川麥42不同逆境生長情況研究開題報(bào)告

1、 xx農(nóng)業(yè)大學(xué)本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）開題報(bào)告畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）題目不同逆境對川麥42的生理影響選題類型基礎(chǔ)型課題來源自選項(xiàng)目學(xué) 院專 業(yè)化學(xué)生物學(xué)指導(dǎo)教師職 稱姓 名xx年 級2009級學(xué) 號1 研究背景及立題依據(jù)小麥?zhǔn)菃巫尤~植物，有禾本科的特征：葉脈平行，莖中空有節(jié)，穗狀花絮，每朵小花無花瓣但有穎片。因此小麥又稱為穎花植物。小麥穎片上有芒刺，是區(qū)別小麥品種的特點(diǎn)之一。小麥作為一種人類主要的食物來源更是經(jīng)濟(jì)來源，在中國也廣泛的種植，主要產(chǎn)區(qū)為：河北、山西、河南、山東、安徽、湖北、江蘇、四川以及陜西。小麥?zhǔn)侨澜绶N植面積最大的糧食作物1，也是人們生活當(dāng)中必不可少的食物之一，但是各種自然災(zāi)害影響著小

2、麥的產(chǎn)量。植物在自然界受到的脅迫并不只有一種，不同脅迫導(dǎo)致小麥生理生化指標(biāo)的變化也不相同。因此使用單一脅迫處理來評價(jià)小麥的抗逆性具有一定的局限性，且各項(xiàng)指標(biāo)存在著一定的相關(guān)性，因此需要檢測小麥的抗逆性需要評價(jià)其多個(gè)脅迫下各項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)。四川省有很多小麥品種，其中川麥42是四川省區(qū)試以來第一個(gè)平均每公頃突破6000kg的小麥新品種，先后通過四川省和國家審定2。該小麥綜合了四倍體小麥與節(jié)節(jié)麥的優(yōu)良性狀，其遺傳變異類型豐富，蘊(yùn)藏豐富的抗病、抗逆、優(yōu)質(zhì)和高產(chǎn)基因。為了對川麥42的抗逆性做出鑒定，對小麥在不同的逆境（干旱、低溫、鹽漬）生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定。植物在遭受逆境（干旱、鹽漬、低溫等）脅迫時(shí)，其內(nèi)部

3、會(huì)發(fā)生一系列的變化，以此來適應(yīng)各種逆境生理生化的變化可以反映其受環(huán)境脅迫的狀態(tài)和程度3-5。小麥的抗旱性是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)性狀，是多個(gè)因素共同作用的結(jié)果。有的學(xué)者在小麥幼苗期進(jìn)行抗旱性研究5,7，提出生理生化指標(biāo)的變化可以作為小麥抗旱性鑒定的依據(jù)。干旱作為一種自然災(zāi)害嚴(yán)重影響著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，對植物造成多種傷害，包括損傷膜系統(tǒng)及細(xì)胞器，破壞正常的物質(zhì)代謝，改變酶活性，使呼吸作用增強(qiáng)，光合作用增強(qiáng)等6,7。研究干旱對植物的傷害機(jī)制有助于進(jìn)一步了解植物的抗旱適應(yīng)性機(jī)理，從而可為物種選育與栽培，以及新品種的推廣種植提供科學(xué)依據(jù)。干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致植物產(chǎn)生大量的活性氧（ros），過量的ros的清除對于維持植物正

4、常的功能具有重要意義。因此測定植物抗氧能力可以了解植物防御體系受干旱影響的狀況。鹽漬是世界范圍內(nèi)影響農(nóng)作物產(chǎn)量的非生物脅迫因子之一8，開展小麥耐鹽生理的研究和實(shí)踐，已經(jīng)引起人們的廣泛重視，耐鹽性已經(jīng)成為我國小麥生產(chǎn)有關(guān)研究的重要課題。國內(nèi)外的小麥育種、栽培和生理學(xué)家們在小麥耐鹽性方面做了大量工作，如對氯化鈉脅迫下小麥品種對鉀吸收運(yùn)輸?shù)倪x擇性、幼苗葉片細(xì)胞中繩頭調(diào)節(jié)的積累及抗氧化物酶活性的變化、氯化鈉脅迫對小麥光合作用的影響等。氯化鈉脅迫下小麥減產(chǎn)的主要原因是出苗難，植株生長變緩，最終影響產(chǎn)量9,10。低溫寒害也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中造成嚴(yán)重?fù)p失的自然災(zāi)害一，會(huì)對包括小麥在內(nèi)的許多作物的產(chǎn)量造成巨大的損失

5、11,12，關(guān)于冬小麥研究已經(jīng)有不少報(bào)道13，植物的抗寒性與活性氧代謝關(guān)系密切，低溫脅迫下植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的h2o2、o2-、oh等活性氧自由基，這些活性氧能造成膜脂過氧化，進(jìn)而造成膜系統(tǒng)的損傷。植物體內(nèi)存在著一系列酶促的和非酶促的抗氧化劑以清除活性氧自由基，保護(hù)植物細(xì)胞免受活性氧的傷害，維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，以增強(qiáng)植株的抗寒性14。超氧化物歧化酶（sod）、過氧化物酶體（pod）、過氧化氫酶（cat）被認(rèn)為是清除活性氧過程中最主要的抗氧化酶類，使植物在一定程度上忍耐、減緩或者抵抗低溫脅迫。小麥經(jīng)過低溫脅迫后會(huì)發(fā)生一系列的變化，其中一些指標(biāo)，如超氧化物歧化酶的活性及丙二醛的含量可以作為小麥抗凍性

6、的生理生化指標(biāo)14。低溫脅迫下植物可積累更多的可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)。植物體的碳素營養(yǎng)中主要是可溶性糖和淀粉，它們在營養(yǎng)中的作用無法替代（如合成細(xì)胞壁、轉(zhuǎn)換合成其他有機(jī)物等）。丙二醛（mda）是細(xì)胞膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，丙二醛的產(chǎn)生數(shù)量多少能代表細(xì)胞膜脂過氧化的程度，可以間接反映植物組織抗氧化能力的大小。高等植物在逆境下脯氨酸的含量也引起了人們的廣泛重視。因此可以通過測定植物體內(nèi)超氧化物歧化酶（sod）、過氧化物酶（pod）及過氧化氫酶（cat）酶活性，可溶性蛋白、可溶性糖、丙二醛、葉綠素及脯氨酸的含量，以此來衡量小麥的抗逆性。2 研究的主要內(nèi)容與預(yù)期目

7、標(biāo)選取萌發(fā)一致的川麥42種子植于消過毒的石英砂中，置于251 、12 h / 12h光/暗周期、中等光強(qiáng)（光流密度100 mol m-2 s-1）的恒溫室中培養(yǎng)，待長直三葉期，選取長勢相似小麥幼苗進(jìn)行不同的脅迫處理（鹽脅迫、干旱脅、低溫脅迫）24 h和72 h，對脅迫前后小麥中超氧化物歧化酶（sod）、過氧化物酶體（pod）、過氧化氫酶（cat）、可溶性蛋白、脯氨酸、可溶性糖、丙二醛、葉綠素含量進(jìn)行測定，通過對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析從而對小麥抗旱性、抗旱性及耐鹽性做出評價(jià)，并對小麥的抗逆性研究提供依據(jù)。3 研究方案3.1 實(shí)驗(yàn)流程種子萌發(fā)移植入石英砂鹽脅迫干旱脅迫【哦低溫脅迫空白萌發(fā)后測量分析培植至三

8、葉期3.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料3.2.1 儀器分管光度計(jì)，電子天平，研缽，容量瓶，燒杯，恒溫水浴鍋，試管，離心機(jī)，漏斗。3.2.2 試劑95%乙醇，丙酮，氮藍(lán)四唑（nbt），硫代巴比妥（tba），三氯乙酸，冰乙酸，甲苯，茚三酮，考馬斯亮藍(lán)g-250，蒽酮，濃硫酸，牛血清蛋白，l-脯氨酸，葡萄糖，磷酸緩沖液（以上溶液均為分析純）3.2.3 材料川麥42（來自四川省農(nóng)科院）3.3 實(shí)驗(yàn)方法3.3.1 樣品的預(yù)處理將生長到3葉期的川麥42幼苗，洗凈根部營養(yǎng)液，分別進(jìn)行鹽漬脅迫（0.3 mol/l氯化鈉溶液）、干旱脅迫（20% peg6000）、低溫脅迫培養(yǎng)（4 ），以上脅迫處理均設(shè)兩組分別標(biāo)注為1天和3

9、天。待脅迫處理完畢之后根據(jù)測定項(xiàng)目采樣3.3.2 葉綠素的測定稱取小麥葉片0.2 g剪碎置于研缽中，加少許caco3，石英砂、95%乙醇（ar）丙酮（ar）1:1充分研磨，過濾，將濾液移入25 ml容量瓶，用95%乙醇（ar）丙酮（ar）1:1反復(fù)洗滌殘?jiān)?、濾紙至無綠色，合并濾液，定容。取上述提取液1 ml稀釋至10 ml，搖勻。用95%乙醇（ar）丙酮（ar）1:1為參照，在分光光度計(jì)665 / 649 nm下測其光密度。chla含量（mg/g）=(13.95d6656.88d649)v/(w1000)chlb含量（mg/g）=（24.96d6497.32d665）v/(w1000)3.3.

10、3 超氧化物歧化酶（sod）的測定3.3.3.1 酶液制備取小麥葉片(去葉脈) 0.5 g于預(yù)冷的研缽中，加1 ml磷酸緩沖液在冰浴下研磨成勻漿，倒入10 ml刻度試管中，加緩沖液定容為5 ml。取2 ml于離心管離心20 min，上清液即為sod粗提液。3.3.3.2 酶活力測定：用nbt光還原法15。每個(gè)樣品取8個(gè)潔凈干燥的微燒杯(透明度好)編號，按表加入各試劑，反應(yīng)系統(tǒng)總體積為3 ml。其中48號管中磷酸緩沖液和酶液的加入量依樣品中的酶活性進(jìn)行調(diào)整，如果酶活性強(qiáng)時(shí)，可適當(dāng)減少酶液用量。試劑全部加入后混勻，將1號杯置于暗處，其余各杯均于25 、4000 lx日光燈下反應(yīng)20 min，各管受

11、光情況要一致。溫度高時(shí)，時(shí)間縮短；溫度低時(shí)，時(shí)間延長，然后立即遮光停止反應(yīng)。反應(yīng)中各試劑用量如下表所示：130 mmol/lmet（ml）750 mol/lnbt（ml）100 mol/ledta二鈉（ml）20 mol/l核黃素（ml）酶液(l)蒸餾水(ml)123456780.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30005101520251.81.81.81.7951.791.7851.781.775在560 nm波長下，以1號杯調(diào)零，測定其

12、余各杯反應(yīng)體系的光密度。以2、3號杯吸光度的平均值作為還原率的100，分別計(jì)算不同酶液量抑制nbt光還原的相對百分率。以酶液用量為橫坐標(biāo)，以nbt光化還原的抑制率()為縱坐標(biāo)繪制二者相關(guān)曲線，nbt光化還原被抑制50的酶液量為一個(gè)酶活單位。sod總活性u/g= sod比活性u/mg=3.3.4 過氧化物酶體（pod）的測定3.3.4.1 酶液制備稱取新鮮小麥葉片0.1 g，剪碎，放入預(yù)冷的研缽中，加入適量預(yù)冷的磷酸緩沖液冰浴研磨成勻漿。殘?jiān)儆?ml磷酸緩沖液提取一次，合并兩次勻漿液，以4000 r/min低溫離心15 min，上清液即為粗酶液，定容至25 ml，酶液貯于低溫下備用。3.3.4

13、.2 酶活力測定：采用愈創(chuàng)木酚法測定15取2支試管，于1支中加入反應(yīng)混合液3 ml。和磷酸緩沖液1 ml，作為對照，另1支中加入反應(yīng)混合液3 ml，和上述酶液1 ml。(如酶活性過高可稀釋之)。迅速將兩支試管中溶液混勻后，倒人比色杯，置于分光光度計(jì)樣品室內(nèi)，立即開啟秒表記錄時(shí)間，于470 nm處測定光密度，每隔30 s讀數(shù)一次。3.3.5 過氧化氫酶（cat）的測定3.3.5.1 酶液制備稱剪碎混勻的小麥葉片1.00 g置于預(yù)冷的研缽中，加適量磷酸緩沖液及少量石英砂，在冰浴上研磨勻漿，轉(zhuǎn)移至25 ml容量瓶中，用磷酸緩沖液沖洗研缽2-3次(每次l-2 ml)，合并沖洗液于容量瓶中，定容至25

14、ml，搖勻。取提取液5 ml于離心管中，在4 、15000 r/min下離心15 min，上清液即為酶提取液，4 下保存?zhèn)溆谩?.3.5.2 cat活性的測定：采用紫外分光光度法15 取10 ml具塞試管，加2 ml酶提取液于沸水浴中加熱煮致失活，冷卻備用。取10 ml試管4支，3支為測定(3個(gè)重復(fù))，1支為對照，按下表加入試劑。1234tris-hcl酶提取液蒸餾水1.00.11.71.00.11.71.00.11.71.00.1（高溫失活）1.7將上述4支試管于25 水浴中預(yù)熱3 min后，逐管加入0.2 ml 100 mmol/l h2o2溶液，每加一管立即在紫外分光光度計(jì)上測定a240

15、(蒸餾水調(diào)零)，每隔30 s讀數(shù)一次，共測4 min，記錄4支試管的測定值。3.3.6 總蛋白含量的測定3.3.6.1 可溶性蛋白質(zhì)的提取取0.750 g小麥幼苗葉片，放入研缽，加10 ml蒸餾水在冰浴中研成勻漿，再在4000 r/min離心10 min，將上清液倒入10 ml容量瓶，再向殘?jiān)屑? ml蒸餾水，懸浮，4000 r/min離心10 min并合并上清液，定容至刻度。3.3.6.2蛋白質(zhì)含量的測定：采用考馬斯亮藍(lán)g-250法測定16標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支試管，編號，按下表加入試劑。123456蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液/ml蒸餾水/ml考馬斯亮藍(lán)試劑/ml蛋白質(zhì)含量/g 01.0500.20.8

16、5200.40.65400.60.45600.80.25801.005100混勻，各管震蕩程度應(yīng)該盡量一致。放置10 min，在595 nm波長下比色測定，比色應(yīng)在1 h內(nèi)完成。以牛血清蛋白含量(g)為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中蛋白質(zhì)含量的測定另取2根試管，分別準(zhǔn)確加入0.1 ml樣品提取液，0.9 ml蒸餾水和5 ml考馬斯亮藍(lán)g-250試劑,其余操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制相同，測其吸光值。3.3.7 脯氨酸含量的測定3.3.7.1 脯氨酸提取取0.050.5 g小麥葉片，用3磺基水楊酸溶液研磨提取，磺基水楊酸的最終體積為5 ml。勻漿液轉(zhuǎn)入玻璃離心管中，在沸水浴中浸提10 mi

17、n。冷卻后，以3000 r/min，離心10 min，取上清液待測。3.3.7.2 脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及樣品的測定：采用茚三酮比色法15脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及樣品的測定：取7個(gè)25 ml容量瓶編號17，分別加入0 ml、05 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml、2.5 ml和3.0 ml脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液水定容到25 ml。取8支具塞試管，分別編號1-8號，1-7號取上述容量瓶的脯氨酸液，8號為樣品測定管。按下表操作：1.2345678脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液、樣液（ml）水（ml）冰乙酸（ml）茚三酮（ml）脯氨酸濃度（g/ml）02220202222022420226202282022102

18、022122022x上述8支管沸水浴30 min后冷卻至室溫，各加4 ml甲苯，萃取0.5 min后靜置，分層后用注射器吸取上層紅色溶液，520 nm波長下讀a值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并查出x值。計(jì)算公式：脯氨酸含量（g/g）=x5m3.3.8 可溶性糖的測定3.3.8.1 可溶性糖的提取取新鮮植物葉片，擦凈表面污物，剪碎混勻，稱取0.10-0.30 g，共3份，分別放人3支刻度試管中，加入5-10 ml蒸餾水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min(提取2次)，提取液過濾人25 ml容量瓶中，反復(fù)沖洗試管及殘?jiān)?，定容至刻度?.3.8.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取20 ml刻度試管6支，從0-5分別編號，

19、按下表加入標(biāo)葡萄糖溶液，然后按順序向試管內(nèi)加人試劑，充分振蕩，立即將試管放人沸水浴中，逐管準(zhǔn)確保溫l min，取出后自然冷卻至室溫，以空白作對照，在625 nm波長下測其光密度，以光密度為縱坐標(biāo)，以糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出標(biāo)準(zhǔn)線性方程。012345100g/ml葡萄糖溶液蒸餾水蒽酮試劑蔗糖含量(g/管）01500.20.85200.40.65400.60.45600.80.25801.0051003.3.8.3顯色及數(shù)據(jù)處理顯色測定吸取樣品提取液0.5 ml于20 ml刻度試管中(重復(fù)兩次)，加蒸餾水1.5 ml，以下步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線測定相同，測定樣品的光密度a625。對照曲線求的未

20、知溶液的可溶性糖含量?？扇苄蕴堑暮?%)=3.3.9 丙二醛含量的測定3.3.9.1 樣品提取取葉片1 g將其剪碎，加入10%三氯乙酸(tca)2 ml和少量石英砂，研磨；進(jìn)一步加入8 ml tca充分研磨，勻漿液以4000 r/min離心10 min，上清液即為樣品提取液。3.3.9.2 顯色及測定：采用tba比色法17吸取2 ml提取液，加入2 ml0.6tba液，混勻，在試管上加蓋塞，置于沸水浴中沸煮10-15 min（不得超過此時(shí)間）迅速冷卻，離心。取上清液測定532 nm和450 nm，600 nm處的光密度。mda濃度=6.45(a532-a600)-0.56a450mda含量（

21、mol/g）=4 論文進(jìn)度安排第一階段：2011年12月-2012年2月，確定研究課題，查閱相關(guān)參考文獻(xiàn)為撰寫開題報(bào)告做準(zhǔn)備。第二階段：2012年3月-2012年4月，撰寫開題報(bào)告，制作ppt準(zhǔn)備開題報(bào)告答辯。第三階段：2012年5月，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料，做預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步修改實(shí)驗(yàn)方案。第四階段：2012年6月-2012年7月，按照修改好的實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。第五階段：2012年9月，對本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行整理、分析并撰寫論文。5 主要參考文獻(xiàn)：1 劉艷麗, 許海霞, 劉桂珍. 小麥耐鹽性研究進(jìn)展j. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2008, 24(11):202-2062 張知儀, 李朝蘇, 郭大明,

22、川麥42等人工合成小麥衍生品種的示范推廣及成效j. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 22(4):11643 張秋芳. 作物硫素營養(yǎng)的生理作用及其脅迫研究j.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 23(5):136-1394 祁葆滋. 硫營養(yǎng)對小麥、玉米碳、氮低代謝中幾項(xiàng)生理參數(shù)的影響j. 作物學(xué)報(bào), 1989, 15(1):31-355 盧從明, 張其德, 匡庭云, 等. 水分脅迫抑制水稻光合作用的機(jī)理j. 作物學(xué)報(bào), 1994, 20(50):601-6066 wilmams j g, kubelika u r, livak k j, et al. dna polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markersj. nucleic a cids res, 1990, 18(3):6531-65357 welsh j, mcclelland m. fingerprinting gencm es using pcr with arbitrary primej. nucleic acids, 1996, 11:42-448 boyer j s. plant productivity and environment j. sci, 1982, 218:443