HPLC培訓(峰與色譜條件)

1、HPLC 高效液相高效液相 色譜色譜 基本原理基本原理 加樣加樣 流動相流動相 流動相流動相 A C B B C A 固定相固定相 柱內填料，柱內填料，流動相流動相 洗脫劑。洗脫劑。 HPLC是利用樣品中的溶質在固定相和流動相之間分 配系數(shù)的不同，進行連續(xù)的無數(shù)次的交換和分配而達到 分離的過程。 基本操作 1.打開泵電源，待自檢完成后打開“Purge”閥進行排液以除去泵頭之前 的氣泡，排氣完成后關閉“Purge”閥。按“Pump”鍵開啟泵，然后按 “func”及數(shù)字鍵以0.2ml/min的速度慢慢將流速調1.0ml/min （其中測甘油果糖氯化鈉注射液時應以0.1ml/min的速度慢慢將流速調

2、 0.5ml/min ）。 2.一般柱平衡時間為30min左右（測甘油果糖氯化鈉注射液時平衡時間 會更長些），此時依次打開檢測器、工作站電源，打開計算機中工作 站，待儀器自檢連接完成后查看基線，如基線平穩(wěn)即可進樣采集數(shù)據(jù)。 3.檢測完成后，關閉計算機中工作站、檢測器、工作站電源，將泵的 流速慢慢降至0.2ml/min，按“Pump”鍵關閉泵，將流動相換至10%甲醇 水或乙腈水，再以1.0ml/min流速沖洗色譜柱30-60min。 4.最后將色譜柱充滿純甲醇保存。 5.手動進樣器使用后，用適當溶劑沖洗進樣閥，除去殘留的樣品，溶 劑，緩沖鹽等，蓋好封蓋防止灰塵顆粒。 流動相的配制流動相的配制 配

3、制用水最好用蒸餾水（注射水）配制用水最好用蒸餾水（注射水） 稱量、量取、調稱量、量取、調pH時盡可能精確時盡可能精確 流動相必須用流動相必須用0.45um濾膜過濾，注意區(qū)分有機膜、無機膜濾膜過濾，注意區(qū)分有機膜、無機膜 加入甲醇或乙腈后要混合充分加入甲醇或乙腈后要混合充分 流動相必須經(jīng)過脫氣（常用方法是超聲脫氣）流動相必須經(jīng)過脫氣（常用方法是超聲脫氣） 配制所用的試劑盡可能用色譜純，如沒有色譜純可用分析純代替配制所用的試劑盡可能用色譜純，如沒有色譜純可用分析純代替 流動相應現(xiàn)用現(xiàn)配制，染菌的流動相禁止使用流動相應現(xiàn)用現(xiàn)配制，染菌的流動相禁止使用 配制過程中應注意自我保護配制過程中應注意自我保護

4、 流動相使用前為什么要脫氣？ 流動相使用前必須進行脫氣處理流動相使用前必須進行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過），以防止在洗脫過 程中當流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，程中當流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會增加基線的噪音， 造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會導致樣品中某些組份被氧化，柱中固造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會導致樣品中某些組份被氧化，柱中固 定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。 常用的脫氣方法比較：常用的脫氣方法比較：

5、 氦氣脫氣法氦氣脫氣法 加熱回流法：效果較好，但操作復雜，且有毒性揮發(fā)污染。加熱回流法：效果較好，但操作復雜，且有毒性揮發(fā)污染。 抽真空脫氣法：易抽走有機相。抽真空脫氣法：易抽走有機相。 超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中用超聲波振蕩，超聲過程中觀察無氣泡生成即可。超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中用超聲波振蕩，超聲過程中觀察無氣泡生成即可。 在線真空脫氣法：真空脫機利用膜滲透技術在線脫氣，無需額外操作，成本低，脫氣效在線真空脫氣法：真空脫機利用膜滲透技術在線脫氣，無需額外操作，成本低，脫氣效 果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。 色譜柱

6、的良好使用規(guī)范 溶劑使用前必須過濾 運輸中變干了的色譜柱要完全浸濕（預處理） 如果樣品中含有無需考慮而保留強的組分時,必須進行前處理 清楚了解色譜柱填料適用的pH范圍(3-7)，溫度(1.2 色譜柱故障診斷- 峰形問題 可能的原因可能的原因 1.小峰在大峰前流出 2.柱床塌陷 3.樣品溶劑不合適 4.柱過濾片部分堵塞 5.柱過載，偶爾發(fā)生 Normal Fronting 伸舌峰（前延峰）伸舌峰（前延峰） 對稱系數(shù)對稱系數(shù)0.9 手動進樣器的使用、維護手動進樣器的使用、維護 樣品溶液進樣前必須用0.45um濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損 轉動切換時不能太慢，更不能停留在中間 位置，否則流動相

7、受阻，使泵內壓力劇增， 甚至超過泵的最大壓力 避免使用針頭彎曲，毛刺，變鈍的進樣針 使用后，用適當溶劑沖洗進樣閥，除去殘 留的樣品，溶劑，緩沖鹽等，蓋好封蓋防 止灰塵顆粒 必要時更換轉子密封墊必要時更換轉子密封墊 系統(tǒng)適應性試驗 1.色譜柱的理論板數(shù) * 2.分離度 * 3.重復性 4.拖尾因子 色譜柱的理論塔板數(shù)（n） 用于評價色譜柱的分離效能。 n=16(tR/w)2 或n=5.54(tR/wh/2)2計算色譜柱的理論板數(shù)。 保留時間tR 峰寬w 半高峰寬wh/2 分離度（R） 用于評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質之間的 分離程序，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關鍵指標。 除另有規(guī)定外，待測組分

8、與相鄰共存物之間的分離度 應大于1.5。 計算公式 或 重復性 用于評價連續(xù)進樣中，色譜系統(tǒng)響應值的重復性能。 采用外標法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連 續(xù)進樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標 準偏差應不大于2.0%。 相對標準偏差 RSD 采用內標法時，其相對標準偏差應不大于2.0%。 拖尾因子（T） 用于評價色譜柱的對稱性。 為保證分離效果和測量精度，應檢查待測峰的拖尾因 子是否符合各品種項下的規(guī)定。 拖尾因子計算公式為 。 除另有規(guī)定外，峰高法定量時T應在0.95 1.05之間。 峰面積法測定時，若拖尾嚴重，將影響峰面積的準確 測量。 系統(tǒng)適應性試驗系統(tǒng)適應性試驗 1.理

9、論塔板數(shù) n 2.分離度 （R 1.5） 3.重復性 RSD=0.1% 4.拖尾因子 T=1.04 min012345678 mAU 0 50 100 150 200 250 300 VWD1 A, 波長=310 nm (D:質檢-成品替硝唑注射液1 2010-02-17 10-55-42SIG000001.D) 7.548 min012345678 mAU 0 50 100 150 200 250 300 VWD1 A, 波長=310 nm (D:質檢-成品替硝唑注射液1 2010-02-17 10-55-42SIG000002.D) 7.537 min012345678 mAU 0 50

10、100 150 200 250 300 VWD1 A, 波長=310 nm (D:質檢-成品替硝唑注射液1 2010-02-17 10-55-42SIG000003.D) 7.531 min012345678 mAU 0 50 100 150 200 250 300 VWD1 A, 波長=310 nm (D:質檢-成品替硝唑注射液1 2010-02-17 10-55-42SIG000004.D) 7.490 min012345678 mAU 0 50 100 150 200 250 300 350 VWD1 A, 波長=310 nm (D:質檢-成品替硝唑注射液1 2010-02-17 10-

11、55-42SIG000006.D) 7.379 替硝唑含量替硝唑含量 理論塔板數(shù)=15487 對稱因子=1.05 min012345678 mAU 0 50 100 150 200 250 300 VWD1 A, 波長=310 nm (D:質檢-成品替硝唑注射液1 2010-01-05 14-48-56SIG000002.D) 7.826 含量測定-內標法 按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成 溶液，精密量取各適量，混合配成規(guī)定用的對照溶液。取一定量注入 儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峰面積或峰高，按下式 計算校正因子： 校正因子（f）ASCS/ARCR 式中

12、： AS為內標物質的峰面積或峰高；AR為對照品的峰面積或峰高；CS為內標物質的濃度，CR為對照 品的濃度。 再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖， 測量供試品中待測成分（或其雜質）和內標物質的峰面積或峰高，按 下式計算含量： 含量（ cX ） fAxC/S /As 式中： AX為供試品（或其雜質）峰面積或峰高；CX為供試品（或其雜質）的濃度；A/S為內標物質的峰 面積或峰高；C/S為內標物質的濃度；f為校正因子。 采用內標法，可避免因樣品前處理及進樣體積誤差對測量結果的影響。 含量測定-外標法 按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液， 分別精密量取

13、一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供 試品溶液中待測組分的峰面積（或峰高），按下式計算含量： 含量（CX）cR Ax /AR 式中各符號意義同上。 由于微量注射器不易精確控制進樣量，當采用外標法測定供試品中成 分或雜質含量時，以定量環(huán)或自動進樣器進樣為好。 替硝唑有關物質替硝唑有關物質 其中雜質與2-甲基-5硝基咪唑的分離度為1.69 min02468101214 mAU 0 500 1000 1500 2000 2500 VWD1 A, 波長=310 nm (D:質檢-成品替硝唑注射液1 2009-10-06 14-53-17SIG000080.D) 5.008 5.303 7.

14、510 有關物質 1.加校正因子的主成分自身對照法加校正因子的主成分自身對照法 測定雜質含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方 法時，按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質對照品和待測組分 對照品各適量，配制測定雜質校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖， 按上述內標法計算雜質的校正因子。此校正因子可直接載入各品種項 下，用于校正雜質的實測峰面積。這些需作校正計算的雜質，通常以 主成分為參照，采用相對保留時間定位，其數(shù)值一并載入各品種項下。 測定雜質含量時，按各品種項下規(guī)定的雜質限度，將供試品溶液稀釋 成與雜質限度相當?shù)娜芤鹤鳛閷φ杖芤?，進樣，調節(jié)檢測靈敏度（以 噪聲水平可接受為限）或

15、進樣量（以柱子不過載為限），使對照溶液 的主成分色譜峰的峰高約達滿量程的10%25%或其峰面積能準確積分 通常含量低于0.5%的雜質，峰面積的相對標準偏差（RSD）應小于 10%；含量在0.5%2%的雜質，峰面積的RSD應小于5%；含量大于2% 的雜質，峰面積的RSD應小于2.0%。然后，取供試品溶液和對照品 溶液適量，分別進樣，供試品溶液的記錄時間，除另有規(guī)定外，應為 主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜峰上各雜質的峰面 積，分別乘以相應的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，依 法計算各雜質含量。 2.不加校正因子的主成分自身對照法不加校正因子的主成分自身對照法 測定雜質含量時，若沒有雜質對照品，也可采用不加校正 因子的主成分自身對照法。同上述（3）法配制對照品溶液 并調節(jié)檢測靈敏度后，取供試品溶液和對照品溶液適量， 分別進樣，前者的記錄時間，除另有規(guī)定外，應為主成分 色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的 峰面積并與對照品溶液主成分的峰面積比較，計算雜質含 量。 若供試品所含的部分雜質未與溶劑峰完全分離，則按規(guī)