探索臨床微生物學檢驗技術

1、第第3 3章章 臨床微生物學臨床微生物學 檢驗技術檢驗技術 探索臨床微生物學檢驗技術 請回答一下問題 哪些細菌適合直接涂片檢查？ 直接涂片檢查能為臨床提供哪些信息？ 細菌分離培養(yǎng)和鑒定常用的培養(yǎng)基有哪些 特點？ 與分離培養(yǎng)相比，應用分子生物學方法檢 測有哪些優(yōu)缺點？ 臨床微生物檢驗的任務? 探索臨床微生物學檢驗技術 一、細菌形態(tài)學檢驗一、細菌形態(tài)學檢驗 不染色標本 檢查生活狀態(tài)下細菌的動力及運動狀況 壓滴法和懸滴法 病原菌初步鑒定：霍亂弧菌制動試驗 染色標本 革蘭染色 抗酸染色 熒光染色 鞭毛染色 莢膜染色 特殊染色：異染顆粒、芽胞染色、墨汁染色 探索臨床微生物學檢驗技術 一、細菌形態(tài)學檢驗一

2、、細菌形態(tài)學檢驗 （一）制片 1.涂片 取潔凈載玻片一張，用標記筆一分為二，用 接種環(huán)取生理鹽水2環(huán)，分別置于玻片兩端，接種環(huán) 滅菌后，取金黃色葡萄球菌斜面培養(yǎng)物少許與鹽水混 勻，并涂成均勻薄膜涂片。接種環(huán)滅菌后以同樣方法 再取大腸埃希菌少許，與另一端生理鹽水混勻后涂成 均勻薄膜。如用液體材料，如痰、尿液、膿汁等可直 接涂片，不必加生理鹽水。 探索臨床微生物學檢驗技術 2.干燥 涂片最好在室溫下自然干燥，必要時可 將標本面向上，小心間斷地在弱火高處烘干，但 切勿緊靠火焰將涂膜烤枯。 3.固定 涂片干燥后，將標本片在酒精燈上快速 的來回通過三次，共約2s3s，注意溫度不可太高， 以涂片涂膜的反面

3、觸及皮膚覺輕微燙覺即可。 固定目的：殺死細菌；使菌體與玻片粘附 較牢，在染色時不致被染液和水沖掉；菌體蛋 白變性易著色。 探索臨床微生物學檢驗技術 涂片涂片 干燥干燥 固定固定 染色染色 鏡檢鏡檢 探索臨床微生物學檢驗技術 （二）革蘭染色法（二）革蘭染色法 1.原理原理 （1）革蘭陽性細菌細胞壁結構較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)）革蘭陽性細菌細胞壁結構較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì) 含量少，乙醇不易滲入；革蘭陰性菌細胞壁結構較疏松，肽聚含量少，乙醇不易滲入；革蘭陰性菌細胞壁結構較疏松，肽聚 糖層少，脂質(zhì)含量多，乙醇易滲入。糖層少，脂質(zhì)含量多，乙醇易滲入。 （2）革蘭陽性菌的等電點低，革蘭陰性菌的等電點較高

4、，）革蘭陽性菌的等電點低，革蘭陰性菌的等電點較高， 在相同在相同pH條件下，革蘭陽性菌所帶負電荷比革蘭陰性菌多，與條件下，革蘭陽性菌所帶負電荷比革蘭陰性菌多，與 帶正電荷的結晶紫染料結合較牢固不易脫色。帶正電荷的結晶紫染料結合較牢固不易脫色。 （3）革蘭陽性菌細胞內(nèi)含有大量核糖核酸鎂鹽，可與結晶）革蘭陽性菌細胞內(nèi)含有大量核糖核酸鎂鹽，可與結晶 紫和碘牢固的結合成大分子復合物，不易被乙醇脫色；而革蘭紫和碘牢固的結合成大分子復合物，不易被乙醇脫色；而革蘭 陰性菌細胞內(nèi)含極少量的核糖核酸鎂鹽，吸附染料量少，形成陰性菌細胞內(nèi)含極少量的核糖核酸鎂鹽，吸附染料量少，形成 的復合物分子也較小，故易被乙醇脫色

5、。的復合物分子也較小，故易被乙醇脫色。 探索臨床微生物學檢驗技術 2. 染色方法 （1）標本涂片、干燥和固定。 （2）染色：在已固定細菌涂片上滴加結晶紫染液數(shù) 滴，室溫作用1min，用細流水輕輕沖洗，甩去積水。 再滴加碘液數(shù)滴，室溫作用1min，沖洗。滴加95%酒 精數(shù)滴，輕輕搖動玻片幾秒鐘，使均勻脫色，然后斜 持玻片，使脫掉的染料隨酒精流去，再滴加酒精，直 到流下的酒精無色為止（約需30s），立即用細流水將 酒精沖掉。再滴加稀釋石炭酸復紅液復染約30s后用細 流水沖洗。 （3）標本染色后，晾干或用吸水紙吸干，滴香柏油 后用油鏡觀察。 探索臨床微生物學檢驗技術 探索臨床微生物學檢驗技術 3.結

6、果 紫色為革蘭陽性菌，紅色為革蘭陰性菌。 探索臨床微生物學檢驗技術 （二）抗酸染色 1.原理 分枝桿菌細胞壁含脂質(zhì)較多，其中主要成分 為分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色時與石炭 酸復紅結合牢固，能抵抗酸性乙醇的脫色作用， 因此抗酸菌能保持復紅的顏色，達到染色目的。 探索臨床微生物學檢驗技術 2.方法 （1）萋納石炭酸復紅染色，加溫促使菌體著 色5min； （2）流水沖洗，3%鹽酸酒精脫色13min； （3）呂氏美藍復染30s。 探索臨床微生物學檢驗技術 探索臨床微生物學檢驗技術 3.結果結果 未脫色細菌呈紅色為抗酸性細菌未脫色細菌呈紅色為抗酸性細菌,脫色經(jīng)復染脫色經(jīng)復染 呈藍色的細菌為非抗酸性細

7、菌。呈藍色的細菌為非抗酸性細菌。 探索臨床微生物學檢驗技術 （三）鞭毛染色 1.原理 細菌的鞭毛能被堿性復紅酒精飽和溶液著色， 是因為在染色過程中隨著酒精的蒸發(fā)其染料 沉積在鞭毛上，使鞭毛著色。堿性復紅作為 主要染料，而丹寧酸為媒染劑。 探索臨床微生物學檢驗技術 2.方法 （1）采用點種法接種的變形桿菌（或其他鞭毛菌），近 離接種點的菌，鞭毛細，菌體較短；遠離接種點的菌，鞭 毛粗，菌體長，用無菌接種環(huán)取遠離接種點的菌混懸于盛 有無菌蒸溜水的平皿內(nèi)，不要研磨以免鞭毛脫落，置室溫 放置1015min，使鞭毛膨大。 （2）用毛細滴管將菌液滴于潔凈的玻片上，緩慢傾斜玻 片任菌液流開，始之成為均勻薄膜，

8、將玻片置37溫箱內(nèi)， 任其自然干燥，切勿用火焰固定。 （3）在干燥標本片上滴加鞭毛染色液12滴，使覆蓋于 薄膜上，作用12min后輕輕用水沖，干后鏡檢觀察。 探索臨床微生物學檢驗技術 3.結果 菌體染成紅色（或深紫色），鞭毛染成淡紅色（或 淡紫色），染色時間越長，鞭毛越粗。 探索臨床微生物學檢驗技術 （四）莢膜染色 1.原理 莢膜為細菌細胞壁外圍的黏液層，對染料的 親和力很低，用一般染色不易著色，必須通過 莢膜染色方法或襯托染色，方能清晰辨認出莢 膜。 2.方法 用有莢膜的細菌培養(yǎng)物涂片，火焰固定，固 定標本后加1%結晶紫染液，室溫保持1min后， 倒去染液，然后用20%硫酸銅水溶液沖洗染液，

9、 勿水洗。待干后鏡檢觀察。 探索臨床微生物學檢驗技術 3.結果 菌體為深紫色，莢膜為無色或淡紫色。 探索臨床微生物學檢驗技術 （四）墨汁染色 1.原理 2.方法 探索臨床微生物學檢驗技術 3.結果 菌體為深紫色，莢膜為無色或淡紫色。 探索臨床微生物學檢驗技術 （一）培養(yǎng)基分類 成分 用途 形態(tài) 血平板 巧克力血平板 探索臨床微生物學檢驗技術 伊紅美藍平板 麥康凱平板 SS平板 M-H平板 探索臨床微生物學檢驗技術 培養(yǎng)基的選擇 根據(jù)標本來源和可能存在的病原菌 血平板 巧克力血平板 中國藍平板或伊紅亞甲藍平板 麥康凱平板 SS瓊脂 堿性瓊脂或TCBS瓊脂 血液增菌培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯 探索臨床微生物

10、學檢驗技術 分離培養(yǎng) 細菌的分離 平板劃線分離法 斜面接種法 液體接種法 穿刺接種法 傾注培養(yǎng)法 涂布接種法 探索臨床微生物學檢驗技術 二、分離培養(yǎng) （一）劃線接種（一）劃線接種 1.方法 斜線法 、曲線法 、方格法 、放射法 、四格法。 斜線法 探索臨床微生物學檢驗技術 曲線法 方格法 探索臨床微生物學檢驗技術 放射法 四格法 探索臨床微生物學檢驗技術 探索臨床微生物學檢驗技術 分離培養(yǎng) 細菌培養(yǎng)方法 需氧培養(yǎng)法 二氧化碳培養(yǎng)法 厭氧培養(yǎng)法 探索臨床微生物學檢驗技術 三、生化反應三、生化反應 酶系統(tǒng) 對底物的分解能力 代謝產(chǎn)物 掌握各種生化反應的原理和應用是細菌鑒定的基礎 探索臨床微生物學檢

11、驗技術 三、生化反應三、生化反應 （一）碳水化合物的代謝試驗（一）碳水化合物的代謝試驗 1.糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗 原理原理：不同種類細菌含有發(fā)酵不同糖（醇、苷）類的酶，因而 對各種糖（醇、苷）類的代謝能力也有所不同，即使能分解某 種糖（醇、苷）類，其代謝產(chǎn)物可因菌種而異。檢查細菌對培 養(yǎng)基中所含糖（醇、苷）降解后產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣的能力，可用 以鑒定細菌種類。 方法方法：在基礎培養(yǎng)基中（如酚紅肉湯基礎培養(yǎng)基pH7.4）加入 0.51.0（w/v）的特定糖（醇、苷）類。所使用的糖（醇、苷） 類有很多種。將待鑒定的純培養(yǎng)細菌接種入試驗培養(yǎng)基中，置 35孵育箱內(nèi)孵育數(shù)小時后，觀察

12、結果;若用微量發(fā)酵管，或要 求培養(yǎng)時間較長時。 探索臨床微生物學檢驗技術 結果：能分解糖（醇、苷）產(chǎn)酸的細菌，培 養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應（如酚紅變?yōu)辄S 色），產(chǎn)氣的細菌可在小倒管（Durham小管） 中產(chǎn)生氣泡，固體培養(yǎng)基則產(chǎn)生裂隙。不分解 糖則無變化。 應用：是鑒定細菌最主要和最基本的試驗， 特別對腸桿菌科細菌的鑒定尤為重要。 探索臨床微生物學檢驗技術 2 2葡萄糖代謝類型鑒別試驗葡萄糖代謝類型鑒別試驗 (O-F(O-F試驗）試驗） 原理原理：細菌在分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參 加的，稱為氧化型；能進行無氧降解的為發(fā)酵型；不分解 葡萄糖的細菌為產(chǎn)堿型。發(fā)酵型細菌無論在有氧或無氧環(huán) 境

13、中都能分解葡萄糖，而氧化型細菌在無氧環(huán)境中則不能 分解葡萄糖。本試驗又稱氧化發(fā)酵（O/F或HughLeifson， HL）試驗，可用于區(qū)別細菌的代謝類型。 方法方法：挑取少許純培養(yǎng)物（不要從選擇性平板中挑?。?接種1支HL培養(yǎng)管中，從培養(yǎng)基表面穿刺到其底部。置35 孵箱孵育48h以上。 探索臨床微生物學檢驗技術 結果結果： 培養(yǎng)基均不產(chǎn)酸（顏色不變）為陰性；培養(yǎng) 基表面和底部都產(chǎn)酸（變黃）為發(fā)酵型；培養(yǎng)基表面 變?yōu)樯钏{色為產(chǎn)堿型；培養(yǎng)基表面變黃、底部不色變 為氧化型。 1為產(chǎn)堿型 2為氧化型 3為發(fā)酵型 應用應用：主要用于腸桿菌科與其他非發(fā)酵菌的鑒別。 腸桿菌科、弧菌科細菌為發(fā)酵型，非發(fā)酵菌為

14、氧化型 或產(chǎn)堿型。也可用于鑒別葡萄球菌（發(fā)酵型）與微球 菌（氧化型）。 探索臨床微生物學檢驗技術 3甲基紅（甲基紅（MR）試驗）試驗 原理：原理：某些細菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮 酸，丙酮酸進一步被分解為甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培 養(yǎng)基pH下降至4.5以下時，加入甲基紅指示劑呈紅色。如細 菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進一步轉化為其他物 質(zhì)（如醇、醛、酮、氣體和水），培養(yǎng)基pH在 5.4以上， 加入甲基紅指示劑呈桔黃色。 方法方法：將待試菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35 孵育4896h后，于5ml培養(yǎng)基中滴加56滴甲基紅指示劑， 立即觀察結果。 探索臨床微生物學檢驗技術 結果判

15、定：呈現(xiàn)紅色者為陽性，桔黃色為陰性，桔 紅色為弱陽性。 應用：常用于腸桿菌科內(nèi)某些種屬的鑒別，如大腸 埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性，后者為陰性。腸 桿菌屬和哈夫尼亞菌屬為陰性，而沙門菌屬、志賀菌 屬、枸櫞酸桿菌屬和變形桿菌屬等為陽性。 探索臨床微生物學檢驗技術 4-半乳糖苷酶試驗（半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗）試驗） 原理：乳糖發(fā)酵過程中需要乳糖通透酶和半乳糖苷酶 才能快速分解。有些細菌只有半乳糖苷酶，因而只能遲緩 發(fā)酵乳糖，所有乳糖快速發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的細菌均可快速 水解鄰硝基酚-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-D- galactopyranoside,ONPG）而生成黃色的鄰硝基

16、酚。用于枸 櫞酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別。 方法：將待試菌接種于ONPG肉湯中，35水浴或孵箱孵 育1824h，觀察結果。 探索臨床微生物學檢驗技術 結果：呈現(xiàn)亮黃色為陽性，無色為陰性。 探索臨床微生物學檢驗技術 應用：可用于遲緩發(fā)酵乳糖細菌的快速鑒 定，本法對于迅速及遲緩分解乳糖的細菌均 可短時間內(nèi)呈現(xiàn)陽性。埃希菌屬、枸櫞酸桿 菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌 屬和腸桿菌屬等均為試驗陽性，而沙門菌屬、 變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性。 探索臨床微生物學檢驗技術 5VP試驗 原理：測定細菌產(chǎn)生乙酰甲基甲醇的能力。某些細菌如產(chǎn) 氣腸桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進一步脫羧

17、形成 乙酰甲基甲醇。在堿性條件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙 酰，進而與培養(yǎng)基中的精氨酸等含胍基的物質(zhì)結合形成紅色 化合物。即V-P試驗陽性。 方法：將待檢菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35孵 育2448h，加入50g/L萘酚（95乙醇溶液）0.6ml，輕 輕振搖試管，然后加0.2ml 400g/L KOH，輕輕振搖試管30s至 1min，然后靜置觀察結果。 探索臨床微生物學檢驗技術 結果：紅色者為陽性，黃色或類似銅色為陰性 探索臨床微生物學檢驗技術 應用：主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌 的鑒別。本試驗常與MR試驗一起使用，一般 情況下，前者為陽性的細菌，后者常為陰性， 反之亦然。 探索臨床微

18、生物學檢驗技術 6膽汁七葉苷水解試驗膽汁七葉苷水解試驗 原理：在10%40膽汁存在下，測定細菌水解 七葉苷的能力。七葉苷被細菌分解生成的七葉素， 七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子發(fā)生 反應形成黑色化合物。 方法：將被檢菌接種于膽汁七葉苷培養(yǎng)基中， 35孵育1824h后，觀察結果。 結果：培養(yǎng)基完全變黑為陽性，不變黑為陰性。 應用：主要用于鑒別腸球菌與其他鏈球菌的區(qū) 別，以及腸桿菌科的某些種、某些厭氧菌（如脆 弱擬桿菌等）的初步鑒別。腸球菌本試驗為陽性。 探索臨床微生物學檢驗技術 （二）細菌對于蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗細菌對于蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗 1.明膠液化試驗明膠液化試驗 原理：某

19、些細菌可產(chǎn)生一種胞外酶-明膠酶， 能使明膠分解為氨基酸，從而失去凝固力，半 固體的明膠培養(yǎng)基成為流動的液體。 方法：將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，于 22培養(yǎng)7d，逐日觀察結果。若用35孵育， 因明膠在此溫度下自行液化，故在觀察結果前， 先置4冰箱內(nèi)30min，再看結果。 探索臨床微生物學檢驗技術 結果：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性。 應用：腸桿菌科細菌的鑒別，如沙雷菌、 普通變形桿菌、奇異變形桿菌、陰溝桿菌等 可液化明膠，而其他細菌很少液化明膠。有 些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等也 能液化明膠。另外多數(shù)假單胞菌也能液化明 膠。 探索臨床微生物學檢驗技術 陰性 陽性 探索臨床微生物學檢驗技術

20、2.吲哚（靛基質(zhì)）試驗吲哚（靛基質(zhì)）試驗 原理：某些細菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨 水中的色氨酸生成吲哚（靛基質(zhì)），當加入吲哚 試劑（對二甲氨基苯甲醛）后則形成紅色的玫瑰 吲哚。 培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基。 方法：將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中，于35 培養(yǎng)2448h，沿試管壁慢慢加入吲哚試劑。 結果：于兩者液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽性，無 色為陰性。 應用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。 探索臨床微生物學檢驗技術 探索臨床微生物學檢驗技術 3.硫化氫試驗硫化氫試驗 原理：某些細菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸 （如胱氨酸、半胱氨酸）產(chǎn)生硫化氫，硫化氫 遇鉛或亞鐵離子則形成黑褐色的硫化鉛或硫化 鐵沉淀。此試驗

21、可間接檢測細菌是否產(chǎn)生硫化 氫。 培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基。 方法：將待檢菌穿刺接種于醋酸鉛培養(yǎng)基，于 35培養(yǎng)2448h觀察結果。 探索臨床微生物學檢驗技術 結果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮浴?應用：主要用于腸桿菌科中屬及種的鑒別。 如沙門菌屬、愛德華菌屬、亞利桑那菌屬、 枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬細菌，絕大多數(shù) 硫化氫陽性，其他菌屬陰性。沙門菌屬中也 有硫化氫陰性菌種。 探索臨床微生物學檢驗技術 探索臨床微生物學檢驗技術 4.尿素分解試驗尿素分解試驗 原理：某些細菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大 量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性。 培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基。 方法：將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基，于35培養(yǎng)18

22、24h觀察結果。 結果：培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽性，不 變?yōu)殛幮浴?應用：主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細菌的鑒定。 奇異變形桿菌和普通變形桿菌脲酶陽性。另外雷氏普 羅威登菌和摩根菌為陽性，而斯氏和產(chǎn)堿普羅威登菌 陰性。 探索臨床微生物學檢驗技術 陽性陰性 陰性 探索臨床微生物學檢驗技術 5.苯丙氨酸脫氨酶試驗苯丙氨酸脫氨酶試驗 原理：某些細菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯 丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸，加入氯化鐵試 劑后產(chǎn)生綠色反應。 培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基。 方法：將被檢菌濃厚接種于苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng) 基斜面上，于35培養(yǎng)1824h，滴加10三氯化 鐵試劑34滴，自斜面上方流下。 探

23、索臨床微生物學檢驗技術 結果：出現(xiàn)綠色為陽性。應立即觀察結果，延 長反應時問會引起褪色。 加氯化鐵試劑 出現(xiàn)綠色為陽性 探索臨床微生物學檢驗技術 應用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。變形桿 菌屬、普羅威登斯菌屬和摩根菌屬細菌均為陽性， 腸桿菌種中其他細菌均為陰性。 探索臨床微生物學檢驗技術 6.氨基酸脫羧酶試驗氨基酸脫羧酶試驗 原理：具有氨基酸脫羧酶的細菌，能分解氨基酸使其脫 羧生成胺（賴氨酸尸胺，鳥氨酸腐胺，精氨酸精胺） 和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿。使指示劑顯示出來。 培養(yǎng)基：氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸對照培養(yǎng)基。 方法：將被檢菌分別接種于賴氨酸（或鳥氨酸或精氨酸） 培養(yǎng)基和氨基酸對照培養(yǎng)基中，

24、并加入無菌液體石蠟或礦 物油，于35培養(yǎng)14d，每日觀察結果。 探索臨床微生物學檢驗技術 結果：孵育后，對照管應呈黃色，測定管呈紫色 （指示劑為溴甲酚紫）為陽性；若測定管呈黃色為陰 性。若對照管呈現(xiàn)紫色則試驗無意義，重新做試驗。 氨基酸 對照 鳥氨酸賴氨酸 鳥氨酸為 陽性 賴氨酸為 陰性 氨基酸 對照 探索臨床微生物學檢驗技術 應用：主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。如 沙門菌屬中除傷寒和雞沙門菌外，其余沙門 菌的賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶均為陽性。志賀 菌屬除宋內(nèi)和鮑氏志賀菌外，其他志賀菌均 為陰性。 探索臨床微生物學檢驗技術 （三）碳源和氮源利用試驗碳源和氮源利用試驗 1.枸櫞酸鹽利用試驗枸櫞酸鹽利用

25、試驗 原理：某些細菌能以銨鹽為唯一氮源，并且 利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源，可在枸櫞酸鹽培 養(yǎng)基上生長，分解枸櫞酸鹽，使培養(yǎng)基變堿性。 培養(yǎng)基：枸櫞酸鹽培養(yǎng)基。 方法：將被檢菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基，于 35培養(yǎng)14d，每日觀察結果。 探索臨床微生物學檢驗技術 結果：培養(yǎng)基中的溴 麝香草酚蘭指示劑由淡 綠色變?yōu)樯钏{色為陽性； 不能利用枸櫞酸鹽作為 碳源的細菌，在此培養(yǎng) 基上不能生長，培養(yǎng)基 則不變色，為陰性。 探索臨床微生物學檢驗技術 應用：用于腸桿菌科中菌屬間的鑒定。在 腸桿菌科中埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌 屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門菌屬、克雷 伯菌屬通常為陽性。 探索臨床微生物學檢驗技術 2

26、.丙二酸鹽試驗丙二酸鹽試驗 原理：丙二酸鹽是三羧酸循環(huán)中琥珀酸脫氫酶的抑制劑。 能否利用丙二酸鹽，也是細菌鑒定中的一個鑒別性特征。許 多微生物代謝有三羧酸循環(huán)，而琥珀酸脫氫是三羧酸循環(huán)的 一個環(huán)節(jié)，丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶，與丙二酸不 被分解，所以琥珀酸脫氫酶被占據(jù)，不能釋放出來催化琥珀 酸脫氫反應，抑制了三羧酸循環(huán)。 培養(yǎng)基：丙二酸鹽培養(yǎng)基 接種：用幼齡菌種接種測定培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基，于適溫 培養(yǎng)12d，觀察培養(yǎng)基變色情況。 觀察結果：如測定培養(yǎng)基生長并變藍色，表示可利用丙二 酸鹽，為陽性結果；如測定培養(yǎng)基未變色，則為陰性，即不 利用丙二酸鹽。 探索臨床微生物學檢驗技術 2.丙二酸鹽利

27、用試驗丙二酸鹽利用試驗 （1）原理：有的細菌可利用丙二酸鹽作為唯一碳源， 將丙二酸鹽分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿。 （2）培養(yǎng)基：丙二酸鹽培養(yǎng)基。 （3）方法：將被檢菌接種于上述培養(yǎng)基，35培養(yǎng) 2448h后觀察結果。 （4）結果：培養(yǎng)基由淡綠色變?yōu)樯钏{色為陽性，顏色 無變化為陰性。 （5）應用：腸桿菌科中屬間及種的鑒別。克雷伯菌屬 為陽性，枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬中有 些菌種也呈陽性，其他菌屬均為陰性。 探索臨床微生物學檢驗技術 （四）氧化酶試驗氧化酶試驗 原理：原理：氧化酶（細胞色素氧化酶）是細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最 終呼吸酶。具有氧化酶的細菌，首先使細胞色素C氧化，再由氧 化型

28、細胞色素C使對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物。 試劑：試劑：1%鹽酸四甲基對苯二胺或1%鹽酸二甲基對苯二胺。 方法：方法： 1.菌落法 直接滴加試劑于被檢菌菌落上。 2.濾紙法 取潔凈濾紙一小塊，沾取菌少許，然后加試劑。 3.試劑紙片法 將濾紙片浸泡于試劑中制成試劑紙片，取菌涂 于試劑紙上。 探索臨床微生物學檢驗技術 結果：結果：細菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈（二甲基 對苯二胺鹽酸鹽為紫紅色，四甲基對苯二胺鹽酸鹽 為藍色）為陽性。分別以銅綠假單胞菌和大腸 埃希菌作為陽性和陰性對照。 應用：應用：主要用于腸桿菌科細菌與假單胞菌 的鑒別，前者為陰性，后者為陽性。奈瑟菌 屬、莫拉菌屬細菌也呈陽性反應。

29、 探索臨床微生物學檢驗技術 （五）觸酶試驗（五）觸酶試驗 原理：原理：具有過氧化氫酶的細菌，能催化過氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼 而形成分子氧出現(xiàn)氣泡。 試劑：試劑：3%過氧化氫溶液。 方法：方法：取菌落置于潔凈的試管內(nèi)或玻片上，然后加3%過氧化氫數(shù)滴；或 直接滴加3%過氧化氫于不含血液的細菌培養(yǎng)物中，立即觀察結果。 結果：結果：有大量氣泡產(chǎn)生者為陽性。不產(chǎn)生氣泡者為陰性。 應用：應用：革蘭陽性球菌中，葡萄球菌和微球菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，而鏈球 菌屬為陰性，故此試驗常用于革蘭陽性球菌的初步分群。 探索臨床微生物學檢驗技術 探索臨床微生物學檢驗技術 （六）硝酸鹽還原試驗（六）硝酸鹽還原試驗 原理：原

30、理：硝酸鹽還原反應包括兩個過程：一是在合成過程中，硝酸鹽還原為 亞硝酸鹽和氨，再由氨轉化為氨基酸和細胞內(nèi)其他含氮化合物；二是在分解 代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。能 使硝酸鹽還原的細菌從硝酸鹽中獲得氧而形成亞硝酸鹽和其他還原性產(chǎn)物。 但硝酸鹽還原的過程因細菌不同而異，有的細菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽， 如大腸埃希菌；有的細菌則可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨；有的細菌 能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮，如假單胞菌等。硝酸鹽還原試驗系測定還 原過程中所產(chǎn)生的亞硝酸。 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：硝酸鹽培養(yǎng)基。 試劑：試劑：甲液（對氨基苯磺酸0.8g+5molL醋酸100ml；乙液（-奈胺 0.5g+5mol/L醋酸100ml）。 方法：方法：被檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，于35培養(yǎng)14d，將甲、乙液等量 混合后（約0.1ml）加入培養(yǎng)基內(nèi)，立即觀察結果。 探索臨床微生物學檢驗技術 結果：結果：出現(xiàn)紅色為陽性。若加入試劑后無顏色反應，可能是： 1.硝酸鹽沒有被還