設(shè)計引物軟件使用方法及個人體會

1、研究生必備設(shè)計引物篇一、引物設(shè)計step by step 1、在ncbi上搜索到目的基因，找到該基因的mrna,在cds選項中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的origin中,copy該編碼序列作為軟件查詢 序列的候選對象。2、用 primer premier5 搜索引物 打開primer premier5,點擊file.new.dna sequence,出現(xiàn)輸入序列窗口 copy目的序列在輸入框內(nèi)（選擇as,此窗口內(nèi)，序列也可以直接翻譯成蛋白。點擊primer,進入引物窗口。此窗口可以鏈接到“引物搜索”“引物編輯”以及“搜索結(jié)果”選項，點擊search按鈕，進入引物搜索框，選擇“pcr prim

2、ers- “p設(shè) air定s搜”索，區(qū)域和引物長度和產(chǎn)物長 度。在search parameters里面， 可以設(shè)定相應(yīng)參數(shù)。一般若無特殊需要，參數(shù)選擇默認(rèn)即可，但產(chǎn)物長度 可以適當(dāng)變化，因為100200bp的產(chǎn)物電泳跑得較散，所以可以選 擇300500bp.點擊ok,軟件即開始自動搜索引物，搜索完成后，會自動跳出結(jié)果窗口，搜索結(jié)果默認(rèn)按照評分（rating排序點擊其中任一個搜索結(jié)果，可以在“引物窗口 ”中,顯示出該引物的綜合情況，包括上游引物和下游引 物的序列和位置，引物的各種信息等。對于引物的序列，可以簡單查看一下，避免出現(xiàn)下列情況：3不，要出現(xiàn)連續(xù)的3個堿基相連的情況，比如ggg或ccc

3、,否則容易引起錯配。此窗口中 需要著重 查看的包括：tm應(yīng)該在5570度之間，gc%應(yīng)該在45%55% 間，上游引物和下游引物的tm值最好不要相差太多，大概在2度以下較好。該窗口的最下面列出了兩條引物的二級結(jié)構(gòu)信息，包括，發(fā)卡，二聚 體，引物間交叉二聚體和錯誤引發(fā)位置。若按鈕 顯示為紅色，表示存在該 二級結(jié)構(gòu)，點擊該紅色按鈕，即可看到相應(yīng)二級結(jié)構(gòu)位置圖 示。最理想的 引物，應(yīng)該都不存在這些二級結(jié)構(gòu)，即這幾個按鈕都顯示為“none”為 好。但有時很難找到各個條件都滿足的引物，所以要求可以適當(dāng)放寬，比 如引物存在 錯配的話，可以就具體情況考察該錯配的效率如何，是否會明 顯影響產(chǎn)物。對于引物具體詳細(xì)

4、的評價需要借助于olig。來完成qig。自 身雖然帶有引物搜索功能，但其搜 索出的引物質(zhì)量感覺不如primer5.在primer5窗口中，若覺得某一對引物合適，可以在搜索結(jié)果窗口中，點擊該引物,然后在菜單欄，選擇file-print-current pair,使用pdf虛擬打印機，即可轉(zhuǎn)換為pdf文檔,里面有該引物的詳細(xì)信息。3、用oligo瞼證評估引物在qig。軟件界面file菜單下，選擇open,定位到目的cdna序列（在primer中該序列已經(jīng)被保存為seq文件，會跳出來兩個窗口，分別為internal stability(delta g 窗口和 tm口。在tm窗口中，點擊最左下角的按鈕

5、，會出來引物定位對話框，輸 入候選的上游引物序列位置（primer5已經(jīng) 給出即可，而引物長度可以通過點擊change口的upper按鈕,確定上current oligo length來改變。定位后，點擊tm游引物，同樣方法定位下游引物位置 點擊lower按鈕，確定下游引物。引 物確定后，即可以充 分利用analyze菜單中各種強大的引物分析功能了。analyze中，第一項為key info,點擊selected primers會,給出兩條引物 的概括性信息，其中包括引物的tm值，此值olig。是采用 nearest neighbormethod計算，會比primer5中引物的tm值略高，此窗

6、口中還給出引物的delta g和3,端的delta g.3,端的delta g過高,會在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引起dna聚合反應(yīng)，因此此項 絕對值應(yīng)該小一些，最好不要超過9oanalyze中第二項為duplex formation,即二聚體形成分析，可以選擇上 游引物或下游引物，分析上游引物間二聚體形成情況和下游引物間的二 聚體情況，還可以選擇upper/lower，即上下游引物之間的二聚體形成情況。引物二聚體是影 響pcr反應(yīng)異常的重要因素，因此應(yīng)該避免設(shè)計的引物存在二聚體，至少也要 使設(shè)計的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其dhtag值應(yīng)該偏低，一 般不要使其超過4.5kcal/mol,結(jié)合

7、堿基對不要超過3個。oligo此項的分 析窗口中分別給出了 3,端和整個引物的 二聚體圖示和de代ag值。analyze中第三項為hairpin formation,即發(fā)夾結(jié)構(gòu)分析。可以選擇上 游或者下游引物，同樣,delta g值不要超過4.5kcal/mol,堿基對不要超過3 個。analyze中第四項為compos由on and t m,會給出上游引物 下游引物 和產(chǎn)物的各個堿基的組成比例和tm值。上下游引物的gc%需要控制 在40%60%,而且上 下游引物之間的gc%不要相差太大。tm值共有3 個,分別采用三種方法計算出來，包括 nearest neighbor method、 % g

8、c method和2(a+t+4(g+cmethod,最后一種應(yīng)該 是primer5所采用的方法,t m值可以控制在5070度之間。第五項為false priming s讓es,即錯誤引發(fā)位點，在primer5中雖然也有 false priming分析但不如oligo詳細(xì)，并且oligo會給我正確引發(fā)效率和錯 誤引發(fā)效率，一般的原則要使誤引發(fā)效率在1。以下，當(dāng)然有時候正確 位點的引發(fā)效率很高的話，比如達到40050。,錯誤引發(fā)效率超過100幅 度若不大的話，也可以接受。analyze中，有參考價值的最后一項是“pcr”在，此窗口中，是基 于此對引物的pcr反應(yīng)summary,并且給出了此反應(yīng)的

9、最佳退火溫度，另 外,提供了對于此對引物的簡短評價。若該引物有不利于pcr反應(yīng)的二 級結(jié)構(gòu)存在，并且delta g值偏大的話qig。在最后的評價中會注明，若 沒有注明此項，表明二級結(jié)構(gòu)能值較小，基本可以接受。引物評價完畢后，可以選擇file.print,打印為pdf文件保存，文件 中將會包括 所有olig。軟件中已經(jīng)打開的窗口所包括的信息，多達數(shù) 頁。因此，打印前最好關(guān)掉tm口和deltag窗口，可以保留引物信息窗口、二級結(jié)構(gòu)分析窗口 （若 存在可疑的異常的話和pcr窗口。4、引物確定后，對于上游和下游引物分別進行blast分析,一般來 說，多少都會找到一些其他基因的同源序列，此時，可以對上游

10、引物和 下游引物的blast結(jié)果進行對比分析,只要沒有交叉的其他基因的同源序 列就可以。二、引物設(shè)計過程中的心得1、primer 5.0搜索引物primer length我常設(shè)置在18-30bp短了特異性不好，長了沒有必 要。當(dāng)然有 特殊要求的除外，如加個酶切位點什么的。pcr product size最好是100-300bp之間，小于100bp的pcr產(chǎn)物瓊 脂糖凝膠 電泳出來，條帶很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛 刻。search parameters 還是選 manual 吧search stringency 應(yīng)選 high,gc 含 量一般 是40-60%o其它參數(shù)默認(rèn)就可以了。

11、引物之間tm值的差應(yīng)下雨5、引物和模板之間的tm值差應(yīng)小 于20較合適。（在設(shè)計引物過程中個人的總結(jié)搜索出來的引物，按rating排序，逐個送olig。軟件里評估。當(dāng) 然搜索出的引物，其擴增產(chǎn)物很短，你可以不選擇它，或是引物3端 三2個人或t,或引物內(nèi)部連續(xù)的g或c太多,或引物3端22個g或c,這樣的引物應(yīng)作為次選，沒得選了就選它。對于 這樣的引物，如果其它各項指標(biāo)還可以，我喜歡在引物末端 去掉一個不滿意的或加上一個堿基，看看引物的評估參數(shù)有沒有變好2、oligo 6.0評估引物在analyze里,duplex formation不管是上游引物、下游引物還是上下 游引物 之間,the most

12、 stable 3-dim er 絕對值應(yīng)小于 4.5kcal/mol, the most stable dimer overall絕對值一般應(yīng)小于多少kcal/mol跟pcr退火溫度有關(guān)， 我?guī)状螌嶒灨杏X在pcr退火溫度在65的時候,the most stable dimer overall 6.7kcal/mol沒有問題。hairpin formation根據(jù)黃金法則false priming sites: primer 的 priming efficiency 應(yīng)該是錯配地方的 4 倍左 右，更多當(dāng)然更好。在pcr欄,丁香園戰(zhàn)友感覺其所顯示的optimal annealing tempe

13、rature 數(shù)值值得參考。在pcr摸索條件的時候，退火溫度為其數(shù)值加減2的范 圍就可以了。internal stabi肉很重要：我們希望引物的內(nèi)部穩(wěn)定性是中間高、兩邊 低的弧 形，最起碼保證3端不要過于穩(wěn)定。下圖引物3端過于穩(wěn)定 很容 易導(dǎo)致不適當(dāng)擴增。zg參照黃金法則，這其實很好理解：把一滴水放 到大海里，這滴水就會不停的擴散分布，擴散的越厲害越穩(wěn)定，所以4g 絕對值越大結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。3、其他兩個評價系統(tǒng)不一樣，丁香園戰(zhàn)友感覺olig。評價引物好點rimer 出來的引物，一般按效率排序，再結(jié)合退火溫度和引物長度，選擇引物到 oligo測試。這是初步的選擇,其實引物到了 olig。里,退火溫度也不一樣。3端的二聚體應(yīng)該避免，這個要看退火溫度決定，一個50。的退火溫度肯定和65對二聚體的影響不一樣了，一般來講盡量控制在4.5kcal/mol以下（