抗BP5―BSA多克隆抗體的制備及鑒定

1、 抗BPBSA多克隆抗體的制備及鑒定 法氏囊活性五肽 （ Bursopentin ，BP5） 是從法氏囊中分離 所得的一種活性小肽，氨基酸序列為 CKDVY （ Cys-Lys-Asp-Val-Tyr ）。多克隆抗體是采用傳統(tǒng)的免疫方法， 將抗原物質(zhì)經(jīng)不同的途徑注入動(dòng)物體內(nèi)， 經(jīng)數(shù)次免疫后采取動(dòng)物 血液，分離出血清，獲得的抗血清。本研究以間接 ELISA 測(cè)定兔 抗BP5-BSA多抗血清的抗體效價(jià)并分離純化動(dòng)物血清， 使之能大 批量生產(chǎn)制備， 多克隆抗體在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)的主要意義是獲得高 滴度實(shí)驗(yàn)或高親和力的抗血清， 用于實(shí)驗(yàn)或診斷測(cè)試， 為進(jìn)一步 研究法氏囊BP5小肽在體內(nèi)分布奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，

2、并為新型疫苗佐 劑的研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。 一、材料與方法 1. 實(shí)驗(yàn)材料 2 只雄性家兔（約 2 公斤重）購(gòu)于洛陽(yáng)市塔灣村養(yǎng)殖戶；將 BS5與BSA偶聯(lián)制備免成疫原，委托上?？齐纳锟萍?XX公司 生產(chǎn)。 2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫 將2只家兔分為A對(duì)照組、B實(shí)驗(yàn)組兩組。A組用PBS溶液 進(jìn)行免疫，B組用抗原（BP5-BSA進(jìn)行免疫，待家兔適應(yīng)兩天 后進(jìn)行首次免疫，首免14 d后進(jìn)行二次免疫，二次免疫 14 d后 進(jìn)行三次免疫。 3. 兔抗BP5-BSA多抗血清采集 首免第 7 d ，第 14 d ，二免第 7 d ，二免第 14 d 分別對(duì) A， B兩組的家兔耳緣靜脈采血 1 mL/只。37C恒溫箱內(nèi)

3、放置3h后， 置于臺(tái)式離心機(jī)中，以 4000r/min的速度離心6min，吸取血清 于EP管中，做好標(biāo)記，于-20C冰箱中保存?zhèn)溆?。家兔三免后?7 d，對(duì)A、B兩組的家兔進(jìn)行心臟采血，分離出動(dòng)物血清，保存 于-20C冰箱中備用。 4. 兔抗BP5-BSA多抗血清的抗體含量變化 用間接ELISA的方法分別測(cè)出兔抗 BP5-BSA多抗血清7 d , 14 d , 21 d , 28 d、35 d在450 nm的波長(zhǎng)下各孔的吸光度（OD 值。 5. 硫酸銨鹽析法測(cè)兔抗BP5-BSA多抗血清中IgG的含量 取1 mL血清于試管中，加入1 mL生理鹽水，混勻，然后于 攪拌下逐滴加入 2 mL 飽和硫酸

4、銨溶液，此時(shí)硫酸銨溶液的終飽 和度為溶液 50%。室溫下， 放置 20 min， 3000 r/min 離心 10 min， 棄去上清液，用 1 mL 的生理鹽水將沉淀溶解，再逐滴加入硫酸 銨溶液0.5 mL,此時(shí)硫酸銨溶液的終飽和度為 33%室溫下，放 置20 min，重復(fù)上述第二步過程12次，末次離心后所得沉淀 為蛋白質(zhì)。在最終沉淀物中加入 5 mL生理鹽水做5倍稀釋。再 從稀釋品中取1 mL,加9 mL生理鹽水做10倍稀釋，最終所沉 淀的蛋白質(zhì)的稀釋度50,分光光度計(jì)上讀出 OD直，用生理鹽水 調(diào)零。 蛋白含量(mg/mL = (1.45 X OD280 0.74 X OD260 X 稀

5、？ 度 二、結(jié)果與分析 1. 兔抗BP5-BSA多克隆抗體效價(jià)動(dòng)態(tài)變化 采集免疫家兔第7 d，第14 d，第21 d，第28 d，第35d 的血液， 經(jīng)離心后取其血清， 用間接 ELISA 的方法在酶標(biāo)儀檢測(cè) 其在 450 nm 的吸光度值。在酶標(biāo)儀上對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行檢測(cè)，所讀 的OD450直變化如圖1所示，家兔BP5-BSA多克隆抗體的量隨免 疫天數(shù)的增多而逐漸增加，首免后的 2 周多克隆的含量較少， 而二免后的2周家兔BP5-BSA多克隆抗體的產(chǎn)生速率增加，大 約是首免后的二倍。 對(duì)照組多克隆抗體的量則基本沒有變化。 實(shí) 驗(yàn)組與對(duì)照組相比較說明，免疫過BP5-BSA的家兔，家兔體內(nèi)抗 體的含量增加，說明BP5-BSA具有良好的免疫原性。 2. 硫酸銨鹽析法測(cè)兔抗 BP5-BSA多抗血清中IgG質(zhì)含量 取硫酸銨鹽析法所鹽析出的IgG，做50倍稀釋，在紫外分 光光度計(jì)上，讀出OD直計(jì)算得： 三、討論 本次試驗(yàn)通過人工合成 BP5-BSA （血藍(lán)蛋白）作為免疫原， 并制定免疫程序，經(jīng)過首免、二免及三免后獲得兔抗 BP5-BSA多 克隆抗體；通過間接ELISA的方法測(cè)定兔抗BP5-BSA多克隆抗體 的效價(jià)，間接ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血清中兔抗BP5-BSA多克隆 抗體的量隨免疫天數(shù)的增加而增多；用硫酸銨鹽析對(duì)兔抗 BP5-BSA