯(lián)合治療組的細(xì)胞因子IL-12和IFN- y的水平治療后有所上升(P0.05),治療組IL-2, IL-12和TNF- a的水平治療后有 所下降(P0.05)。聯(lián)合治療組的疾病控制率為78.6%，與對(duì)照組的53.6%差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)， KPS 評(píng)分總提高率為 82.14%，與對(duì)照組的 57.14%差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P0.05)， 結(jié)論 DC-CIK 聯(lián)合化療與對(duì)照組比能提高患者的免疫功能及生活質(zhì)量，DC-CIK 免疫治療聯(lián)合化療可望成為胃癌

3、有效的過(guò)繼免疫治療方法?！娟P(guān)鍵詞】樹(shù)突狀細(xì)胞 ;細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞;胃癌 ;過(guò)繼免疫治療Short-term curative efficacy of DC-CIK cell-therapy combined with chemotherapy on patients with advanced gastric cancer【 Abstract】 Objective To investigate clinical effects of dendritic cells(DC) co-cultured with cytokine induced killer cells(CIK) combin

4、ed with chemotherapy on patients with advanced gastric cancer.Methods twenty-eight patients with advanced gastric cancer were treated with DC-CIK combined with chemotherapy were taken as the combined treatment group,another twenty-eight patients who were treated with chemotherapy alone during the sa

5、me period were taken as control. T lymphocyte subtypes ， intra-cellular cytokines in peripheral blood of the patients and Performance Status (KPS) were compared between the two groups.The clinical effects were analysed. The safety were observed. Results The ratios of CD3+,CD4+,CD56+andCD4+/CD8+ were

6、 not change obviously in combined treatment group and decreased in control group after treatment, which showed significant statistical difference (P0.05) .The IL-12 and IFN- y were increased after treatment in combined treatment group, (P0.05). The IL-2, IL-12 and TNF-a were decreased in control gro

7、up after treatment, (P0.05). The disease control rate (DCR) of combined therapy group and control group were 78.6%and 53.6%respectively showing significant difference (P0.05).The effective rate of KPS were 82.14%and 57.14%respectively showing significant difference (P 0.05女137(25.0)6(21.4)中位年齡（歲）59

8、(3679)62 (4177)58 ( 3679)胃癌部位賁門部2110 (35.7)11 (39.2)胃體部2313 (46.4)10 (35.7)0.772 0.05胃竇部125 (17.9)7 (25.0)病理類型低分化腺137 (25.0)6 (21.4)中分化腺3617(60.7)19 (67.9)0.331 0.05粘液腺74 (14.3)3 (10.7)術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移/晚期（例）30/2617/1113/15轉(zhuǎn)移部位肝94 (14.3)5 (17.9)腹腔74 ( 14.3)3 (10.7)肺73 ( 10.7)4 (14.3)0.486 0.05盆腔52(7.1)3 (10.7)

9、骨73 (10.7)4 (14.3)治療方式首治/單純手術(shù)1789一線化療181171.56 0.05二線或以上化療21912放療523治療前KPS評(píng)分5674.64 8.8174.28 8.36 0.051.2 DC-CIK細(xì)胞培養(yǎng)1.2.1 DC細(xì)胞的體外培養(yǎng)和擴(kuò)增DC的體外培養(yǎng)化療前2天采集患者自體外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC ），用生理鹽水洗滌 4次，然后使用 RPMI 1640培養(yǎng)基（加拿大維森特公司）調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2.5杓63X106個(gè)/ml，將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，置37C、5%CO2培養(yǎng)箱孵育90 min后吸

10、取未貼壁細(xì)胞(peripheral blood lymphocyte , PBL)，于孔中加入 DC誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含 5%自 體血漿、100ng/ml rhGM-CSF、50ng/ml rhlL-4 )，置 37C、5%CO2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)，第 3 天 進(jìn)行1/3換液，第5天收獲未成熟 DC (imDC)，加入終濃度為 20ng/ml IL- 1伙5 /ml PGE-2、20 ng/ml TNF- a,誘導(dǎo)DC成熟，第7天收獲成熟 DC ( mDC)。1.2.2 CIK的體外培養(yǎng)PBMC貼壁培養(yǎng)后收獲 PBL ,重懸于5%自體血漿RPMI 1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞密度至 2.5X 106/ml，

11、鋪入預(yù)先包被有 anti-CD3 mAb 的 75cm2培養(yǎng)瓶中，添加 IFN- 丫 ( 1000 U/ml ), 置于37C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，第二天添加IL-1 a (終濃度10 ng/ml)、IL-2 (終濃度250 U/ml),繼續(xù)培養(yǎng)；第 3天用含5%自體血漿RPMI 1640培養(yǎng)液進(jìn)行添液，此后實(shí)時(shí)觀 察細(xì)胞狀態(tài)適當(dāng)添液或擴(kuò)瓶1.2.3 DC與CIK共培養(yǎng)CIK培養(yǎng)至第7天，將細(xì)胞合并至一瓶，將收獲的mDC加入CIK細(xì)胞懸液中，同時(shí)補(bǔ)充自體血漿濃度至 10%，添加IL-2至終濃度250 U/ml，輕輕吹打混勻，按照每瓶 60ml 平均分配到75cm2培養(yǎng)瓶中，置于 37C、

12、5% CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，共培養(yǎng) 2-3天后至細(xì) 胞達(dá)到回輸數(shù)量可啟動(dòng)回輸。1.2.4 DC-CIK質(zhì)量控制每次治療前24 h和治療前2h,對(duì)DC-CIK細(xì)胞取樣，按照中華人民共和國(guó)藥典2010版方法進(jìn)行細(xì)胞活率、內(nèi)毒素和革蘭氏染色等檢測(cè)，細(xì)胞活率大于90%，待檢測(cè)結(jié)果均為陰性后收集9-13d誘導(dǎo)擴(kuò)增后獲得的 DC-CIK細(xì)胞，0.9%氯化鈉溶液洗滌 3次后配成100ml 液體靜脈回輸，每天輸 1次，回輸(5.0 0.5)X 108細(xì)胞/次，連續(xù)5次為一個(gè)療程。1.3化療方案 對(duì)照組給予 OF方案典沙利鉑120 mg/ (m2 d) d1+5-FU 500 mg/ (m2 d) d1-d5

13、 ,根據(jù)不良反應(yīng)調(diào)整劑量。 治療組給予OF+DC-CIK方案，患者行化療前2天采集細(xì) 胞培養(yǎng)DC-CIK細(xì)胞，第3天起行化療，細(xì)胞培養(yǎng)成熟后回輸給患者 ，28天為1個(gè)治療周 期，治療2周期后評(píng)價(jià)療效。1.4療效判定 參照RECIST近期療效判定標(biāo)準(zhǔn)，每?jī)芍芷谶M(jìn)行評(píng)價(jià)。采用影像學(xué)檢查對(duì)比治療前后瘤體大小，分為完全緩解(CR),部分緩解(PR),穩(wěn)定(SD)和惡化(PD)。計(jì)算有效率=(CR+PR)/(CR+PR+SD+PD)，疾病控制率(DCR) =(CR+PR+SD)/( CR+PR+SD+PD), 對(duì)于CR或PR的患者，于4周后復(fù)評(píng)。按NCI急性和亞急性毒性反應(yīng)的表現(xiàn)和分度標(biāo)準(zhǔn) 評(píng)價(jià)免疫治療

14、毒性反應(yīng)。1.5流式細(xì)胞儀術(shù)檢測(cè) T細(xì)胞亞群及胞內(nèi)細(xì)胞因子的水平抽取患者治療前后外周血送本院生物治療中心，分別進(jìn)行T細(xì)胞亞群檢測(cè)，包括CD3+,CD4+,CD8+,CD56+,CD4+/CD8+ ;另外同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞因子，包括IL-2,IL-10,IL-12,IFN-丫 和 TNF- a。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包錄入數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(X S)表示，采用t檢驗(yàn)，率的比較采用x 2檢驗(yàn)，P0.05),疾病控制率的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=3.90,P0.05 )。表2治療后兩組患者療效的比較分析(n)Table 2 Therapeutic effect of ch

15、emotherapy+DC-CIK or chemotherapy on advaneed gastric cancer patie nts(n)Groupn完全緩解部分緩解穩(wěn)定進(jìn)展有效率(%)控制率(%)x 2PChemotherapy+DC-CIK280148650.0+78.63.90.045Chemotherapy2801051335.753.6+P0.05 vs Chemotherapy2.2治療前后外周血淋巴細(xì)胞表型變化比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組治療后患者外周血中CD3+,CD4+細(xì)胞比例和CD4+/CD8+比值較治療前降低(P 0.05),詳見(jiàn)表3。由此說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的DC-CIK

16、細(xì)胞可以改善患者的免疫功能。表3聯(lián)合治療組和對(duì)照組治療前后患者外周血T細(xì)胞亞群的變化(X S,%)Table 3 Changes of T cell subgroup in peripheral blood before and after DC-CIK +chemotherapy or chemotherapy (X S,%)GroupCD3+CD4+CD8+CD56+CD4+/CD8+Chemotherapy+DC-CIKBefore treatme nt56.88 5.1029.81 4.6426.92 3.8021.94 5.521.11 0.64After treatme nt57.

17、18 土 5.1030.31 4.7026.76 4.2621.44 5.271.12 0.53ChemotherapyBefore treatme nt58.52 4.2830.00 4.5726.17 4.7425.39 4.611.15 0.45After treatme nt+*54.68 4.9226.62, +* 4.7423.55 5.12+*22.98+ 4.141.10, +* 0.61+P0.05 vs before treatme nt in Chemotherapy *P0.05 vs after treatme nt inChemotherapy+DC-CIK表4聯(lián)合

18、治療組和對(duì)照組治療前后患者外周血細(xì)胞因子的變化(X S)Table 4 Changes of intra-cellular cytokines in peripheral blood before and after DC-CIK +chemotherapy or chemotherapy (X S)GroupIL-2IL-10IL-12IFN- 丫TNF- aChemotherapy+DC-CIKBefore treatme nt1.52 0.511.88 0.481.65 0.421.64 0.421.65 0.50After treatme nt1.60 0.451.89 0.491.8

19、8* 0.411.94 0.36*1.60 0.50ChemotherapyBefore treatme nt1.57 0.321.73 0.431.75 0.361.78 0.411.68 0.5After treatme nt+1.39 0.341.84 0.501.65 0.38 +1.75 0.401.58 0.47 +P0.05 vs before treatment in Chemotherapy * P0.05 vs before treatment inChemotherapy+DC-CIK 2.3治療前后外周細(xì)胞因子變化比較試驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組的細(xì)胞因子IL-12和IFN

20、- 丫的水平治療后有所上升（P0.05）,IL-10水平治療后無(wú)明顯變化,單純化療組IL-2, IL-12和TNF- a的水平治療后有所下降（P 0.05），詳見(jiàn)表4結(jié)果提示，DC-CIK免疫治療增加患者細(xì)胞因子的水平，增加患者免疫功能。2.4 胃癌患者生活質(zhì)量的評(píng)價(jià)聯(lián)合治療組和對(duì)照組 KPS較治療前評(píng)分提高至少 10分者23例（82.14% ）和16例（57.14%）, 2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x 2=4.139 , P0.05）2.5 DC-CIK 聯(lián)合化療的安全性評(píng)價(jià)28 例患者在 DC-CIK 治療過(guò)程中有 4 例患者出現(xiàn)發(fā)熱，最高溫度達(dá) 39 度，持續(xù)時(shí)間約 12 小時(shí)，給予處理后

21、可消退， 1 例患者出現(xiàn)輕度皮疹，原因不明，給予對(duì)癥處理后緩解，未發(fā) 生其他不良反應(yīng)。3 討論腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和機(jī)體免疫功能息息相關(guān)，我國(guó)胃癌病人診斷時(shí)85%處于晚期 1，晚期胃癌患者本身腫瘤負(fù)荷較重， 免疫功能已較低下， 加上患者經(jīng)過(guò)手術(shù)、 放化療之后免疫功能 進(jìn)一步損傷，這是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因，60%的病人術(shù)后會(huì)出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移2?；熤荒軞缫欢〝?shù)量的腫瘤細(xì)胞， 但是微小殘留病灶的清除依賴于調(diào)動(dòng)并增強(qiáng)自身免疫功 能清除腫瘤細(xì)胞， 免疫治療既能直接殺傷腫瘤細(xì)胞， 又能調(diào)節(jié)免疫功能， 無(wú)明顯毒副反應(yīng) , DC 及 CIK 是該領(lǐng)域極具發(fā)展?jié)摿Φ拿庖呒?xì)胞 ,DC-CIK 已在各種腫瘤中

22、取得一定的療效，但是 在晚期胃癌中運(yùn)用報(bào)道較少。有研究發(fā)現(xiàn)化療后給予免疫治療有1+1 2的效益7 ，基于以上研究我們將化療和DC-CIK聯(lián)合治療應(yīng)用于晚期胃癌患者。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外由多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)而成的對(duì) 多種腫瘤具有殺傷活性的細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞。它是同時(shí)表達(dá) CD3+,CD56+ 的異質(zhì)細(xì)胞群， 兼具 有 T 細(xì)胞特異性殺傷及 NK 細(xì)胞非主要組織相容性復(fù)合體（ MHC ）限制性殺傷能力 8。研 究發(fā)現(xiàn) CIK 細(xì)胞對(duì)耐藥的腫瘤細(xì)胞也有殺傷作用 9,10，這是 CIK 應(yīng)用于已經(jīng)耐藥的晚期胃 癌患者的基礎(chǔ)。 樹(shù)突狀細(xì)胞是目前發(fā)現(xiàn)體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)

23、胞（Antigen-presenting cell APC）,能攝取、加工及提呈抗原，并能刺激初始型T細(xì)胞的活化和增殖。 DC 細(xì)胞能有效呈遞抗原多肽，高表達(dá)共刺激分子和粘附分子，為T 細(xì)胞活化做準(zhǔn)備，分泌大量的抗瘤因子如IL-2 , TNF a與IFN r11,12,13。 DC和CIK共培養(yǎng)可促進(jìn) CIK的體外增殖和成熟，增強(qiáng) CIK 的細(xì)胞毒活性，同時(shí) CIK 也能促進(jìn) DC 的成熟，兩者相互作 用。Marten A等研究發(fā)現(xiàn) CIK可以使DC高表達(dá)CD80,CD86和MHC-I,MHC-II ，促使DC 分泌大量IL-2 , DC可以促進(jìn)CIK高表達(dá)CD28和CD40。Schmidt1

24、4等研究發(fā)現(xiàn) DC-CIK可 降低CIK細(xì)胞群中的免疫抑制 T細(xì)胞（Treg）而增強(qiáng)抗腫瘤活性。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組患者治療后外周血中CD3+,CD4+,CD56+ 細(xì)胞比例和CD4+/CD8+比值較治療前無(wú)明顯變化（P 0.05）,對(duì)照組CD3+,CD4+和CD4+/CD8+的比例治療后明顯下降（P0.05）,說(shuō)明DC-CIK可以增強(qiáng)患者免疫功能。聯(lián)合治療組疾病控制率 達(dá) 78.6%，對(duì)照組疾病控制率達(dá) 53.6% ，兩組疾病控制率的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P0.05）。 聯(lián)合治療組和對(duì)照組 KPS較治療前評(píng)分提高至少10分者23例（82.14% ）和16例（57.14%）,2 組比較

25、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （x 2=4.139， P0.05） ,說(shuō)明 DC-CIK 治療后可以提高患者生存質(zhì) 量。聯(lián)合治療組的細(xì)胞因子IL-12和IFN- y的水平治療后有所上升（P0.05）,對(duì)照組IL-12,IL-2 和 TNF-a 的水平治療后有所下降 （P0.05），TNF-a 、 IL-2、 IL-12 刺激 NK 細(xì)胞或 CTL 的殺瘤活性， 既能抑制腫瘤細(xì)胞增殖又能直接殺傷腫瘤細(xì)胞， 并且能減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移 15,16 。 IL-12 和腫瘤進(jìn)展相關(guān)， 在患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或惡液質(zhì)時(shí)， IL-12 呈最低水平 17，IFN-y 具有較強(qiáng)的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用等。有研究發(fā)現(xiàn)，IFN-

26、y的量與患者疾病進(jìn)展時(shí)間和總生存期成正相關(guān)DC-CIK細(xì)胞在回輸過(guò)程中有6例患者出現(xiàn)發(fā)熱，最高溫度達(dá)39度，持續(xù)時(shí)間約12小時(shí)，給予處理后可消退，1例患者出現(xiàn)輕度皮疹，原因不明，給予對(duì)癥處理后緩解，未發(fā)生 其他不良反應(yīng)。綜上所述DC-CIK聯(lián)合化療治療晚期胃癌具有較好的安全性及有效性。具有較好的臨床推廣價(jià)值。1 Varadhachary G, Ajani JA. Gastric cancer.Clin Adv Hematol Oncol 2005,3(2):118-1242 Ajani JA.Evolving chemotherapy for advaneed gastric cancer.O

27、ncologist 2005,10(3):49-583 Malekzadeh R, Nasseri Moghaddam S, et al. Reduct ion in gastric cancer mortality by sc reening based on serum pepsinogen concentration:a case-control study. Scand J Gastroenter 01.2007,42(6):760-7644 Larmonier N, Fraszczak J, Lakomy D, et al. Killer dendritic cells and th

28、eir potential for cancer immuno therapy. Cancer Immunol Immuno ther 2010， 59:1-115 Rosenberg SA, Restifo NP, Yang JC, et al. Adoptive cell transfer:a clinical path to effe ctive cancer immunotherapyJ.Nat Rev Cancer,2008,8(4):299-3086 Marte n A, Ziske C, Schottker B, et al. In teract ions betwee n de

29、n dritic cells and cytok ine -in duced killer cells lead to an activati on of both populati on sJ. Journal of Immuno therapy,2001,24(6):502 -510.7 Pei Zhou,P ing Lia ng,Baowei dong et al.Phase I cli ni cal study of comb in ati on therapy wi th microwave ablatio n and cellular immuno therapy in hepat

30、ocellular carc ino maJ.Ca ncer Bi ology Therapy,2011,11(5):450-4568 Peng Wang, Jin-pu Yu, Song-yuan Gao , et al. Experimental study on the treatment of intracerebral glioma xenograft with human cytokine-induced killer cells J.Cellular immuno logy,2008,253(1-2):59-65.9李世俊，張連生，柴曄等，樹(shù)突狀細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)

31、對(duì)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞系的殺傷活性J.中華腫瘤雜志，2007,29( 10):733-73710 Niu Q,Wang W,Li Y, et al . Cord blood-derived cytokine-induced killer cells biotherap y comb ined with sec on d-li ne chemotherapy in the treatme nt of adva need solid malig nancie sJ. I nt Immu nopharmacol, 2011, 11(4): 449-456.11 Galluzzi L,Se no villa L,Vacchelli E,et al .De ndritic cell-based in terve ntio ns for cancer th erapy, On cnlmm un ologyJ.2012,1(7):1111-113412 Kalinski P, Ravikumar, Muthuswamy, et al. Dendritic cells in cancer immunotherapy:va ccines and comb in ati on immuno therapiesJ.Expert Rev.Vacci nes,2013,12(3),285-29