激光拉曼光譜介紹.

1、想光拉晏丸遭iRS、毀儀IS分靳實址武漢大學測試中心2012.122013-01Mrutuin University412 NRtd印度拉曼研究院C. V. Raman是印度一位偉大的物理學家，他因為在光散射 工作和發(fā)現(xiàn)拉曼效應而獲得諾貝爾獎，當時他是亞洲第一位獲此 殊榮的科學家，他同時也作了有關聲學、光學、結晶動態(tài)學、顏 色和它們在感知上的研究。Diigrin of nr fu st cp&ttyi Aphu. (1)Mdrenrv- Ump. (2) SolatBon fdUt (t.g. Samratr J sdl.m nitril* tolulion tv amiaitKing rad

2、iii(in cori iolheLae al 45JInmj. (J) Mimplr H) Frhra. (5) Plieioft xphar(b)Kiiinii spcrrmni rrirrd onpin|0|hnr of g equal io llie rirtibts lbr(I) Raman S(dkrtcarttibt ba ad of7. (H) R.占b* AaH-Slokrs scalMiJit band of研究太陽光對苯的散射現(xiàn)象時的“意外”發(fā)現(xiàn)第一臺拉曼光譜儀的簡易光路構型Wuhan L niversity拉曼光譜的基本原理電了激發(fā)態(tài)hv0虛態(tài)4h(v0+K)h(分)h

3、v0 h(v0-v)電子基態(tài)FcorescenceResonanceRamanAn?sfokesSiokesRay-eighRWuhan I Diversity低頻高頻:斯托克斯線和反斯托克斯線對稱地分布于瑞利線的兩側，這足 山于在上述兩種怙況下分別相應于得到或失去了-個振動駅了 的能量。:反斯托克斯線的強度遠小r斯托克斯線的強度，這是宙r Boltzmann分布，處于振動棊態(tài)上的粒了數(shù)遠人于處于振動激發(fā) 態(tài)1：的粒了數(shù)。Wuhan L niversity拉曼光譜的基本尿理Raman spectrum of CC14VIvOWuiuin LDiversity拉曼光譜的基本尿理UVVisible

4、IR500004000030000200001000001IIIIII6643210Wavelength / nmFrequency / cm*1Energy / eVAvoidance of fluorescence: buckgroundfFcc Raman spectra分子振動譜吸收.發(fā)展較早平衡位置附近偶極矩變化不為零與拉曼光譜互補實驗儀器是以干涉儀為色散元件測試在中遠紅外進行，不受熒光 干擾低波數(shù)（遠紅外）困難微區(qū)測試較難.光斑尺寸約10微 米，空間分辨率差紅外探測器須噪聲高.液氮冷卻 且靈敏度較低多數(shù)須制備樣吊水對紅外光的吸收分子振動譜散射，自激光后才發(fā)展平衡位置附近極化率變化不

5、為 零與紅外光謙互補實驗儀器是以光樋為色散元件測試在可見波段進行.有時受 樣品熒光干擾.可采用近紅外 激發(fā)低波數(shù)沒有問題共焦顯微微區(qū)測試.光斑尺寸 可小到1微米.空間分辨率好 CCD探測器噪聲低，熱電冷卻 ,靈敏度高無須制備樣品.且可遠距離測 試沒有水對紅外光吸收的干擾激光功率密度 photons9s 1 cm - (或 8 Clll 2)幾何因1分子數(shù)密度1子.與nioleculescni 試樣形(molecules ecnt2)貌冇次dcr L,1光學元 件，色 散系統(tǒng) 的光傳 輸率信號電子Im單個分子的微 分散射截面 cin2 molecukSr4檢測時同檢測試樣收集體積cm立休：曲）角

6、紂檢測器的 號子效率? phoion |儀器的收棄，傳輸和檢測效率Wuhan I Diversity靈敏度低I入射=（103-105） I瑞利g利=（10M3） I拉曼分子與光子作用截面（CrossSccion）Qi曼 10-30 cm?/分子紅外 10叢）cm?/分子熒光 1016 cm?/分子Wuiuin LDiversity對樣品無接觸，無損傷；樣品無需制備；快速分析，鑒別各種材料的特性與結構：顯微拉曼所須樣品量少，且適用樣品微區(qū)（1微米以下光斑） 高空間分辨率（對包裹體,金剛石壓砧中的樣品等尤其有用）， 能適合黑色和含水樣品；高、低溫及高壓條件下測量；光譜成像快速、簡便，分辨率高；儀器

7、穩(wěn)固，體積適中，維護成本低，使用簡單。Wuiuin L Diversity優(yōu)點:dnAIQ |cm sr|可以得到高光譜分辨的譜圖不受溶劑水的影響10可以方便的改變激發(fā)光的波長缺點:1 incident photon, IO 6*-10靈敏度低（表面吸附物種）IO-l10-2210 J*工 A SWuhan I Diversity激光共振拉曼光譜(RRS)產生激光頻率與待測分子的某個電子 吸收峰接近或重合時.這一分子的某個或幾個特征拉曼譜帶強度 可達到正常拉曼譜帶的1213倍，并觀察到正常拉曼效應中難 以出現(xiàn)的，其強度可與基頻相比擬的泛音及組合振動光譜。與正常拉曼光譜相比，共振拉曼光譜靈敏提高

8、，可用于低濃度和 微量樣品檢測，特別適用于生物大分子樣品檢測。Wuhan I Diversity表面増強拉曼光譜SERS當一些分子被吸附到某粗糙金屬，如金、銀、銅的表面時，它們 的拉曼光譜強度會增加io41臚倍，這種不尋常的現(xiàn)象被稱為表 面增強拉曼散射效應，簡稱表面增強拉曼光譜(SERS由于SERS有很高的靈敏度，能檢測吸附在金屬表面的單分子層 和亞單分子層的分子，又能給出表面分子的結構信息，因此它是 一種表面研究的有效技術。 SERS效應只在少數(shù)基體表面能觀察到，其中銀、金、銅被廣泛 做為SERS的金屬基體，它們能顯示出很大的增強效應。銀、鋁 等少數(shù)金屬也能顯示出一定的増強作用，但增強因子小

9、。金屬表面必須被粗糙化一定程度才能顯示出SERS效應.實驗還 表明，SERS強度與激發(fā)光頻率、入射角、吸附分子在金屬基體 表面的覆蓋度、分子離基體表面的距離等有關.SERS的生物醫(yī)Limited selectivity Poor universalityHomogeneous assaysHighly sensitive Simple detection processFrom single to nano aggregateLabel imagingHighly selective (multiplex)Mufti-targeted imagingsensitivity Unsatisfac

10、tory biocompatibility Poor spectral/physical stability Difficult modificationDeveloping advanced shell materialsLabel-free imagingHigh spatial resolution Abundant chemical informationLacking standard database Poor spectral stabilityWuhan L Diversity光源針孔的作用是將所形成的點光源成像到焦平面樣品上，實 現(xiàn)了微小的照明區(qū)域。由于只有被照明的部分樣品散

11、射或反射 的光信號才會被接受，所以保證了顯微鏡的橫向空間分辨率. 在光源照明區(qū)域內，但不在焦平面上的樣品也會散射或反射光 信號，背景上的雜散光因為處于樣品上離焦區(qū)域，所以被與光 源針孔共焦的探測針孔所形成的空間濾波器強烈地衰減.這樣 對信號的主要貢獻是處于焦平面上的樣品被顯微鏡所觀察的那 i薄層的信號，保證了顯微鏡的縱向空間分辨率。Wutuin L nivershj共焦拉曼顯微鏡的工作原理如圖所示，即將激光束經入射針孔（HJ 聚焦于樣品表面.樣品表面的被照射點在探測針孔（HQ處成像.其信 號由在H?之后的檢測器收集（光路如實線所示；而當激光在樣品表面 是散焦時.樣甜處的大部分信號被擋?。ü饴啡?/p>

12、虛線所示.無法通 過針孔到達檢測器.當我們將樣品沿若激光入射方向上下移動.可以將 激光聚焦于樣品的不同層.這樣所采集的信號也將來自于樣品的不同層， 實現(xiàn)樣品的剖層分析拉Jt光譜儀系銃組成部分法國JY公TT1Signalru mirrorN (gr/mm)入 (nm)Basic Spectro F = 300 mm Bandpass per pixel3 (cm*1)LabRAM HRF=800 mm Bandpass per pixel*60024423.848.986005325.081.856006333.601.306008601.950.6818002448.082.881800632

13、1.640*318006331.120.3518008600.510.13LabRAMVVuhan L Diversity拉曼光譜儀系統(tǒng)組成部芬Moterixrd葉rCrQi 怦 lurrvl*0頑心卜dr.VHb 4it(ommutjiMr mirrorfor 4r(rtrMWuhan L Diversity不同焦長光譜儀的分辨率Spectrum of CCI4F: Focal Length N: Grating groove densityWuiuin L niversity傅里葉變換拉曼光譜儀FiliamFT-RamanConfocal Raman1. 釆用1064 nniWNd:YAG

14、激光代替了通常的可見激光。2. 采用Michelson干涉儀代替通常的光柵單色器瑞利散射光的降低采 用一組濾光片來實現(xiàn)（也稱光學過濾），它一般放在干涉儀前。3. 檢測器采用對近紅外有靈敏效應的Ge二極管和InGaAs檢測器D. Bruce Cluise Fourier Transform Raman Spectroscopy J. Am. Chem. SOC 1986 10& 7485-7488iWuhan傅里葉變換拉曼光譜儀的特點由于采用近紅外激光激發(fā)，可避免熒光干擾，擴大拉曼光譜的應用 范國，有很高的依噪比；用近紅外光激發(fā)，能量低，可避免樣品的光解和熱解；傅立葉變換拉曼有分辨率高，波數(shù)精確

15、和重現(xiàn)性好的優(yōu)點。測量精 度可達到10-3 cm ,并且重現(xiàn)性好；傅立葉變換拉曼光譜儀的瀏童速度快.一次掃描可完成全波段掃描 范田測定：傅里葉變換拉曼光譜儀操作方便。不足之處：如單次掃描信噪比不高；低波數(shù)區(qū)掃描方面不如色 散型拉曼光譜儀；水對近紅外有吸收，會彩響測試靈敏度等等.傅里葉變換拉曼光譜的應用聚（對苯撐）對苯二甲酰亞胺（左圖）和雞腿骨組織 （右圖）的可見光拉曼和傅里葉變換拉曼光譜圖Wutum I Diversity激光功率密度問題 2/共聚伐顯微拉駁儀猛屮，激光經顯微 鏡鏡頭聚焦于采樣點即使使用的激光 功率很低,到達樣品采樣點處的澈光 率密度仍然很大.mW/lgm2lxlO8niW/c

16、m:常規(guī):100 mW/lmm2 IxlO4 mW/cm290015002s 3s 、宀1200Raman Shift (cm )占慮樣品的樂受:能力，激光功率密度不能太高, 熱或光解作用而使樣骷發(fā)牛變化。方法冇：否則可能山于光1.采用能量低的激發(fā)光降低激光功率;使用哀減片降低激光功率；小倍數(shù)的收集透鏡 離蘇訃樣品脫肉激光聚焦焦點.功率密度即成指數(shù)卜降Wutuin L niversity離兔方法原理Qsudu- peacsESN距離（X）直徑（屮D）功率密度 拉曼強度01100100106.90. 25502516. 80. 04313Wuhan L Diversity鏡頭的選擇共聚焦拉曼譜儀

17、通常備有幾個不同放大倍數(shù)或數(shù)值孔徑的鏡 頭。要結合不同的實驗要求，綜合收集效率，空間分辨率及工作 距離等幾個因素使用相應的鏡頭：-如果需要高的空甸分如則應選擇高放大倍數(shù)的鏡頭；如5UX、 100X的鏡頭”對于易揮發(fā)，腐蝕性樣品的測試則應選擇長工作距離的鏡頭， 并且一般還要用PVC或PE薄膜包裹來保護鏡頭，或者可以在樣品 上方加窗片來隔離，一可以有效的防止暴露在空氣而受到污染，二 也可以有效的保護鏡頭”如果要高的光鐵集奴孝，則選擇數(shù)字孔徑大（通常倍數(shù)是高的 放大倍數(shù)）的鏡頭：具體考慮如下：Wuhan L Diversity是顯微鏡物鏡如尤和芳辨紡御y芳的能力NA=n-sin0n：鏡頭前空間中介質

18、的折射率, e：鏡頭孔徑張角的一半 增大NA的方法：油浴一大的n值商倍鏡頭一大的3值蓋玻片校正一調整光行差檢測器的優(yōu)化強度與靈敏度的選擇信號的hinni噸處理，pinhole, slit的設置，CCD區(qū)域的設定強度與靈敏度是矛盾的統(tǒng)一當檢測弱信號時軟件提供一種binning的方法，即犧牲譜圖的分 辨率合并幾個象素信號的方法來提高信號強度.因此這就要考慮 興們的實驗目的，關注的是強度還是光譜的分辨率，從而選取合 適的 binning；還有一種提高強度的方法即加大pinhole和slit,這就減弱了共焦 性能，損失了空間分辨能力而且pinhole和Git也有一個最佳值， 超過這個數(shù)字的加大亳無意義；CCD區(qū)域的設定要根據(jù)拉曼光在CCD上的成像位置來確定，選 定的CC區(qū)域必須包括成像區(qū)域，太窄會丟失所需的信號，太 寬則使噪音增加。Wuhan University入射收集方式和樣品處通信號收集方式，垂直入射，側向入射為方便樣品的放置，有效收集拉曼信號，有垂直入射和用轉 角鏡的側向入射兩種方式。對不便密封的溶液樣品可以將其放 在樣品平臺的一側，利用轉角鏡側向入射和收集；對大多數(shù)樣 品則直接垂直入射即可。樣品狀態(tài)處理，固體，液體的樣品濃度拉曼散射截面極小，要提高譜圖質雖，不僅在儀器上要提高各 個元件的性能