我做PCR一年的總結(jié)

1、RNA 沉淀一次， 后 7500rmpRNA 沉淀變透明） 。注意不 20ul 的 DEPC 水溶解，在30 分鐘，此時(shí) 。再在管中加定要控干多余酒精 ，這一步很重要， 因?yàn)槌樘岙a(chǎn)物中如果有酒精可能會(huì)影響你 RT-PCR, Real-Time PCR 等操作。逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription )今天到 PCR 技術(shù)討論版逛逛，看到 pgming2004 的精華原創(chuàng)貼，下載附件后讀了一遍佩服樓主 善于總結(jié)的同時(shí)也想補(bǔ)充一點(diǎn)個(gè)人不同的看法。RNA 抽提( RNA Extraction ) 原文：三，抽提步驟1 勻漿化作用取約 100mg 鼠腦組織放于玻璃研磨器內(nèi)， 先加 0.2m

2、l 的 Trizol 溶液， 研磨組織后， 倒入 1.5mlEP 管中，再在研磨器內(nèi)加入 0.8ml 的 Trizol 溶液洗，后全部再倒入 EP 管中。顛倒混勻 10 下，室溫 靜置 5 分鐘。2 分離階段每 1mlTrizol 中加 0.2ml 氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管 15 秒，使其充分混勻，室溫靜 置 5 分鐘。后 12000rmp 離心 15 分鐘。3 RNA 的沉淀將上層水相轉(zhuǎn)入新的 1.5mlEP管中（約400-500ul ）,加入0.5ml異丙醇，混勻后放于 -20 C中1 小時(shí)，后 12000rmp 離心 10 分鐘。4 RNA 的洗脫 小心倒掉上清， 留取沉淀。

3、加 1ml 現(xiàn)配的 75% 的乙醇（預(yù)冷）振蕩洗滌 離心 5 分鐘。5 RNA 的再溶解 小心倒掉上清，取沉淀置超凈工作臺(tái)開風(fēng)機(jī)吹干（約 能讓 RNA 沉淀完全干燥（會(huì)極大地降低它地可溶性）55-60 C下孵育10分鐘助溶。6， RNA 的保存 提取的RNA保存于-70 C超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄。抽提步驟中1. 勻漿化，我一般將組織直接放入 1ml Trizol 后打碎組織，分裝到 EP 管2. 分離， 個(gè)人認(rèn)為人手用力搖晃和用 機(jī)器最大速度 vortex 效果差不多， 但是人手搖晃有點(diǎn)辛苦， 特別是 RNA 含量少的組織（例如人椎間盤組織） ，抽提需要大量組織次數(shù)也會(huì)隨之增加（常為

4、15-20 次）這是機(jī)器 vortex 的優(yōu)勢(shì)便顯示出來。3. RNA沉淀，經(jīng)過許多次抽提RNA，我總結(jié)加入異丙醇后可以將盛有樣品的EP管置于-20 （冰箱過夜 ，這樣可以大大提高 RNA 析出的效率。4. RNA洗脫，倒掉EP管中上清后直接加入新配制 80%酒精（是否預(yù)冷不是十分重要， 但是也不 要加熱酒精） ，隨即倒出酒精再重復(fù)上述操作 2 次。倒入酒精清洗 RNA 沉淀時(shí)可不進(jìn)行振蕩， 個(gè) 人認(rèn)為振蕩離心可能丟失少許 RNA。5. RNA 再溶解， 接下來的RT 步驟原文三，用ssm逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行 RT （20ul體積）1， 準(zhǔn)備 0.65ml 的 EP 管冰上操作：在 EP管中加入10u

5、lDEPC水，1ul引物，65 C水浴5分鐘后，立刻 0 C冰水浴至少1分鐘。 短暫離心后， 冰上操作：加入4ul 5 FiTst-Strand Buffer1ul模板RNA, luldNTP，短暫離心。3,4,1ul SS m逆轉(zhuǎn)錄酶。5,1ul 0.1MDTT , 1ul RNAse Inhibitor6,7,8,短暫離心50 C水浴60分鐘進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。70 C水浴15分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶 -20 C保存，或立即進(jìn)行 PCRo用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行 RT （10ul體積）準(zhǔn)備0.65mlEP管加入4.5ul DE PC 水，1ul引物， 稍離心，100 C沸水裕1min加入 0.5uldNTP

6、, 2ul 5 Buffer ,稍離心，封口膜封口，42 C水浴100 C沸水裕3min滅活1ul模板RNA1ul AMV逆轉(zhuǎn)錄酶90 C作 RTRT步驟1.首先檢測(cè) RNA樣品的濃度，并稀釋至10ng/ul以供RT-PCR ( RT-PCR 需要 100ngRNA ,10ulX10ng/ul )2.10X RT Buffer 2ul25XdNT P mix 0.8ul10X RT Ran dom Primer or Oligo DT 2ulMultiscri pe Reverse Tan scri ptase 1ulRNAse In hibitor 1ulDEPC 水 3.2ulRNA 樣品

7、 10ul3.循環(huán)為25 C 1分鐘，37 C 12分鐘，85 C秒。聚合酶鏈反應(yīng)（P CR）原文四，PCR步驟1 , 準(zhǔn)備100ul EP管2 ,依次在管中加入：（50ul反應(yīng)體系）ddH2O 37.5ul? x10mM dNT P 1ul?x10 XPCR buffer 5ul? x25mM Mgcl2(加之前要搖勻)3ul X上游引物1ul X下游引物1ul X模板 cDNA 1ul稍離心100 C沸水浴1分鐘趁熱加入Tag酶0.5ul （冰上操作）再加入50ul液體石蠟封閉7，10000rmp 離心 1 分鐘8， PCR 條件1min94C50sec1min30sec40個(gè)循環(huán)，然后

8、72 C 10min完后4C保溫。58C72C進(jìn)行9， 10000rmp 離心 5minPCR1.PCR 反應(yīng)需要 10-100ng DNA 其稀釋成 0.1ug/ul 后再向 50ul10，將下層水相轉(zhuǎn)入新的0.65mlEP管中，-20 C保存。模板， 50mM dNTP 0.5ul, Taq 酶 0.25-0.5ul 足夠， 引物我常將 反應(yīng)體積中加 1ul 即可 。2. ddH2O 39ul 10mM dNTP 2.5ulPrimers 1ul each 10X PCR Buffer 5ulTaq Enzyme 0.5ulDNA Template 1ul3.PCR 的條件，我一般使用C

9、45秒C 45秒C 1分鐘 /1Kb30 次左右94 5572 循環(huán)Tm 再調(diào)節(jié)溫度。當(dāng)然萬一做不出來，參考引物的 電泳鑒定 原文 3, 試劑配制和準(zhǔn)備：（1） 電泳緩沖液（ TAE）：蒸餾水中溶解 121g Tris 堿，加入 28.55ml 冰乙酸和 50ml 0.5ml/L 500ml ，室溫保存。先配制0.5mol/L,PH8.0 的EDTA溶液：將37.2g EDTA-Na加入160ml蒸餾水中，在攪拌器上劇 烈攪拌。在用 NaOH 調(diào)節(jié)溶液 PH 值至 8.0（約需 4gNaOH ）。用蒸餾水定容至 200ml 。后送至高 壓滅菌。室溫保存。再配制 50XTAE 溶液：在 400m

10、lEDTA 溶液，再加蒸餾水定容至（ 2 ）瓊脂糖溶液（ 1.0）：500ml ，取 50ml 溶解 0.5g 瓊脂糖，電爐上煮至沸騰，溶化的瓊50 XTAE溶液取10ml，稀釋成脂物冷卻至60 C左右時(shí)加入10mg/ml EB 5ul ，充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的電泳 板中，在室溫下放置 45min 左右后進(jìn)行電泳。（ 3 ）溴化乙錠（ EB）（10mg/ml ）：在 20ml 水中加入 0.2g 溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時(shí)。然后用鋁箔包裹容器或?qū)⑷芤恨D(zhuǎn)移至棕色 瓶中，室溫保存。（4 ）加樣緩沖液（ Loading Buffer ）一般為 6XLoading Buffer電泳鑒定1.針對(duì)大分子產(chǎn)物可以適當(dāng)降低膠的濃度0.7% ， 0.8% 都可以， 產(chǎn)物分子小也可提高膠的濃度至1.2% ， 1.4% 。2. 對(duì)于 EB， 我首先將其稀釋為 1ug/ul ，每 100ml 膠加入 10ul 1ug/ul EB 。3. 關(guān)于電壓， 一般來說根據(jù)膠的長(zhǎng)度確定， 80V ，但是電壓要求我認(rèn)為不是十分嚴(yán)格，以上是我自己的一點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)， 也希望大家將自己抽提 學(xué)習(xí)進(jìn)步！1cm 膠 - 10V 電壓。 膠長(zhǎng)度為 8cm 則設(shè)定電