新城疫油苗和凍干苗疫苗的生產(chǎn)工藝流程

1、新城疫油苗和凍干苗疫苗的生產(chǎn)工藝流程Company number :0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108新 城 疫 凍 干 疫 苗 生 產(chǎn) 工 藝 流 程 1生產(chǎn)用毒種制備毒種繁殖將毒種用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋?zhuān)ㄈ?0或10-5）,尿囊腔內(nèi)接種10曰齡SPF 雞胚,每胚。選接種后72-120小時(shí)死亡、且病痕明顯的雞胚，分別收獲雞胚液（尿囊液及 羊水），裝于滅菌容器內(nèi)。將檢驗(yàn)無(wú)菌、且對(duì)1%雞紅細(xì)胞凝集價(jià)Nl：640（微量法1:5的雞 胚液混合、定量分裝于安甑中，冷凍保存。注明收獲日期.毒種代數(shù)等。毒種鑒定121病毒含量按含毒雞胚液量用滅菌生理鹽水作為10倍系列稀釋?zhuān)

2、OS 10化10-9 3個(gè)稀釋度各尿囊腔內(nèi)接種10 H SPF雞胚5個(gè)，每胚，置3637C繼續(xù)孵育，48小時(shí) 以前死亡的雞胚棄去不計(jì)，在48-120小時(shí)死亡的雞胚隨時(shí)取出，收獲雞胚液，同一稀 釋度的胚液等量混合，按稀釋度分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，至120小時(shí)，取出所有活胚，逐個(gè)收 獲雞胚液，分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，凝集價(jià)Nl：160（微量法1:128）者判為感染，計(jì)算EIDso,每病毒含量應(yīng)108EID?o01.2.2純凈應(yīng)無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體和外源病毒污染，分別按無(wú)菌檢驗(yàn)或純粹檢驗(yàn)標(biāo) 準(zhǔn)操作規(guī)程、支原體檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、外源病毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。毒種保存在-15C以下保存，應(yīng)不超過(guò)1年。毒種繼

3、代應(yīng)不超過(guò)3代。2制苗材料選擇選擇發(fā)育良好的911曰齡SPF雞胚作為制苗材料。3制苗用毒液的制備接種取生產(chǎn)用毒種用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋?zhuān)ㄈ?0-4或10-5）,每胚尿囊腔內(nèi)接種，接種 后密封針孔，置3637c繼續(xù)孵育，不必翻蛋。孵育和觀察雞胚接種后，每曰照蛋一次，將在60小時(shí)前死亡的雞胚棄去。60小時(shí)后每4-8小時(shí)照蛋一次，死亡的雞胚隨時(shí)取出，直至96或120小時(shí),不論死亡與否，全部取出，氣 室向上直立，置于28C冷卻。收獲將冷卻424小時(shí)的雞胚取出,用碘酊消毒氣室部位，然后以無(wú)菌手術(shù)剝除氣室部卵 殼，剪開(kāi)尿囊膜，吸雞胚液,每若干個(gè)雞胚的胚液混合為一組。收獲后的胚液置于滅菌瓶 中，作好標(biāo)識(shí)，

4、留樣后，結(jié)凍保存。在收獲胚液的同時(shí)，應(yīng)逐個(gè)檢查雞胚,如胎兒腐敗、胚液混濁及有任何污染可疑者棄 去不用。4半成品檢驗(yàn)無(wú)菌檢驗(yàn)經(jīng)處理過(guò)的胚液每組分別取樣按無(wú)菌檢驗(yàn)或純粹檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn) 行無(wú)菌檢驗(yàn)、應(yīng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。病毒含量測(cè)定按含毒雞胚液量用滅菌生理鹽水作為10倍系列稀釋?zhuān)OS 10H 1093個(gè)稀釋度各 尿囊腔內(nèi)接種10曰SPF雞胚5個(gè)，每胚，置3637C繼續(xù)孵育，48小時(shí)以前死亡的雞 胚棄去不計(jì)，在48-120小時(shí)死亡的雞胚隨時(shí)取出，收獲雞胚液，同一稀釋度的胚液等 量混合，按稀釋度分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，至120小時(shí)，取出所有活胚，逐個(gè)收獲雞胚 液,分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，凝集價(jià)眾：160（微

5、量法1:128）者判為感染，計(jì)算EID50i每 ml病毒含量107EID5（）者可用于配制疫苗。5配苗及分裝將檢驗(yàn)合格的若干組雞胚液濾過(guò)，混合于同一容器內(nèi)按規(guī)定羽份，加一定比例的蔗糖 脫脂奶粉作穩(wěn)定劑，使其最終蔗糖含量為,脫脂奶粉含量為5%,同時(shí)加入適宜的抗生 素，充分搖勻，定量分裝、每羽份病毒含量應(yīng)106EIDsoo分裝后迅速進(jìn)行冷凍真空干燥。 6成品檢驗(yàn)物理性狀6.1.1外觀檢查疫苗瓶上的標(biāo)簽，打印出的羽份或頭份、生產(chǎn)批號(hào)、有效日期清晰可 見(jiàn)、位置適當(dāng)。瓶上的鋁蓋穩(wěn)固不松動(dòng)。6.1.2眼觀檢查將疫苗拿到與眼平行位置觀察呈微黃色，海綿狀疏松團(tuán)塊，然后再輕微 振動(dòng)，疫苗松動(dòng)并與瓶壁分離，判為合

6、格。6.1.3溶解性檢查用稀釋液注射到疫苗瓶?jī)?nèi)，經(jīng)輕微振動(dòng)，疫苗應(yīng)迅速完全溶解，無(wú)粘 塊或粘團(tuán)出現(xiàn)，判為溶解性良好。無(wú)菌檢驗(yàn)按無(wú)菌檢驗(yàn)或純粹檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，如有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行雜菌計(jì) 數(shù)，并作病原性鑒定（按雜菌計(jì)數(shù)和病原性鑒定操作細(xì)則進(jìn)行）和禽沙門(mén)氏菌檢驗(yàn) 每羽份非病原菌數(shù)應(yīng)不超過(guò)1個(gè)（按禽沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)法進(jìn)行）。支原體檢驗(yàn)按支原體檢驗(yàn)法進(jìn)行，應(yīng)無(wú)支原體生長(zhǎng)。鑒別檢驗(yàn)6.4.1選擇發(fā)育良好的10日齡SPF雞胚10只，劃出尿囊腔接種部位。6.4.2將疫苗用無(wú)菌生理鹽水稀釋至，與等量抗雞新城疫病毒特異性血清混合，室溫中 和1小時(shí)后，尿囊腔接種，每胚。6.4.3將接種后雞胚用石蠟封孔后，置37C繼

7、續(xù)孵育，觀察120小時(shí)，在24-120小時(shí)內(nèi) 應(yīng)不引起特異死亡，且至少存活8只，雞胚液作紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)，應(yīng)為陰性。外源病毒檢驗(yàn)按外源病毒檢驗(yàn)法進(jìn)行。安全檢驗(yàn)下列方法任擇其一。6.6.1用雞胚檢驗(yàn)將疫苗用無(wú)菌生理鹽水稀釋?zhuān)蚰仪粌?nèi)接種10曰齡雞胚10只，每胚 （含10個(gè)使用劑量），接種后2472小時(shí)，雞胚死亡率應(yīng)不超過(guò)20%為合格。如死亡率超過(guò)20%,可用20個(gè)雞胚重檢1次，重檢結(jié)果死亡率仍超過(guò)20%,該批疫苗判為不 合格。6.6.2用雞檢驗(yàn)用27曰齡SPF雛雞20只，合成兩組，第1組10只，每只滴鼻接種 （10個(gè)使用劑量）；第2組10只，不接種作為對(duì)照，兩組在相同條件下分別飼養(yǎng)管理，觀察10曰

8、，應(yīng)無(wú)不良反應(yīng)。如有非特異性死亡，免疫組與對(duì)照組均不超過(guò)1只。 效力檢驗(yàn)下列方法任擇其一。6.7.1用雞胚檢驗(yàn)6.7.1.1雞胚選擇選擇發(fā)育良好的10曰齡SPF雞胚15個(gè)，劃出尿囊腔接種部位，作出 批組及滴度標(biāo)記，每一滴度接種5個(gè)。6.7.1.2疫苗稀釋將疫苗按瓶簽注明羽份，用滅菌生理鹽水稀釋至1羽份/,再作10倍 系列稀釋至IOS6.7.1.3接種分別取IOS IO#、IO三個(gè)稀釋度尿囊腔內(nèi)接種雞胚各5個(gè)，每胚，用石 蠟封孔。6.7.1.4孵育置37C繼續(xù)孵育至120小時(shí)，每天上、下午各照檢1次，48小時(shí)以前死亡 的雞胚棄去不計(jì)，在48-120小時(shí)死亡的雞胚，隨時(shí)取出放在28C冰箱中，至12

9、0小時(shí) 取出全部活胚放在28CC冰箱中24小時(shí)。6.7.1.5凝集價(jià)（HA）測(cè)定與計(jì)算雞胚半數(shù)感染量（EID50）將冷卻雞胚取出，將同一 稀釋度的死亡雞胚液等量混合，分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)；將活胚逐個(gè)收獲雞胚液，分別 測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，HA160 （微量法128）者判為感染，計(jì)算半數(shù)感染量，每羽份2 （國(guó)家標(biāo) 準(zhǔn)每羽份N）,判為合格。6.7.2用雞檢驗(yàn)6.7.2.1雞的選擇選取30-60曰齡健康易感雞（血凝集抑制價(jià)應(yīng)冬4） 10只。6.722疫苗稀釋將疫苗按瓶簽注明羽份，用滅菌生理鹽水稀釋成每含1/100使用劑 量。6.723免疫及攻毒每只雞滴鼻接種，1014曰后，連同條件相同的對(duì)照雞3只，各肌

10、 肉注射雞新城疫北京株強(qiáng)毒，觀察10-14 對(duì)照雞全部發(fā)病死亡，免疫雞至少保護(hù)9 只為合格。剩余水分測(cè)定按剩余水分測(cè)定方法進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。真空度測(cè)定按真空度測(cè)定方法進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。雞新城疫低毒力活疫苗生產(chǎn)工藝流程圖、主要過(guò)程控制點(diǎn)和控制項(xiàng)目種蛋消看產(chǎn)工藝流程前孵化鹽水毒種繁殖接種照蛋時(shí)間墳喬溫濕燎及羊水）72 僂瞬且病痕師水后孵化及照蛋踐種途徑. c而忤韻07或1（P）,尿囊腔內(nèi)接種10日冷蛋時(shí)間冷蛋溫度淆洗種代次鋁蓋鑒定莓含量QI!無(wú)菌檢驗(yàn)； 別收獲雞胚減滅菌裝于滅菌容器內(nèi)。將檢驗(yàn)無(wú)菌，對(duì)就空豐算價(jià)在1:巧令蛋10曰SPF雞注射水洗純化水粗洗夜量異4釋度各-WC冷凍保存收獲粗洗配苗釋,、

11、10-作為匕逶鰹二薩繼時(shí)小時(shí)以前死亡的雞胚棄去*計(jì),在48120小時(shí)死亡的雞胚隨時(shí)取出，收獲雞胚液，同一稀釋度 644、屮TTT料永動(dòng)蒸汽滅菌的胚液等量混合，按稀釋度分別測(cè)價(jià)T至120小時(shí)l取出干燥勺個(gè)收自紅細(xì)胞凝集彳化 凝集價(jià)山160（微量法1:128）者判為感染，計(jì)算EID,毒扌毒扌安全儉驗(yàn)幽檢驗(yàn)效力檢驗(yàn)1O8EID51下保存,3代。貼簽 迤肆發(fā)育良好91U 口蚊的初點(diǎn)雞裝箱入庫(kù)檢驗(yàn)抽樣王注：水為關(guān)鍵控制點(diǎn)f1控制項(xiàng)目3制苗用毒液的制備接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋?zhuān)ㄈ?0,或IO）,每胚尿囊內(nèi)接種，接種后密封針孔，置3637C繼續(xù)孵育，不必翻蛋。孵育和觀察雞胚接種后，每曰照蛋

12、1次，將60小時(shí)前死亡的雞胚棄去。此后，每46小時(shí)照蛋1次，死亡的雞胚隨時(shí)取出，直至96小時(shí)，不論死亡與否，全部取出，氣室 向上直立，置于28C冷卻4 24小時(shí)。收獲3.3.1雞胚液的收獲將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無(wú)菌手術(shù)破除氣 室部卵殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛尿囊膜及羊膜（謹(jǐn)防卵黃破裂），吸取胚液。對(duì)每個(gè) 雞胚在吸取胚液前均應(yīng)注意檢查，凡胎兒腐敗、胚液混濁及有任何污染可疑者，棄去不用。死胚和活胚分別收獲，每若干個(gè)雞胚分為一組，吸取胚液放于同一滅菌的容器內(nèi)， 每組抽樣測(cè)定血凝價(jià)，血凝價(jià)低于1 : 160 （微量法1 : 128）者應(yīng)棄去。同時(shí)作無(wú)菌檢 查，應(yīng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。收獲的胚

13、液滅活前在28C左右保存，應(yīng)不超過(guò)5曰。3.3.2雞胚胎兒收獲及浸出液的制備在收獲及胚液的同時(shí)，取病變胎兒，去頭、腳，用 生理鹽水洗23次，磨碎，制成（1 ：5） （1 : 10）乳劑，加適宜的抗生素適量，然 后離心或以4層紗布一層銅紗網(wǎng)濾過(guò)，置自然沉淀1 2日，然后取樣作無(wú)菌檢查。以 上清夜作為配制雙相油乳劑疫苗用。4滅活將上述無(wú)菌胚液以4層紗布及一層細(xì)銅紗網(wǎng)濾過(guò)，混合于一個(gè)大玻璃瓶?jī)?nèi)，吸 出數(shù)毫升樣品備測(cè)毒價(jià)。其余胚液和雞胚浸出液分別計(jì)量加入10%甲醛溶液，隨加隨 搖，使其能充分混合，甲醛溶液的最終濃度為。加甲醛溶液后最好傾倒另一瓶中，以避免瓶口附近黏附的病毒未能接觸滅活劑。然后在37C滅

14、活16小時(shí)（以瓶?jī)?nèi)溫度達(dá)到 37C開(kāi)始計(jì)時(shí)）。期間振搖3 4次。在28C保存，應(yīng)不超過(guò)1個(gè)月。5半成品檢驗(yàn)無(wú)菌檢驗(yàn)取滅活的胚液及雞胚浸出液分別按附錄448進(jìn)行，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。滅活檢驗(yàn)取10日齡無(wú)新城疫病毒抗體的雞胚6個(gè)，每個(gè)接種滅活胚液，每日照蛋2 次，觀察5曰，雞胚非特異死亡不應(yīng)超過(guò)1個(gè)。對(duì)所有胚液分別測(cè)定血凝價(jià)，應(yīng)不出現(xiàn) 血凝，認(rèn)為滅活完全。如有可疑，應(yīng)將可疑胚液進(jìn)行重檢，重檢不合格者報(bào)廢。雞胚浸 出液也按照上述方法檢查。毒價(jià)測(cè)定將滅活前取出的胚液進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)OS 10H 10%個(gè)稀釋度分別 接種9-10曰齡無(wú)雞新城疫病毒抗體的雞胚5個(gè)，每胚尿囊內(nèi)，每日照蛋2次，觀察5 日，無(wú)論

15、死胚、活胚均應(yīng)測(cè)定血凝價(jià)，血凝價(jià)1 ：80 （微量法1 ：64）以上者，判為感 染，計(jì)算EIDo,每病毒含量N10* EIDso,方可用于制苗。6單相油乳劑滅活疫苗制備油相制備取注射用白油94份，加司本-80 6份，混合后，加硬脂酸鋁2份，隨加隨攪 拌至透明為止，高壓滅菌備用。水相制備取吐溫-80 4份裝入帶玻璃珠的瓶中滅菌，冷卻后加滅活胚液96份，充分振 瑤使吐溫-80完全溶解為止。乳化取油相3份放于乳化罐內(nèi)，開(kāi)動(dòng)電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)徐徐加入水相1份，加 完后再以10000r/min攪拌25分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液，使其最終濃度 為。乳化后,取3 5ml以3000r/min離心

16、15分鐘，若有分層現(xiàn)，應(yīng)重復(fù)攪拌1次。 7雙相油乳劑疫苗制備用乳化罐乳化 7.1.1水相、油相制備同單相苗，但水相制備中，雞胚液是按4%加入吐溫，而雞胚浸出 液則按6%加吐溫。7.1.2取油相2份放入乳化罐內(nèi)，開(kāi)動(dòng)電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)徐徐加入胚液1份，加 完后再以10000r/min攪拌。7.1.3取雞胚浸出液（單相苗雞胚液等量）放于乳化罐，開(kāi)動(dòng)電機(jī)緩緩加入上述油包水單相苗，加完后再以10000r/min攪拌25分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液.使最終濃度為.。乳化后取3 5ml以3000r/min離心10分鐘，若分層嚴(yán)重應(yīng)再攪拌1 次。用乳化罐乳化。8分裝定量分裝，加蓋密封。9成品檢驗(yàn)

17、物理性狀9.1外觀為乳白色乳劑。9.1.2劑型單相苗為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，應(yīng)呈油滴狀 不擴(kuò)散。雙相苗為水包油包水型，滴于冷水中，應(yīng)呈云霧狀擴(kuò)散。9.1.3穩(wěn)定性在37C左右條件下放置21曰，應(yīng)不破乳。9丄4粘度用lml吸管（出口內(nèi)徑1.2mm）,吸取25C左右的疫苗lml,令其垂直自然流出，記錄流出所需時(shí)間。單相苗在8秒以內(nèi)，雙相苗在5秒以內(nèi)為合格。無(wú)菌檢驗(yàn)按無(wú)菌檢驗(yàn)或純粹檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。安全檢驗(yàn)用3060曰齡健康易感雞（HI抗體1 ：4） 6只，各肌肉或頸部皮下注射疫 苗lml,觀察14曰，應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。效力檢驗(yàn)用3

18、060日齡健康易感雞（HI抗體1 ：4） 15只，其中10只各皮下或肌肉 注射疫苗20卩1 （用以下的注射器注射），另5只不免疫作對(duì)照，2128曰后，連同條件 相同的對(duì)照雞5只，各肌肉注射1O5ELD5o強(qiáng)毒，觀察14日，對(duì)照組全部死亡，免疫組 至少保護(hù)7只為合格。甲醛含量測(cè)定按進(jìn)行，應(yīng)符合制品檢驗(yàn)的有關(guān)規(guī)定。主要過(guò)程控制點(diǎn)和控制項(xiàng)目雞新城疫滅活疫苗生產(chǎn)工藝流程圖、種蛋消毒前孵化:無(wú)相應(yīng)抗體：:接種途徑1技術(shù)依tr一:接種照蛋時(shí)間祇法護(hù)咸好接種劑蚤木后卿化及照蛋無(wú)血檢驗(yàn)?zāi)芘c希:衣活檢驗(yàn):應(yīng)的3甲醛含瑩測(cè)定訴價(jià)測(cè)定冷蛋時(shí)間*冷蛋溫度41冷蛋鎧蓋清洗消洗純水。檢驗(yàn)器具無(wú)試r;設(shè)備分裝瓶電子分析克裔

19、及收獲*乳化木油相制稱(chēng)量范圍g水滅活木水相制-15C冷凍保存膠基清洗水滅茵脈動(dòng)蒸汽滅茵*分裝止血鉗（開(kāi)啟苗瓶）,玻璃棒収建碎恒品的器具）,10ul注射器，燒杯。樣品每批疫苗4個(gè)樣品。卜筆、紗布和汗產(chǎn)壬時(shí)壓蓋費(fèi)休水份滴定儀（水貼簽水裝箱入庫(kù)按滴定儀的RUN鍵滴定儀自動(dòng)滴定至終點(diǎn)。滴定儀屏幕顯示待機(jī)模式Drift值在25以下指示箭頭穩(wěn)定T（平指）時(shí)，開(kāi)始滴定標(biāo)定滴度：3.3.1按F2鍵至顯示屏出現(xiàn)H2O ISO 36963.3.2 連續(xù)按 F3 鍵至顯示屏出現(xiàn) please add sample 0.0100 g3.3.3天平去皮，通過(guò)進(jìn)樣孔注入已稱(chēng)重的純水，（用10卩1注射器抽取10pl純水置天

20、平稱(chēng)重）注射器放回天平后按F3;33.4按F1自動(dòng)輸入樣品量；3.3.5按F2顯示樣品重量；3.3.6按F3確認(rèn)樣品重量；3.3.7滴定至終點(diǎn)自動(dòng)打印出結(jié)果，打印結(jié)束按F3返回到待機(jī)模式；3.3.8重復(fù)標(biāo)定只需依上述第1條開(kāi)始同法操作。水份測(cè)定：3.4.1將樣品置天平稱(chēng)重3.4.2 連續(xù)按 F3 鍵，顯示屏出現(xiàn) please add sample O.OOOOg - 5.000g;3.4.3天平去皮后通過(guò)進(jìn)樣口將已稱(chēng)重的樣品加入滴定杯中.將載樣杯放回天平。3-4.4按F3預(yù)滴定3.4.5按F1自動(dòng)輸入樣品量3.4.6按F2顯示樣品重量3.4.7按F3確認(rèn)樣品重量3.4.8滴定至終點(diǎn)自動(dòng)打印出結(jié)

21、果，打印結(jié)束，按F3返回到待機(jī)模式 3.4.94記錄與計(jì)算5結(jié)果判定每瓶樣品含水量不得超過(guò),如有超過(guò)時(shí)，可重檢一次。2 真空度測(cè)定法1技術(shù)依據(jù)及原理依據(jù)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)附錄中的真空度測(cè)定法，即使用高頻火花真空測(cè)定 器測(cè)定。它的基本原理是利用本儀器振動(dòng)形成火花束，激勵(lì)諧振蕩回路，使次線線圈感 應(yīng)出高頻高壓脈沖電壓，使被檢物產(chǎn)生不同顏色的輝光，根據(jù)顏色的變化來(lái)判斷疫苗的 真空度。2注意事項(xiàng)按照規(guī)定要求，在檢驗(yàn)過(guò)程中至少要有一名檢驗(yàn)員和一名復(fù)核員共同進(jìn)行，確保檢驗(yàn) 結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢驗(yàn)要在光線較暗的操作室里進(jìn)行，便于結(jié)果判定的準(zhǔn)確性。被檢樣品從冷庫(kù)中取出應(yīng)擦干瓶壁上的水份，樣品達(dá)到室溫后再進(jìn)行測(cè)定

22、。3材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求儀器及設(shè)備電火花真空檢測(cè)器。樣品所有被檢樣品。檢驗(yàn)記錄紙、筆。4檢驗(yàn)步驟取待檢樣品，一字排列于暗室的操作臺(tái)上，使瓶與瓶之間有一定距離。將真空檢測(cè)器尾部電源插頭插入220V電源插座里。將放電簧頭對(duì)準(zhǔn)被檢樣品（簧頭不要觸到瓶壁），打開(kāi)開(kāi)關(guān)，間歇適用（時(shí)開(kāi)時(shí)關(guān)）。觀察并記錄逐瓶樣品的真空狀態(tài)。5安全措施使用真空檢測(cè)器時(shí)，人體不要接近儀器的頭部電簧，以免高頻電流的電擊，（但沒(méi)有 生命危險(xiǎn)）。測(cè)定樣品真空時(shí)，檢測(cè)器必須緩慢移動(dòng)，放電簧不應(yīng)在一點(diǎn)停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以免把玻 璃擊穿，影響樣品本身的效果。測(cè)定樣品真空時(shí)，注意遠(yuǎn)離疫苗瓶上的金屬帽，否則會(huì)造成錯(cuò)誤信號(hào)，甚至在金屬處

23、 將玻璃擊穿而造成漏洞。6結(jié)果判定如果容器內(nèi)出現(xiàn)白色、粉色或紫色輝光，則真空度檢查合格。3 無(wú)菌檢驗(yàn)和純粹檢驗(yàn)1技術(shù)依據(jù)及原理：生物制品（除另有規(guī)定者外）都不應(yīng)有外源微生物污染。滅活疫苗不得含有活的本 菌或本毒。各類(lèi)生物制品必須按規(guī)定作無(wú)菌檢驗(yàn)或純粹檢驗(yàn)，全部操作應(yīng)在無(wú)菌條件下 進(jìn)行。2注意事項(xiàng)抽樣后逐瓶檢查包裝、膠塞、瓶簽有無(wú)破損和毀壞，瓶?jī)?nèi)有無(wú)雜質(zhì)。為防止交叉污染，一個(gè)樣品用一個(gè)吸管或一個(gè)注射器。各類(lèi)生物制品的檢驗(yàn)操作應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。檢驗(yàn)過(guò)程要仔細(xì)、認(rèn)真。保持實(shí)驗(yàn)室的清潔衛(wèi)生，嚴(yán)格遵守常規(guī)的消毒制度。3材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求儀器2426C、3638C溫箱，檢驗(yàn)器具，試管架,1

24、0ml. 5ml、1ml吸管，記號(hào)筆，記錄紙。檢驗(yàn)用培養(yǎng)基3.2.1無(wú)菌檢驗(yàn)厭氧性及需氧性細(xì)菌的檢驗(yàn)用含硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱(chēng)）和酪月東瓊脂培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱(chēng)。霉菌及腐生菌檢驗(yàn)用葡萄糖蛋白月東湯（簡(jiǎn)稱(chēng)）。3.2.2純粹檢驗(yàn)用適宜本菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。4檢驗(yàn)步驟抽樣應(yīng)隨機(jī)取樣并注意代表性。4.1.1制造疫苗用的各種原菌液、毒液和其它配苗組織乳劑、穩(wěn)定劑及半成品的無(wú)菌或純粹檢驗(yàn)，應(yīng)每瓶（罐）分別抽樣進(jìn)行，抽樣量為2 10ml。4.1.2成品的無(wú)菌或純粹檢驗(yàn)應(yīng)按每批或每個(gè)亞批進(jìn)行，每批按瓶數(shù)百分之一抽樣，但不應(yīng)少于5瓶，最多不超過(guò)10瓶，分別進(jìn)行檢驗(yàn)。檢驗(yàn)用培養(yǎng)基4.2.1無(wú)菌檢驗(yàn)4.2.1.1厭氧性及需氧性

25、細(xì)菌的檢驗(yàn)用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（）及酪陳瓊脂（）。4.2.1.2霉菌及腐生菌檢驗(yàn) 用葡萄糖蛋白陳湯（）。4.2.2活菌純粹檢驗(yàn)用適于本菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。4.2.3滅活檢驗(yàn)用適于本菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，或?qū)Ρ径久舾械募?xì)胞、組織和動(dòng)物。4.2.4雜菌計(jì)數(shù)用馬丁瓊脂或培養(yǎng)基。4.2.5病原性鑒定用培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基。檢驗(yàn)方法及結(jié)果判定細(xì)菌原菌液及活菌苗半成品的純粹檢驗(yàn)取樣接種小管及適宜于本菌生長(zhǎng)的其他培養(yǎng)基 斜面各2支，每支，1支置37C培養(yǎng)；1支置25C培養(yǎng)，觀察35曰，應(yīng)純粹。4.3.2病毒原毒液和其它配苗組織乳劑、穩(wěn)定劑及半成品的無(wú)菌檢驗(yàn)取樣接種小管及斜 面各2支，每支0.2ml, 1支置37C培養(yǎng)

26、；1支置25C培養(yǎng)，觀察3 5曰，應(yīng)無(wú)菌生 長(zhǎng)。4.3.3滅活檢驗(yàn)細(xì)菌滅活后，用適于本菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基2支，各接種，置37C培養(yǎng)5 曰，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。病毒液滅活后和細(xì)菌毒素脫毒后接種對(duì)本毒敏感的細(xì)胞、禽胚或?qū)嶒?yàn) 動(dòng)物，應(yīng)正常。4.3.4含甲醛、苯酚、汞類(lèi)等防腐劑和抗生素的制品用培養(yǎng)基50ml,接種樣品（凍干 制品先做10倍稀釋?zhuān)?ml,置37C培養(yǎng)，3日后自小瓶中吸取培養(yǎng)物。分別接種小管和 斜面各2支，每支0.2ml, 1支置37C ； 1支置25C,另取，接種1支小管置25C,均 培養(yǎng)5曰，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。如制品允許含一定數(shù)量非病原菌，應(yīng)進(jìn)一步作雜菌計(jì)數(shù)和病原性鑒定。4.3.5細(xì)菌性活疫苗（凍干制品

27、恢復(fù)原量）及不含防腐劑、抗生素的其它制品或稀釋液，將樣品直接接種小管、斜面或適于本菌生長(zhǎng)的其他培養(yǎng)基各2支.每支0.2ml,1支置37C； 1支置25C,另用1支小管，接種0.2ml置25C,均培養(yǎng)5曰。細(xì)菌性活 疫苗應(yīng)純粹，其他制品應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。4.3.64.3.7如培養(yǎng)后混濁不易判定時(shí)，可移植1次，再判定。4.3.8每批抽檢的樣品必須全部無(wú)菌或純粹生長(zhǎng)。如發(fā)現(xiàn)個(gè)別瓶有雜菌或結(jié)果可疑時(shí), 可重檢原瓶（如為安甑或凍干制品，可重抽樣品），如無(wú)菌或無(wú)雜菌生長(zhǎng)，可作無(wú)菌或 純粹通過(guò)。如仍有雜菌，可抽取加倍數(shù)量的樣品重檢，個(gè)別瓶仍有雜菌，則作為污染雜 菌處理。5安全措施檢驗(yàn)過(guò)程中注意防止對(duì)檢驗(yàn)人員和環(huán)境

28、的污染。檢驗(yàn)人員必須穿戴工作服和口罩。滴撒在操作臺(tái)、地面的異物要進(jìn)行消毒處理。檢驗(yàn)完畢后開(kāi)封的檢品均要經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理。6記錄和計(jì)算檢品在接種相關(guān)培養(yǎng)基后，每天觀察溫箱內(nèi)的培養(yǎng)情況并記錄觀察結(jié)4 雜菌計(jì)數(shù)1技術(shù)依據(jù)及原理某些疫（菌）苗允許有一定數(shù)量的非病原性雜菌，但這類(lèi)制品如污染雜菌，必須作 雜菌計(jì)數(shù)。2注意事項(xiàng)為防止交叉污染，一個(gè)樣品用一個(gè)吸管或一個(gè)注射器。各類(lèi)生物制品的檢驗(yàn)操作應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。檢驗(yàn)過(guò)程要仔細(xì)、認(rèn)真。3材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求儀器3638C普通溫箱，試管架，10ml、5ml、1ml吸管，記號(hào)筆，記錄紙，顯微鏡。培養(yǎng)基（含4%血清及裂解血球全血）馬丁瓊脂或酪腺瓊脂培

29、養(yǎng)基（）o4檢驗(yàn)步驟污染雜菌的制品至少重新抽檢3瓶，分別進(jìn)行雜菌計(jì)數(shù)。用普通肉湯或蛋白陳水50 倍稀釋?zhuān)臃N于含4%血清及裂解血球全血的馬丁瓊脂平板或酪月東瓊脂（）平板上， 每個(gè)樣品接種2付平板，放置3638C培養(yǎng)48小時(shí)，再放置室溫24小時(shí)，然后分別計(jì) 算雜菌菌落（CFU）。5安全措施檢驗(yàn)過(guò)程中注意防止對(duì)檢驗(yàn)人員和環(huán)境的污染。檢驗(yàn)人員必須穿戴工作服和口罩。滴撒在操作臺(tái)、地面的異物要進(jìn)行消毒處理。檢驗(yàn)完畢后開(kāi)封的檢品均要經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理。6記錄和計(jì)算培養(yǎng)72小時(shí)后，分別計(jì)算每個(gè)平板的雜菌數(shù)，并把兩付平板的雜菌數(shù)相加后求平均 數(shù)，作為該瓶的雜菌數(shù)。如污染霉菌，亦作為雜菌計(jì)算。7結(jié)果判定任何1瓶每

30、克組織（或每頭劑）的非病原菌數(shù)，不應(yīng)超過(guò)所檢產(chǎn)品的規(guī)定數(shù)量。5 支原體檢驗(yàn)1技術(shù)依據(jù)及原理病毒性活疫苗不得含有支原體。2注意事項(xiàng)在檢測(cè)中必須遵守規(guī)定的程序，每次都必須設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。對(duì)每批支原體檢驗(yàn)用培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，并作記錄。操作時(shí)禁止口吹吸管。操作人員必須戴口罩、工作帽，穿工作服，禁止檢驗(yàn)人員將頭發(fā)留在帽外。保持實(shí)驗(yàn)室的清潔衛(wèi)生，嚴(yán)格遵守常規(guī)的消毒制度。必須在無(wú)菌、無(wú)支原體污染的環(huán)境條件下操作。3材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求儀器3638C普通溫箱，3638C二氧化碳培養(yǎng)箱，顯微鏡，試管架，10ml、5ml、 2ml、1ml吸管，小試管和100ml培養(yǎng)瓶，記號(hào)筆，記錄紙。培養(yǎng)基檢測(cè)由

31、禽胚組織或其細(xì)胞制成的活疫苗用改良Frey氏培養(yǎng)基。檢測(cè)其他種類(lèi)的活疫苗用支原體培養(yǎng)基。4檢驗(yàn)步驟樣品處理每批制品取樣35瓶，混合后備用。如為凍干制品，則加液體培養(yǎng)基復(fù)原成混懸液 后混合。接種與觀察液體培養(yǎng)基培養(yǎng)取5ml疫苗混合物接種于盛20ml小瓶液體培養(yǎng)基中，再?gòu)男∑恐?分別取0.2ml移植接種于2支小管液體培養(yǎng)基內(nèi)，將小瓶與小管放36 - 38C培養(yǎng)，每日 觀察培養(yǎng)物有無(wú)顏色變黃或變紅。如在5日尚未見(jiàn)變化，再?gòu)男∑恐腥?.2ml移植于另 2支管液體培養(yǎng)基內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)觀察5曰，如此重復(fù)3次。若仍無(wú)變化，在最后一次接 種小管的培養(yǎng)物經(jīng)14天觀察后停止觀察。在觀察期內(nèi)，如果發(fā)現(xiàn)小瓶或任何一支小

32、管 培養(yǎng)物顏色出現(xiàn)明顯變化，pH值變化達(dá)土?xí)r，應(yīng)立即移植于小管液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng) 基，觀察在液體培養(yǎng)基中是否出現(xiàn)恒定的pH變化，及在固體上有無(wú)典型的“煎蛋狀支 原體菌落。瓊脂固體平板培養(yǎng)在每次液體培養(yǎng)物移植小管培養(yǎng)的同時(shí)，取培養(yǎng)物 0.2ml接種 瓊脂平板2付，放在含510%二氧化碳的潮濕環(huán)境下3638C培養(yǎng)。此外，在液體培 養(yǎng)基顏色出現(xiàn)變化，pH值變化達(dá)土?xí)r，也同時(shí)接種瓊脂平板2付。各瓊脂平板每57 天在低倍顯微鏡下觀察檢查有無(wú)支原體菌落出現(xiàn)，經(jīng)14天觀察，仍無(wú)菌落者停止觀 察。每次移植培養(yǎng)陽(yáng)性對(duì)照，在同條件下培養(yǎng)觀察。禽類(lèi)疫苗用滑液支原體作對(duì)照，非禽 類(lèi)疫苗用豬鼻支原體作對(duì)照。5安全措施

33、檢驗(yàn)過(guò)程中注意防止對(duì)檢驗(yàn)人員和環(huán)境的污染。檢驗(yàn)完畢后開(kāi)封的產(chǎn)品均要經(jīng)過(guò)高壓 滅菌處理。檢驗(yàn)人員必須穿戴工作服和口罩。滴撒在操作臺(tái)、地面的異物和污染的工作服要進(jìn)行消毒處理。檢驗(yàn)完畢，開(kāi)封的檢品均要經(jīng)滅菌后再進(jìn)行處理。6記錄和計(jì)算檢品在接種相關(guān)培養(yǎng)基后，每天培養(yǎng)情況并記錄觀察結(jié)果。7結(jié)果判定任何一次瓊脂平板上出現(xiàn)支原體菌落，判疫苗或血清不合格。陽(yáng)性對(duì)照中至少有一個(gè)平板長(zhǎng)菌落，而陰性對(duì)照中無(wú)菌落生長(zhǎng)，則檢驗(yàn)有效。8附錄及附加說(shuō)明上述小瓶培養(yǎng)基是指100m小瓶中盛培養(yǎng)基20ml ；小管培養(yǎng)基是指小試管10cm中 盛入培養(yǎng)基。小管與小瓶皆須用膠塞或螺旋塑料塞封口。6 外源病毒檢驗(yàn)1技術(shù)依據(jù)及原理由于使用

34、的生物活性原材料、生產(chǎn)過(guò)程等均可引起種毒、獸用病毒性活疫苗等污染 外源病毒。因此用高效價(jià)單特異抗血清中和待檢物中相應(yīng)活性成分或經(jīng)適當(dāng)處理后，接 種不同的培養(yǎng)基質(zhì)，觀察病變以檢出污染的外源病毒。2注意事項(xiàng)檢驗(yàn)所用原材料應(yīng)符合有關(guān)規(guī)定。中和用抗血清應(yīng)高效價(jià)、單特異性。嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止交叉污染。3材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求儀器及設(shè)備孵化器，CO?培養(yǎng)箱.普通冰箱，普通顯微鏡，熒光顯微鏡，水浴鍋，照蛋箱。試劑特異抗血清檢驗(yàn)器具小試管、試管架、注射器(lml),吸管(lml, 5ml, 10ml),記號(hào)筆樣品每批樣品35瓶其它檢驗(yàn)用記錄紙、筆等4檢驗(yàn)步驟樣品處理4.1.1禽源細(xì)胞、種毒及其制品種

35、毒或活疫苗除另有規(guī)定者外，液體樣品取23瓶混合，凍干樣品取23瓶加入 稀釋液溶解后混合，用相應(yīng)單特異抗血清在25C中和1小時(shí)以完全中和樣品中的活性成 分作為檢品。除另有規(guī)定者外，病毒中和劑量為10羽份。4.1.2非禽源細(xì)胞(或細(xì)胞系)、種毒及其制品種毒或活疫苗除另有規(guī)定者外，液體樣品取23瓶混合，凍干樣品取23瓶加入 稀釋液溶解后混合，用相應(yīng)單特異抗血清在25C中和1小時(shí)以完全中和樣品中的活性成 分作為檢品，除另有規(guī)定者外，病毒中和劑量為1羽份。檢驗(yàn)方法4.2.1禽源細(xì)胞、種毒及其制品用雞胚接種檢查法4.2.1.1尿囊腔內(nèi)接種試驗(yàn)4.2.1.試驗(yàn)法選擇發(fā)育良好的911曰齡SPF雞胚10枚，每枚

36、尿囊腔內(nèi)接種檢品(如為 疫苗，至少含10個(gè)羽份)，在37C培養(yǎng)7天，棄去在接種后24小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，但 雞胚至少成活8/10,試驗(yàn)方可成立。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)打開(kāi)雞胚，觀察雞胚有無(wú)異常，取尿囊 液做紅胞凝集試驗(yàn)，室溫靜置15-30分鐘，觀察有無(wú)紅細(xì)胞凝集。4.2.1. 判定雞胚發(fā)育正常，尿囊液紅細(xì)胞凝集陰性，該批制品判合格。4.2.1.2絨毛尿囊膜（CAM）接種試驗(yàn)421.試驗(yàn)法選擇發(fā)育良好的911日齡SPF雞胚10枚，每枚CAM接種檢品（如為 疫苗，至少含10個(gè)羽份），在37C培養(yǎng)7天，棄去在接種后24小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，但 雞胚至少成活8/10,試驗(yàn)方可成立。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)打開(kāi)雞胚，觀察雞胚及CAM有

37、無(wú)異 常，取尿囊液做紅胞凝集試驗(yàn)，室溫靜置15-30分鐘，觀察有無(wú)紅細(xì)胞凝集。4.2.1. 判定雞胚發(fā)育正常，CAM無(wú)異常，尿囊液紅細(xì)胞凝集陰性，該批制品判合格。5安全措施檢驗(yàn)過(guò)程中注意防止人員和環(huán)境的污染，檢驗(yàn)人員必須穿戴工作服和口罩，嚴(yán)格進(jìn) 行無(wú)菌操作并在相應(yīng)安全等級(jí)（級(jí)別）的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，以防散毒。檢驗(yàn)結(jié)束后對(duì)操作 臺(tái)、地面進(jìn)行徹底消毒，用過(guò)的吸管浸泡在消毒液中，檢驗(yàn)完畢后廢棄的產(chǎn)品均經(jīng)高壓 滅菌處理。7鑒別檢驗(yàn)1技術(shù)依據(jù)及原理將含有對(duì)病毒外殼或囊膜抗原的特異抗體的血清與相應(yīng)疫苗病毒混合，可使兩者結(jié) 合（即中和），使病毒失去對(duì)其宿主的感染性。用上述中和物接種靶動(dòng)物（方法1）、 雞胚（方法

38、2）或細(xì)胞培養(yǎng)（方法3）,觀察其是否感染病毒，即可判斷疫苗病毒與血 清的特異性。2試驗(yàn)過(guò)程的注意事項(xiàng)應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作。除接種動(dòng)物外，所有操作均應(yīng)在生物安全試驗(yàn)室或超凈工作臺(tái)中進(jìn) 行。試驗(yàn)前應(yīng)知道疫苗病毒的含量或毒價(jià)，否則，須先行測(cè)定。兩“中和”物的量要準(zhǔn)確，中和溫度要恒定，中和期間要適當(dāng)搖動(dòng)，并有專(zhuān)人值守。 細(xì)胞瓶上要有標(biāo)記，防止錯(cuò)將細(xì)胞面放反。接種動(dòng)物要盡量輕柔，保定要得當(dāng)、確實(shí)，以保證檢驗(yàn)人員的安全和接種部位及接種 劑量的準(zhǔn)確。試驗(yàn)完畢要及時(shí)清理現(xiàn)場(chǎng)，做好消毒處理工作。3試驗(yàn)材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求儀器及設(shè)備超凈工作臺(tái)（雙人、垂直）.恒溫水浴鍋，計(jì)時(shí)鐘，孵化器，照蛋箱，架盤(pán)天平， 恒

39、溫培養(yǎng)箱或CO2培養(yǎng)箱，低溫冰箱，普通冰箱.倒置顯微鏡。試劑特異性血清，疫苗稀釋液（生理鹽水、細(xì)胞培養(yǎng)液或適于病毒和宿主動(dòng)物的其他稀 釋液），無(wú)機(jī)鹽類(lèi)，細(xì)胞培養(yǎng)液（MEM、199、乳漢液、乳歐液），健康牛血清，抗生 素（青、鏈霉素），胰酶，細(xì)胞分散液EDTA,酚紅（1%）,消毒劑（酒精、碘酊 及脫脂棉球等）。試驗(yàn)器具試管及試管架若干，吸管（1ml、5ml、10ml）,注射器（lml, 5ml, 10ml）及針頭（4 #6#）,蛋盤(pán)，打孔器，石臘，細(xì)胞瓶及瓶塞試驗(yàn)動(dòng)物家兔（2.0kg,用于豬瘟疫苗），雞胚（SPF胚，911日齡，用于雞新城疫、支 氣管炎疫苗）細(xì)胞（根據(jù)待檢疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)選用適宜細(xì)胞

40、，按常規(guī)方法制備成良好單層）樣品每批疫苗任取1 3瓶。其他檢驗(yàn)記錄紙、筆等3檢驗(yàn)步驟逐瓶核對(duì)疫苗及其特異性血清瓶簽，分別排放于操作臺(tái)上。稀釋疫苗每批疫苗任取樣1瓶（另有規(guī)定除外）.用該產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的稀釋液， 按其含量作10倍系列稀釋至質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的稀釋劑量。稀釋血清對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定需要稀釋的特異性血清（馬立克氏病特異性血清和傳染 性法氏囊病特異性血清），用滅菌生理鹽水作倍比稀釋至該產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的稀釋 度。中和4.4.1打開(kāi)水浴鍋電源，設(shè)置溫度，調(diào)整好水溫。4.4.2按其產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的接種量，分別計(jì)算疫苗及其特異性血清的中和用量。443根據(jù)每批疫苗與血清的中和用量，取適宜滅菌試管1

41、3支，分別用記號(hào)筆標(biāo)明“中和、“陰性對(duì)照”、“陽(yáng)性對(duì)照”等字樣，順序排放于試管架上（產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中不設(shè)“對(duì)照的除外）。4.4.4取適宜吸管，定量吸取疫苗稀釋液，分別加入到“中和及“陽(yáng)性對(duì)照管中。4.4.5取適宜吸管，吸取與疫苗稀釋液等量的特異性血清，分別加入到“中和及“陰性對(duì) 照”管中。4.4.6取適宜吸管，吸取與“疫苗”、“血清等量的適當(dāng)稀釋液，分別加入到“陽(yáng)性對(duì)照”和 “陰性對(duì)照”管中。4.4.7按其產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的中和溫度及中和時(shí)間，核對(duì)水浴鍋溫度無(wú)誤后，將上述 試管輕輕振搖、混勻后置水浴中和，上好定時(shí)鐘，由專(zhuān)人值守。4.4.8中和時(shí)間到，關(guān)閉水浴鍋電源。取出試管，排放于試管架上。接種

42、4.5.1接種動(dòng)物取疫苗中和物及對(duì)照物，按其產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的動(dòng)物品種、等級(jí)、數(shù)量、年齡、 體重、接種途徑、劑量，分別接種動(dòng)物。4.5.2接種雞胚取疫苗中和物及對(duì)照物，按其產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的雞胚曰齡、數(shù)量、接種途徑、劑 量，分別接種雞胚。4.5.3接種細(xì)胞取疫苗中和物及對(duì)照物，按其產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的細(xì)胞種類(lèi)、數(shù)量和接種量，分別 接種細(xì)胞培養(yǎng)。4.5.3.1按常規(guī)方法制備細(xì)胞單層。4.5.3.2選擇生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，逐一輕輕幌動(dòng)細(xì)胞面數(shù)次后，用酒精棉球擦拭瓶口周?chē)?再經(jīng)過(guò)酒精燈火焰瞬時(shí)燒灼，倒去細(xì)胞生長(zhǎng)液。4.533任取上述細(xì)胞12瓶，每瓶按原液量.用吸管換入新的細(xì)胞維持液。用記號(hào)筆 標(biāo)記為“細(xì)

43、胞對(duì)照”。4.534任取上述細(xì)胞3瓶，每瓶用吸管接種相當(dāng)該細(xì)胞瓶生長(zhǎng)液量20%的疫苗中和 物，用記號(hào)筆標(biāo)記為“中和后”。4.5.3.5任取上述細(xì)胞3瓶，每瓶用吸管接種相當(dāng)該細(xì)胞瓶生長(zhǎng)液量20%的陰性對(duì)照 物，用記號(hào)筆標(biāo)記為“-”。4.5.3.6任取上述細(xì)胞3瓶，每瓶用吸管接種相當(dāng)該細(xì)胞瓶生長(zhǎng)液量20%的陽(yáng)性對(duì)照物，用記號(hào)筆標(biāo)記為“+”。4.5.3.7將接種細(xì)胞瓶按不同方向輕輕幌動(dòng)數(shù)次，使接種物能均勻散布于整個(gè)細(xì)胞面上， 然后，置培養(yǎng)箱中吸附一定時(shí)間（一般為3060分鐘，期間可再幌動(dòng)數(shù)次）。根據(jù)接 種物的特性，也可不經(jīng)吸附，直接補(bǔ)加細(xì)胞維持液；甚或可將接種物加入定量的細(xì)胞維 持液中，混勻后直接接

44、種細(xì)胞）。4.5.3.S吸附到時(shí)，取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，按接種順序，逐瓶補(bǔ)足細(xì)胞維持液。4.5.3.9逐瓶檢查瓶口是否塞緊，標(biāo)記是否正確等。確認(rèn)無(wú)誤后，置培養(yǎng)箱至規(guī)定時(shí)間。蝕斑技術(shù)（適用于雞馬立克氏病活疫苗）4.6.1按常規(guī)方法制備雞胚成纖維細(xì)胞單層。4.6.2選擇生長(zhǎng)良好的細(xì)胞至少7瓶，分別倒去細(xì)胞生長(zhǎng)液。463任取上述細(xì)胞3瓶，每瓶用吸管接種疫苗中和物，用記號(hào)筆標(biāo)記為“中和”。4.6.4任取上述細(xì)胞3瓶，每瓶用吸管接種陽(yáng)性對(duì)照物，用記號(hào)筆標(biāo)記為“陽(yáng)性對(duì)照”。4.6.5將上述接種細(xì)胞瓶移至37C 38C培養(yǎng)箱中吸附1小時(shí)。4.6.6取出細(xì)胞瓶，每瓶用吸管補(bǔ)加含2%牛血清的199營(yíng)養(yǎng)液至原液量。同時(shí)

45、，取正常 細(xì)胞1瓶，換以相同營(yíng)養(yǎng)液。置37C38C培養(yǎng)24小時(shí)。4.6.7制備營(yíng)養(yǎng)瓊脂（糖）。先取2%的瓊脂煮沸溶化后，令其降溫至46C47C,再 將含5%牛血清的199營(yíng)養(yǎng)液，置水浴中加熱至46C47C,然后取兩者等量混合即 成。4.6.8取出上述細(xì)胞瓶，倒去營(yíng)養(yǎng)液。然后，用吸管吸取相當(dāng)細(xì)胞瓶容量1/10的營(yíng)養(yǎng)瓊 脂（糖），小心復(fù)蓋在細(xì)胞層上，以不產(chǎn)生氣泡為宜，立即平放令其凝固。4.6.9待瓊脂（糖）層凝固后，將細(xì)胞瓶倒置于37C38C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)57天。4安全措施檢驗(yàn)人員必須穿戴工作服、鞋、帽和口罩。必要時(shí)，還應(yīng)戴上手套。滴撒在操作臺(tái)、地面和試管外的檢品材料，要及時(shí)擦拭消毒。用過(guò)的吸管、

46、注射器等器具和污染、廢棄物要先行消毒處理，再行清洗或丟棄。5記錄與計(jì)算要嚴(yán)格按照各產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的觀察內(nèi)容和時(shí)限，仔細(xì)觀察，詳實(shí)記錄。特別是接種動(dòng)物、雞胚的臨床反應(yīng)，及組織、病理變化和接種細(xì)胞的病變程度或蝕 斑數(shù)。取出細(xì)胞瓶，用肉眼觀察瓶底蝕斑。接種“疫苗中和物和“陽(yáng)性對(duì)照物”的細(xì)胞應(yīng)有典 型、清晰、形態(tài)不規(guī)則、邊緣不整齊、直徑在 1.5mm的乳白色蝕斑（而正常細(xì)胞則 無(wú)）。計(jì)數(shù)時(shí)，先用肉眼以蠟筆在瓶底點(diǎn)數(shù)，分別求出3瓶細(xì)胞的平均蝕斑數(shù)，再按下 式計(jì)算蝕斑減少率。陽(yáng)性對(duì)照平均蝕斑數(shù)樣品中和平均數(shù)蝕斑減少率二x 100%陽(yáng)性對(duì)照平均蝕斑數(shù)6結(jié)果判定按產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)判定疫苗與特異性血清中和后，接種

47、動(dòng)物或雞胚無(wú)臨床反應(yīng)和組織病理變化；接種宿主細(xì) 胞不產(chǎn)生病變(CPE)；且與“對(duì)照”(其產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定需設(shè)的)差異明顯，判該特 異性血清中和試驗(yàn)結(jié)果陰性，即該疫苗特異。蝕斑減少率95%的雞馬立克氏疫苗判為特異。7附錄及附加說(shuō)明如接種動(dòng)物或雞胚意外死亡，或接種細(xì)胞污染，按其產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法判定的，應(yīng)查 明原因重檢。當(dāng)疫苗與特異性血清中和后，接種動(dòng)物、雞胚或接種宿主細(xì)胞似有一定反應(yīng)，懷疑此 疫苗未被完全中和所致，可選用更高效價(jià)的特異性血清重檢。8滅活疫苗汞類(lèi)防腐劑含量測(cè)定法1技術(shù)依據(jù)及原理本測(cè)定法的原理是樣品加硫酸和硝酸，加熱進(jìn)行有機(jī)破壞，使硫柳汞的無(wú)機(jī)汞離 子，在一定條件下與雙硫腺生成螯合物，

48、雙硫腺的顏色由墨綠色變成黃色，滴定直到雙 硫腺綠色不變，汞離子全部螯合為終點(diǎn)，根據(jù)樣品和對(duì)照品的對(duì)照滴定可算出樣品中的 汞離子的量，即硫柳汞的量。2注意事項(xiàng)二氯化汞稱(chēng)重至0.1354g是困難的，可以取接近數(shù)值，近似0.1354golml注射器標(biāo)定用lml注射器吸取蒸鐳水至刻度，然后注入具塞稱(chēng)量瓶中，精密取水 至重量，同時(shí)測(cè)定水的溫度，用以下公式計(jì)算M1=M/DMl為注射器的實(shí)際容量，M為稱(chēng)得水的重量，D為測(cè)定溫度下水的密度g/ml。如：M二水溫20C時(shí)D二則注射器的實(shí)際容量為。油苗的消化是否徹底是試驗(yàn)關(guān)鍵.完全按照操作要求去做。凱氏燒瓶和分液漏斗不宜用太大的，否則影響結(jié)果和終點(diǎn)觀察。注射器抽取

49、樣品后要直接注入凱氏燒瓶底部，不能碰到瓶頸。3材料儀器及設(shè)備精密天平，烤箱等。試劑二氯化汞（AR）,鹽酸輕胺（AR）,硫酸（AR）,硝酸（AR）,雙硫腺（AR）, 氯仿（AR）,四氯化碳（AR）試驗(yàn)器具稱(chēng)量瓶、50ml量瓶、5ml、1ml移液管、25ml凱氏燒瓶、分液漏斗（125ml）、1ml注 射器（附15mm針頭）4檢驗(yàn)步驟對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取硫酸干燥器中干燥至恒重的二氯化汞0.1354g,置100 ml量瓶中，力口 1硫 酸溶液使溶解到刻度，搖勻。精密量取5 ml,置100 ml量瓶中，用1硫酸溶液稀釋至刻 度,搖勻，即得。每lml溶液含有Hg50Hgo試液制備雙硫蹤溶液取雙硫腺50

50、mg加氯仿100 ml溶解即得。棕色瓶中冷暗處保存。雙硫腺溶液取雙硫腺溶液2. 5ml加四氯化碳稀釋至100mlo（3） 20%鹽酸輕胺溶液取鹽酸輕胺lg加水至5 ml溶解.即得。（4） mol/1硫酸溶液取硫酸30ml,緩緩注入適量水中，冷卻至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻即得。供試品的制備油苗消化 用經(jīng)標(biāo)定的1ml注射器（附15 cm長(zhǎng)針頭）準(zhǔn)確量取搖勻的供試品溶液 1ml,置25ml凱氏燒瓶（瓶口附小漏斗）中，加硫酸3ml,加硝酸（1-2）,小心加 熱，待爆沸停止后，稍冷，再加硝酸（1-2） lml,再加熱消化，如此反復(fù)加硝酸（1-2）,直至白熾化加熱15分鐘后，溶液與上次加熱的顏色無(wú)改變?yōu)?/p>

51、止，放冷（溶 液應(yīng)無(wú)色），加水20ml,再放冷至室溫。供試品溶液滴定將上述消化液移入125ml分液漏斗，用水多次洗滌凱氏燒瓶，使總體積為80ml,加20%鹽酸甕胺溶液5ml,搖勻，用雙硫腺溶液滴定，開(kāi)始時(shí)每次滴加3ml左右，以后 逐漸減少，至每次，最后可少至，每次加入滴定液后，強(qiáng)烈振搖10秒鐘，靜置分層，棄 去四氯化碳層，繼續(xù)滴定，直至雙硫腺的綠色不變，即為終點(diǎn)。對(duì)照品溶液滴定精密量取對(duì)照品溶液lml （含汞50隧）,置125ml分液漏斗，加水80ml, 20%鹽酸 輕胺溶液5ml,用雙硫腺溶液滴定，操作同上。供試品溶液滴定毫升數(shù)（VI）對(duì)照品溶液滴定毫升數(shù)（V2）12記錄與計(jì)算汞類(lèi)含量 （g

52、/ml） = （VGV2）x一供試品毫升數(shù)）十結(jié)果判定將檢驗(yàn)結(jié)果與產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，按照產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定進(jìn)行判定。附注：試液制備1 %雙硫腺濃溶液 取雙硫腺50mg,加氯仿100ml使溶解.即得。本品應(yīng)置棕色瓶 內(nèi)，再冷暗處保存。2 %雙硫腺滴定液取雙硫腺濃溶液，用四氯化碳稀釋至100ml,即得。本液應(yīng)臨用 新制。3 20%鹽酸輕胺試液取鹽酸輕胺lg,加水5ml使溶解即得。9甲醛含量測(cè)定法1技術(shù)依據(jù)及原理本方法與英國(guó)藥典和歐洲藥典的方法原理基本一致。采用甲醛與乙酰丙酮在一定 PH條件下反應(yīng)，生成物為黃色.利用分光光度法測(cè)定反應(yīng)物在410nm波長(zhǎng)處的吸收 值，根據(jù)樣品和對(duì)照品的吸收值算出

53、甲醛的含量。2注意事項(xiàng)本方法測(cè)定時(shí)如果由于產(chǎn)品中甲醛的含量過(guò)高，使吸收值過(guò)大時(shí)可減少取樣量，或 擴(kuò)大供試品的稀釋倍數(shù)。油苗供試品溶液靜置分層時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)，以增強(qiáng)分層效果， 如經(jīng)過(guò)濾仍不能完全澄清，可繼續(xù)試驗(yàn)，不影響結(jié)果。3材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求儀器及設(shè)備紫外一可見(jiàn)分光光度計(jì)，精密天平和高溫箱等。試劑鹽酸（AR）,甲基紅一澳甲酚綠混合指示液，無(wú)水碳酸鈉（基準(zhǔn)），甲醛溶液（AR），吐溫80（AR）,乙醇（AR）,醋酸（AR）,醋酸鞍（AR）,乙酰丙酮（AR）,澳麝香草酚藍(lán)指示液，氫氧化鈉滴定液，過(guò)氧化氫試液。試驗(yàn)器具稱(chēng)量瓶；250ml錐形瓶；50ml量瓶；5ml移液管和5ml吸管；1m

54、l、移液管；10ml 量筒；125ml分液漏斗；水浴鍋等。4檢驗(yàn)步驟鹽酸滴定液（lmol/1）的配制與標(biāo)定4.1.1鹽酸滴定液（lmol/1）的配制取鹽酸90ml,加水至1000ml,搖勻即得。4.1.2甲基紅一澳甲酚綠乙醇混合指示液的配制取甲基紅乙醇溶液20ml,加;臭甲酚綠乙醇溶液30ml,搖勻即得。4.1.3鹽酸滴定液（lmol/1）的標(biāo)定取270300C干燥至恒重的基準(zhǔn)無(wú)水碳酸鈉1.5g精密稱(chēng)定，加水50ml使溶解 加 甲基紅一澳甲酚綠混合指示液10滴，將待標(biāo)定的鹽酸滴定液滴入制備好的碳酸鈉溶液 中至溶液由綠色變成紫紅色，煮沸2分鐘，冷卻至室溫，繼續(xù)滴定至溶液由綠色變?yōu)榘?紫色。每lml的鹽酸滴定液（lmol/1）相當(dāng)于的無(wú)水碳酸鈉根據(jù)鹽酸滴定液的消耗量與 無(wú)水碳酸鈉的取用量，算出鹽酸滴定液的濃度，用F值表示。記錄如下：123基準(zhǔn)物+稱(chēng)量瓶重第一次干燥后重（g）基準(zhǔn)物+稱(chēng)量瓶重第二次干燥后重(g)傾出基準(zhǔn)物后稱(chēng)量瓶重（g）基準(zhǔn)無(wú)水碳酸鈉重（g）鹽酸滴定液初讀數(shù)（ml）鹽酸滴定液終讀數(shù)（ml）鹽酸滴定液消耗數(shù)（ml）F=Wv （