病毒與細(xì)胞相互作用課件

1、病毒與細(xì)胞相互作用1 第四章第四章 病毒與細(xì)胞間的相互作用病毒與細(xì)胞間的相互作用 第一節(jié)第一節(jié) 病毒的培養(yǎng)病毒的培養(yǎng) 第二節(jié)第二節(jié) 病毒與細(xì)胞的相互作用病毒與細(xì)胞的相互作用 病毒與細(xì)胞相互作用2 第一節(jié)第一節(jié) 病毒的培養(yǎng)病毒的培養(yǎng) 病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生微生物，培養(yǎng)病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生微生物，培養(yǎng) 病毒必須使用細(xì)胞。根據(jù)病毒的不同選用敏病毒必須使用細(xì)胞。根據(jù)病毒的不同選用敏 感動物（感動物（動物接種動物接種）、雞胚（）、雞胚（雞胚接種雞胚接種）或）或 離體細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)（離體細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)（細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)）。）。 病毒與細(xì)胞相互作用3 動物接種：動物接種：接種后通常以動物發(fā)病、死亡作為

2、感染的指標(biāo)。 接種后通常以動物發(fā)病、死亡作為感染的指標(biāo)。 按病毒侵襲部位不同選擇適當(dāng)?shù)慕臃N途徑。嗜按病毒侵襲部位不同選擇適當(dāng)?shù)慕臃N途徑。嗜 神經(jīng)病毒接種在小鼠的腦內(nèi)。痘苗病毒和單純神經(jīng)病毒接種在小鼠的腦內(nèi)。痘苗病毒和單純 皰疹病毒接種于家兔角膜。皰疹病毒接種于家兔角膜。 雞胚接種：雞胚接種：一種比較經(jīng)濟(jì)簡便的方法。一種比較經(jīng)濟(jì)簡便的方法。 一般采用孵化一般采用孵化9-12天的雞胚，按病毒種類不同天的雞胚，按病毒種類不同 接種于雞胚的不同部位。接種于雞胚的不同部位。 病毒與細(xì)胞相互作用4 可采用絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔接種?？刹捎媒q毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔接種。 病毒與細(xì)胞相互作用5 人或動物

3、細(xì)胞在一定條件下可在實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)瓶內(nèi)生長。人或動物細(xì)胞在一定條件下可在實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)瓶內(nèi)生長。 優(yōu)點(diǎn)： n每個(gè)細(xì)胞生理特性基本一致，對病毒易感性相等每個(gè)細(xì)胞生理特性基本一致，對病毒易感性相等 n無個(gè)體差異，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好無個(gè)體差異，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好 n可嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作可嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作 n細(xì)胞培養(yǎng)本身就能顯示病毒的生長特征細(xì)胞培養(yǎng)本身就能顯示病毒的生長特征 n應(yīng)用空斑技術(shù)可進(jìn)行病毒的克隆化應(yīng)用空斑技術(shù)可進(jìn)行病毒的克隆化 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 病毒與細(xì)胞相互作用6 n原代細(xì)胞（原代細(xì)胞（primary cell） 動物組織經(jīng)胰蛋白酶消化動物組織經(jīng)胰蛋白酶消化 處理，使細(xì)胞分散而得到的細(xì)胞。處理，使

4、細(xì)胞分散而得到的細(xì)胞。 n二倍體細(xì)胞株（二倍體細(xì)胞株（diploid cell strain） 將長成單層將長成單層 的原代細(xì)胞消化分散成單個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)傳代，其染色的原代細(xì)胞消化分散成單個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)傳代，其染色 體數(shù)與原代細(xì)胞一樣，保持其二倍染色體數(shù)目的細(xì)胞，稱體數(shù)與原代細(xì)胞一樣，保持其二倍染色體數(shù)目的細(xì)胞，稱 為二倍體細(xì)胞。為二倍體細(xì)胞。 n傳代細(xì)胞系（傳代細(xì)胞系（established cell line）能在體外持續(xù)能在體外持續(xù) 增殖傳代的細(xì)胞，大多數(shù)由癌細(xì)胞或二倍體細(xì)胞突變而成。增殖傳代的細(xì)胞，大多數(shù)由癌細(xì)胞或二倍體細(xì)胞突變而成。 （一）細(xì)胞的類型（一）細(xì)胞的類型 病毒與細(xì)胞相

5、互作用7 （二）細(xì)胞培養(yǎng)的方法（二）細(xì)胞培養(yǎng)的方法 靜置培養(yǎng)（靜置培養(yǎng)（stationary culture） 實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室 常用。細(xì)胞懸液裝瓶，常用。細(xì)胞懸液裝瓶，5%CO2溫箱靜置培養(yǎng)，溫箱靜置培養(yǎng)， 細(xì)胞沉降并貼附在玻面上生長分裂，最后長成單細(xì)胞沉降并貼附在玻面上生長分裂，最后長成單 層。層。 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)（旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)（roller culture） 大規(guī)模生產(chǎn)疫大規(guī)模生產(chǎn)疫 苗。細(xì)胞在玻瓶內(nèi)生長時(shí)，玻瓶不斷緩慢旋轉(zhuǎn)，苗。細(xì)胞在玻瓶內(nèi)生長時(shí)，玻瓶不斷緩慢旋轉(zhuǎn)， 細(xì)胞帖附于玻瓶四周，長成單層。細(xì)胞帖附于玻瓶四周，長成單層。 病毒與細(xì)胞相互作用8 懸浮培養(yǎng)（懸浮培養(yǎng)（suspensive cult

6、ure） 通過攪拌使細(xì)胞處通過攪拌使細(xì)胞處 于懸浮狀態(tài)，并補(bǔ)充營養(yǎng)和校正于懸浮狀態(tài)，并補(bǔ)充營養(yǎng)和校正pH，使之生長或維持，使之生長或維持 存活。存活。 微載體培養(yǎng)（微載體培養(yǎng)（micro-carrier culture） 是在懸浮培養(yǎng)是在懸浮培養(yǎng) 的基礎(chǔ)上，結(jié)合微載體的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。的基礎(chǔ)上，結(jié)合微載體的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。 微載體是直徑微載體是直徑10035m的微小顆粒，對細(xì)胞無毒的微小顆粒，對細(xì)胞無毒 性，細(xì)胞可貼附其上長成單層。性，細(xì)胞可貼附其上長成單層。 病毒與細(xì)胞相互作用9 第二節(jié)第二節(jié) 病毒與細(xì)胞的相互作用病毒與細(xì)胞的相互作用 n殺細(xì)胞感染殺細(xì)胞感染 n非殺細(xì)胞感染非殺細(xì)胞感染 引致持續(xù)

7、感染，對細(xì)胞代謝無影響。引致持續(xù)感染，對細(xì)胞代謝無影響。 n產(chǎn)生干擾素產(chǎn)生干擾素 病毒與細(xì)胞相互作用10 生產(chǎn)性感染（生產(chǎn)性感染（productive），），病毒感染后能產(chǎn)生和釋放病毒感染后能產(chǎn)生和釋放 子代病毒顆粒。宿主細(xì)胞感染病毒發(fā)生的變化可能是細(xì)子代病毒顆粒。宿主細(xì)胞感染病毒發(fā)生的變化可能是細(xì) 胞死亡或細(xì)胞轉(zhuǎn)化胞死亡或細(xì)胞轉(zhuǎn)化 非生產(chǎn)性感染（非生產(chǎn)性感染（nonproductive）或稱頓挫感染或稱頓挫感染 （abortive infection） 病毒感染后不形成完整的病毒病毒感染后不形成完整的病毒 顆粒顆粒 持續(xù)性感染（持續(xù)性感染（persistent infection）是指持續(xù)長

8、時(shí)間是指持續(xù)長時(shí)間 的感染，感染過程中不形成感染性的病毒顆粒的感染，感染過程中不形成感染性的病毒顆粒 病毒與細(xì)胞相互作用11 病毒與細(xì)胞的相互作用病毒與細(xì)胞的相互作用 感染的類型感染的類型對細(xì)胞的影響對細(xì)胞的影響是否產(chǎn)生傳染性病是否產(chǎn)生傳染性病 毒顆粒毒顆粒 例證例證 殺細(xì)胞殺細(xì)胞 細(xì)胞病變（細(xì)胞病變（CPE），細(xì)），細(xì) 胞蛋白質(zhì)、胞蛋白質(zhì)、RNA、DNA 合成被抑制。細(xì)胞死亡合成被抑制。細(xì)胞死亡 是是 甲型皰疹病毒、腸甲型皰疹病毒、腸 病毒、呼腸孤病毒病毒、呼腸孤病毒 持續(xù)性、生產(chǎn)性持續(xù)性、生產(chǎn)性 無無CPE，細(xì)胞代謝無甚，細(xì)胞代謝無甚 妨礙，細(xì)胞繼續(xù)分裂，妨礙，細(xì)胞繼續(xù)分裂， 某些分化的細(xì)

9、胞可失去某些分化的細(xì)胞可失去 某些功能某些功能 是是 瘟病毒、砂粒病毒、瘟病毒、砂粒病毒、 狂犬病毒、大多數(shù)狂犬病毒、大多數(shù) 反錄病毒反錄病毒 持續(xù)性、非生產(chǎn)性持續(xù)性、非生產(chǎn)性 通常無影響通常無影響否，但可通過共培否，但可通過共培 養(yǎng)等誘導(dǎo)養(yǎng)等誘導(dǎo) 腦組織的犬瘟熱病腦組織的犬瘟熱病 毒毒 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞可細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞可 無限制傳代無限制傳代 移植至實(shí)驗(yàn)動物可產(chǎn)生移植至實(shí)驗(yàn)動物可產(chǎn)生 腫瘤腫瘤 否，致腫瘤否，致腫瘤DNA病病 毒毒 是，致腫瘤反錄病是，致腫瘤反錄病 毒毒 多瘤病毒、腺病毒多瘤病毒、腺病毒 鼠、禽白血病病毒鼠、禽白血病病毒 病毒與細(xì)胞相互作用12 一、病毒引致的

10、殺細(xì)胞變化 細(xì)胞病變效應(yīng)細(xì)胞病變效應(yīng)( (cytopathic effect,cytopathic effect,CPECPE) ) 由病由病 毒感染導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。毒感染導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。CPECPE能在光學(xué)顯微鏡能在光學(xué)顯微鏡 下觀察。常見的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化為細(xì)胞變圓、下觀察。常見的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化為細(xì)胞變圓、 壞死、溶解、脫落或形成合胞體。有些病毒能壞死、溶解、脫落或形成合胞體。有些病毒能 形成包涵體。形成包涵體。 病毒與細(xì)胞相互作用13 細(xì)胞腫大細(xì)胞腫大 細(xì)胞圓縮細(xì)胞圓縮 形成合胞體形成合胞體 病毒所致的細(xì)胞病變病毒所致的細(xì)胞病變 病毒與細(xì)胞相互作用14 tissue culture cel

11、ls epithelialepithelioidfibroblastic 病毒與細(xì)胞相互作用15 epithelial cells uninfectedearly infectionlate infection slides from CDC 病毒與細(xì)胞相互作用16 fibroblastic cells uninfectedearly infectionlate infection slides from CDC 病毒與細(xì)胞相互作用17 Formation of multinucleated cells. 病毒與細(xì)胞相互作用18 能夠使半數(shù)組織細(xì)胞在一定條件下發(fā)生細(xì)胞能夠使半數(shù)組織細(xì)胞在一定條

12、件下發(fā)生細(xì)胞 病變的病毒量。用于判定病毒的毒力病變的病毒量。用于判定病毒的毒力。 半數(shù)組織細(xì)胞感染量（半數(shù)組織細(xì)胞感染量（tissue culture infectious tissue culture infectious dose 50,dose 50, TCIDTCID50 50） ） 病毒與細(xì)胞相互作用19 涉及細(xì)胞膜的涉及細(xì)胞膜的CPE 有囊膜的病毒出芽過程中有囊膜的病毒出芽過程中 能將其融合蛋白直接插入宿主細(xì)胞膜，結(jié)果導(dǎo)能將其融合蛋白直接插入宿主細(xì)胞膜，結(jié)果導(dǎo) 致膜融合以及合胞體（致膜融合以及合胞體（syncytia）形成。）形成。 慢病毒、副粘病毒、麻疹病毒、肺病毒、某慢病毒、副

13、粘病毒、麻疹病毒、肺病毒、某 些皰疹病毒等感染些皰疹病毒等感染 涉及細(xì)胞骨架的涉及細(xì)胞骨架的CPE 微絲（如微絲（如actin）、中介）、中介 絲（如絲（如vimentin）及微管（如）及微管（如tubulin）等細(xì)）等細(xì) 胞骨架與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性、物質(zhì)運(yùn)輸及運(yùn)動胞骨架與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性、物質(zhì)運(yùn)輸及運(yùn)動 性等有關(guān)。性等有關(guān)。 病毒與細(xì)胞相互作用20 病毒引致的細(xì)胞凋亡與壞死病毒引致的細(xì)胞凋亡與壞死 壞死（壞死（necrosis）、）、 凋亡（凋亡（apoptosis） 圖2432-2 感染犬瘟熱病毒凋亡的 Vero細(xì)胞的電鏡照片 病毒與細(xì)胞相互作用21 病毒感染抗體依賴的增強(qiáng)作用病毒感染抗體依

14、賴的增強(qiáng)作用（Antibody- dependent enhancement of viral infection, ADE） 在病毒感染過程中，宿主產(chǎn)生的抗體與病在病毒感染過程中，宿主產(chǎn)生的抗體與病 毒結(jié)合，非但未能阻斷病毒吸附宿主細(xì)胞，反而增毒結(jié)合，非但未能阻斷病毒吸附宿主細(xì)胞，反而增 強(qiáng)了病毒對細(xì)胞的感染，提高了病毒的滴度。強(qiáng)了病毒對細(xì)胞的感染，提高了病毒的滴度。 病毒與細(xì)胞相互作用22 （一）空斑試驗(yàn)（一）空斑試驗(yàn) 將適當(dāng)濃度的病毒懸液加入單層細(xì)胞培養(yǎng)將適當(dāng)濃度的病毒懸液加入單層細(xì)胞培養(yǎng) 中，當(dāng)病毒吸附細(xì)胞后，再覆蓋一層融化中，當(dāng)病毒吸附細(xì)胞后，再覆蓋一層融化 的瓊脂。病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制

15、后產(chǎn)生局限性的瓊脂。病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制后產(chǎn)生局限性 病灶，病灶逐漸擴(kuò)大，肉眼也能看見，此病灶，病灶逐漸擴(kuò)大，肉眼也能看見，此 即即空斑空斑(plaque)。 病毒與細(xì)胞相互作用23 病毒與細(xì)胞相互作用24 空斑是由一個(gè)感染性病毒粒子復(fù)制形成的，類似于細(xì)菌的菌落，空斑是由一個(gè)感染性病毒粒子復(fù)制形成的，類似于細(xì)菌的菌落， 稱為稱為空斑形成單位（空斑形成單位（PFU）。病毒懸液中的感染性病毒量以每病毒懸液中的感染性病毒量以每 毫升含有的毫升含有的PFU來表示。來表示。 病毒與細(xì)胞相互作用25 空斑試驗(yàn)的用途：空斑試驗(yàn)的用途： 1. 測定病毒數(shù)量測定病毒數(shù)量 2. 純化病毒純化病毒 單個(gè)空斑作懸液，梯度

16、稀釋后再作空斑，單個(gè)空斑作懸液，梯度稀釋后再作空斑， 可獲得病毒克隆?？色@得病毒克隆。 3. 鑒定病毒鑒定病毒 不同病毒的空斑具有不同的特征。不同病毒的空斑具有不同的特征。 病毒與細(xì)胞相互作用26 （二）包涵體（二）包涵體（inclusion body) 定義：定義：是某些病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生的特征性的是某些病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生的特征性的 形態(tài)變化，在普通光學(xué)顯微鏡下可見胞漿或形態(tài)變化，在普通光學(xué)顯微鏡下可見胞漿或 胞核內(nèi)出現(xiàn)的呈嗜酸性或嗜堿性染色、大小胞核內(nèi)出現(xiàn)的呈嗜酸性或嗜堿性染色、大小 數(shù)量不等的圓形或不規(guī)則形的團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，數(shù)量不等的圓形或不規(guī)則形的團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)， 稱為包涵體。稱為包涵體。 病毒與

17、細(xì)胞相互作用27 圖圖324-4 皰疹病毒的包涵體皰疹病毒的包涵體 病毒與細(xì)胞相互作用28 包涵體的性質(zhì)包涵體的性質(zhì) n病毒成分的蓄積，如狂犬病毒的病毒成分的蓄積，如狂犬病毒的Negri氏體氏體 n大量晶格樣排列的病毒顆粒組成，如腺病毒大量晶格樣排列的病毒顆粒組成，如腺病毒 的包涵體的包涵體 n細(xì)胞變性的產(chǎn)物，不含病毒，如皰疹病毒的細(xì)胞變性的產(chǎn)物，不含病毒，如皰疹病毒的 包涵體包涵體 病毒與細(xì)胞相互作用29 定義：定義：由病毒或誘生劑刺激機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗病毒、由病毒或誘生劑刺激機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗病毒、 抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的糖蛋白。抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的糖蛋白。 種類：種類：、干擾素。干

18、擾素。 抗病毒作用：抗病毒作用：干擾素不直接作用于病毒，而是作用于干擾素不直接作用于病毒，而是作用于 鄰近的細(xì)胞，使其產(chǎn)生抗病毒蛋白，這些抗病毒蛋白降鄰近的細(xì)胞，使其產(chǎn)生抗病毒蛋白，這些抗病毒蛋白降 解病毒解病毒mRNA、抑制蛋白合成。、抑制蛋白合成。 干擾素作用具有宿主特異性，而無病毒特異性。干擾素作用具有宿主特異性，而無病毒特異性。 二、干擾素（二、干擾素（IFN） 病毒與細(xì)胞相互作用30 病毒與細(xì)胞相互作用31 干擾素抗病毒機(jī)制干擾素抗病毒機(jī)制 病毒與細(xì)胞相互作用32 RNA干擾（干擾（RNA interference, RNAi）指細(xì)胞指細(xì)胞 利用內(nèi)源或外源的小分子雙股利用內(nèi)源或外源的小分子雙股RNA片段，特異性地降解片段，特異性地降解 同源基因的同源基因的mRNA，從而導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄后的基因沉默，從而導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄后的基因沉默 （post translational gene sile