西南科技創(chuàng)新基金項目香菇疏水蛋白的基因克隆和功能分析申報書

1、項目編號西南林業(yè)大學科技創(chuàng)新基金項 目 申 報 書項 目 名 稱： 香菇疏水蛋白的基因克隆和功能分析 項目負責人： xxx 項 目 成 員： xxx 指 導 教 師： xxx 所在院系部： 生命科學學院 聯(lián) 系 電 話： 起 止 年 月： 2014年11月-2015年11月 填 報 日 期： 2014年09月25日 項目類別 項目組別 項目成分 r自 然 科 學 類 r本科生 個人項目 哲學社會科學類 科技發(fā)明制作類 研究生 r 集體項目 一、本項目的依據和意義（包括科學意義和應用前景，學術思想，立論依據，創(chuàng)新性，主要參考文獻目錄和出處） 疏水蛋白的發(fā)現(xiàn)及分布: 疏水蛋白是一類具有強表面活性的

2、分泌型小分子量蛋白質。這一名詞最早是由rosenbet$和kjelieberg(19-6)在研究細菌與寄主吸附機理時提出的，意指覆蓋在微生物細胞表面的任何疏水物質(hydrophobic substances)。wessels研究小組發(fā)現(xiàn)裂褶苗(schb.ophytium commune)子實體和氣生菌絲形成時。某些基因及其相應的cdna序列可以編碼約100個氨基酸的小蛋白。它含有8個半胱氨酸殘基和一段分泌性的信號肽，而后這一類物質統(tǒng)稱為疏水蛋白(hydrophobin) 。疏水蛋白廣泛存在于各類群的真菌中，是由絲狀真菌分泌的具有特殊性質的蛋白質。在真菌的生長和繁殖中起著非常重要的作用。到目前

3、為止已知在20種真菌中發(fā)現(xiàn)其存在，包括子囊菌、擔子菌和接臺菌等。而疏水蛋白普遍存在于真菌的氣生菌絲、侵染機構、或子實體表面，且高豐度表達。由于疏水蛋白具有不同尋常的生化性質，很難用常規(guī)的蛋白分析方法檢測到其存在，直到最近幾年通過鑒定相應的基因才發(fā)現(xiàn)它們，由于所有疏水蛋白基因都編碼一段信號肽，通過免疫定位、蛋白提純及n一末端氨基酸序列分析可以確定它們是疏水蛋白。疏水蛋白的性質、功能及理論依據: 生化分析表明i和型的琉水蛋白具有明顯不同的性質，對裂褶菌 schizophyllum commune 的琉水蛋白研究指出i型的疏水蛋白可以從真菌細胞壁中以復合體形式分離提純。該復合體不溶于sds 而溶于甲

4、酸或過甲酸。過甲酸可以把半胱氨酸氧化成碘基丙氨酸，從而打斷了二硫鍵，使其在提取過程不永遠喪失了蛋白二結構。采用這一方法可以證明其氨基酸序列與在研究雙棱階段所表達的疏水蛋白的基因序列是一致的。繼而wessels研究小組發(fā)現(xiàn)采用磚的三氟乙酸(trifluoroaeetic acidtfa)可以小范圍地打破疏水交互作用。有效地溶解疏水蛋白的單體，保證了疏水蛋白完整性和生物學活性。通過這一方法，wessels和他的同事們測定了許多真菌的疏水蛋白性質 并發(fā)現(xiàn)疏水蛋白可以進行表面間的自我組裝。由于takaj及其同事的基于對植物病原真菌 ophiostoma ulmi的疏水蛋白ceralo-ul-min(c

5、u)的研究，發(fā)現(xiàn)cu為型的疏水蛋白。雖不溶于sds，但能溶于60的己醇，其多聚物與sc3相似可以形成纖絲狀或桿狀結構，但很不穩(wěn)定，且cu具有植物毒性。疏水蛋白中氨基酸的排列方式也具有顯著的不同，通過對它的半胱氨基酸殘基及其它氨基酸殘摹序列比較，就會產生不同的疏水形式，wessels把它們分為i和型的疏水蛋白。i型的疏水蛋白具有兩個功能域，以二硫鍵為中心形成為四個環(huán)”狀結構，第二個環(huán)與第四個環(huán)太小差異很太。疏水蛋白sc3、roda和dewa的第二環(huán)比疏水蛋白mpg1太得多。相比較型疏水蛋白的第二和第四環(huán)中疏水性明顯占優(yōu)勢。含有大量的氨基酸殘基(m、i、l和v)，并環(huán)繞著無極性氨基酸殘基(g和a)

6、或對疏承性沒有影響氨基酸殘基(t和y) 疏承蛋白單體因此折疊成為二親性的形態(tài)結構，盡管環(huán)狀結構還包含其它二級結構。疏水蛋白的多聚體膜有非常高的穩(wěn)定性，還高但其單體的穩(wěn)定性要差的多。完整的疏水蛋白具有至少六種基本生理功能：幫助真菌克服氣液屏障形成氣生結構。賦予真菌菌絲以疏水性。 粘附真菌菌絲到固體疏水表面。使細胞壁更完整。保護真菌細胞抵抗惡劣環(huán)境。此外還可以作為毒素和誘導物、促進孢子擴散、形成親水環(huán)境、促進孢子萌發(fā)作為吸附時的非特異性附著因子等生理功能。此外，疏水蛋白在不同物相之間的自動組裝，在真菌致病過程也會發(fā)揮一定的作用。疏水蛋白是最具表面活性的分子，其活性不依賴脂類，僅依賴自身氨基酸序列。

7、游離的疏水蛋白單體的表面活力并沒有突出的表現(xiàn)，其表面活性是隨自我組裝而增強。wessels通過對20種疏水蛋白的氨基酸作了序列相似形比較，發(fā)現(xiàn)除疏水蛋白的信號肽部分，在已知的疏水蛋白中氨基酸僅有4.3 的同源性和1.7相似性。這一結果表明不同真菌疏水蛋白在真菌的各個發(fā)育階段發(fā)揮不同的功能，或者重復使用某一氨基酸也不會改變其正常的生物學功。疏水蛋白的研究意義：疏水蛋白是最近幾年才發(fā)現(xiàn)的一類具有特殊生理作用的蛋白。在真菌氣生菌絲、侵染機構或子實體表面都有很高的表達，具有特殊而各不相同性質、結構和生物學功能。況且疏水蛋白不僅僅是在真菌中存在，就是植物和人體內也有它們的存在和作用。例如在人體就發(fā)現(xiàn)有與

8、人t細胞分化有關的疏水蛋白hp。而且，據推測疏水蛋白的進化可追溯至四億多年前，首先隨地衣出現(xiàn)在陸生真核生物中。因此，由疏水蛋白研究真菌親緣關系無疑是理想的分子標記。所以隨著研究的進一步推進和精細以后會發(fā)現(xiàn)更多的數(shù)目、更大作用，弄清它在生物體的表達、調控以及作用方式對生物學規(guī)律的認識、對相關病變的防疫和生產實踐都有重要的意義。疏水蛋白的應用前景：真菌疏求蛋白已經越來越受到人們的關注，利用疏水蛋白可以研究真菌的形態(tài)分化，鑒別真菌發(fā)育及致病過程中的調控途徑。另外，由于它們的單體在疏水表面具有自動組裝和表面活性的特有功能，疏水蛋白將作為天然蛋白在食品可以用來取代乳狀食品結構中的脂肪。在制藥方面由于i型

9、真菌疏水蛋白可自組裝形成非常穩(wěn)定的兩性蛋白膜，且無細胞毒性和強免疫原性，在醫(yī)學生物材料如外科手術機械包被方面等均有廣闊的應用前景。生物傳感器電極的修飾上，真菌疏水蛋白可以作為一種電極基質或作為固定電活性分子至電極表面的材料。在材料方面還可以作為為納米材料和基因工程研究的材料。所以真菌疏水蛋白在醫(yī)學制藥、微生物學以及食品等行業(yè)具有很大的應用潛力。主要參考文獻1、 林福呈.2001.真菌疏水蛋白的研究進展.杭州：微生物學報。2、 丁靖志，于雷，王洪輝，張寶華，喬明強.2004.真菌疏水蛋白的結構和功用.天津：生物學雜志.3、 應盛華，鄧米霞，馮明光.2006.三種絲孢類生防真菌孢子類疏水蛋白的含量

10、與組分比較.浙江：浙江大學學報.4、 黃姍,王中康,陳環(huán),王萌,殷幼平.2012.萊氏野村菌疏水蛋白基因nrhyd的克隆及其表達特征分析.重慶: 菌物學報.5、 馬愛民，單麟軍，杜昭平，謝筆鈞.2007.糙皮側耳（平菇）疏水蛋白的分離純化及其界面自組裝特性研究.武漢: 菌物學報.6、 杜雙田.2005.香菇袋類栽培新技術.陜西：西北農林科技大學出版社.7、 古麗吉米拉米吉提，范海娟，劉志華，王娜，竇愷，黃穎，王志英.2012.棘孢木霉t4小分子疏水蛋白基因hyb2克隆及序列分析.哈爾濱：中國農學通報.8、 劉祖同，羅信昌.2002.食用蕈菌生物技術及應用.北京：清華大學出版社.9、 d.r.偉

11、斯特海德，j.h.帕里什,r.m.懷特曼著.王明怡,楊益,吳平譯.2004.生物信息學.北京：科學出版社.10、 張燁，雷仲仁，王海鴻.真菌疏水蛋白及其在蟲生真菌中的研究進展.北京：公共植保與綠色防控.11、 li fan，m.aalonso.1998.cl0ning and sequening cdna f0r a hydr0ph0bic pr0-tein ass0ciated with human t-cell differentia-tion. changchun: immunological journal.二、研究內容和預期成果（說明研究項目的具體內容，分階段實施計劃，預期成果和提供

12、的形式） 疏水蛋白廣泛存在于各類群的真菌中，到目前為止已知在20種真菌（包括子囊菌、擔子菌和接合菌等）中發(fā)現(xiàn)其存在。而香菇為真菌界真菌門真擔子菌綱傘菌目側耳科香菇屬香菇種真菌，所以在香菇的菌絲中也應當存在疏水蛋白。另外香菇已經有800多年的栽培史，容易通過栽培得到。但是疏水蛋白具有不同尋常的生化性質，很難用常規(guī)的蛋白分析方法檢測到其存在。想要得到它的克隆基因就需要先測得疏水蛋白的一級結構，得到氨基酸序列后再反推出蛋白的cdna序列才能進行基因克隆。香菇的培養(yǎng)：使用培養(yǎng)基培養(yǎng)主要注意以下幾個生長發(fā)育條件即可。1、 溫度：在潮濕的狀態(tài)下，擔孢子萌發(fā)的最適溫度為22-26。菌絲生長的最適宜溫度24-

13、27，香菇原基在8-21分化，在10-12分化最好。子實體在5-24范圍內發(fā)育，8-16為最適。2、 營養(yǎng)：香菇是一種木腐菌，主要的營養(yǎng)成分是碳水化合物和含氮化合物，以及少量的無機鹽和維生素等。培養(yǎng)基中的各種營養(yǎng)物質，只有溶解在水里才能被香菇吸收利用。碳源：香菇菌絲能利用廣泛的碳源，包括單糖類（葡萄糖）、雙糖（蔗糖）和多糖（淀粉）都可以作為其生長的有機碳源，也是能量來源。且糖濃度在1-5%比較好。氮源：氮素是構成菌絲細胞中的蛋白質和核酸的主要元素，而蛋白質和核酸又是細胞質和細胞核的重要成分，生命活動中起著重要的生理作用。有機氮（氨基酸、蛋白質、尿素）和氨態(tài)氮（硫酸銨）都是菌絲細胞氮的來源。香菇

14、菌絲能利用有機氮和銨態(tài)氮而不能利用硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮。在香菇菌絲營養(yǎng)生長階段，碳源和氮源的比例以25-40:1為好，高濃度的氮會抑制香菇原基分化。在生殖生長階段，要求較高的碳。生長因子：香菇菌絲的生長需要吸收維生素b1，但量不宜多，適合香菇生長的維生素b1濃度大約是每升培養(yǎng)基100um。在段木栽培中，香菇菌絲分泌多種酶類分解木質素、纖維素、淀粉等大分子，從菇木的韌皮部和木質部吸收碳源、氮源和礦質元素，而一般用作馬鈴薯、麥芽汁、麩皮、米糠等含有豐富碳源的天然成分的生長因素就無需另加。無機鹽類：菌絲所需的無機鹽類數(shù)量很少，但在其生命活動中都是不可缺少的。在配制培養(yǎng)基時，要加入少量的磷、鉀、硫、鈣、鎂

15、等。培養(yǎng)基中加入磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸鈣等即可滿足對上述元素的要求，但鈣和硼能抑制香菇菌絲生長。其他因素: 光線和空氣，香菇是需光性真菌，強度適合的漫射光是香菇完成正常生活史的一個必要條件。但是，菌絲生長不需要光線。香菇也是好氣性菌類，要足夠的新鮮空氣才能保證香菇的正常生長發(fā)育。水：在鋸木屑培養(yǎng)基中，菌絲生長的最適含水量是60-70%；在菇木中適宜的含水量是32-40%，在32%以下接種成活率不高，在10%-15%條件下菌絲生長極差。子實體形成期間菇木含水量保持60%左右，空氣濕度80-90%為宜。凝固劑：常用的凝固劑為瓊脂（洋菜），是由石花菜提制而成。培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物質的比例對香菇菌絲生

16、長的影響很大。要根據香菇菌絲生長對各種營養(yǎng)物質的需要按比例配制。要注意對培養(yǎng)基ph值的調節(jié)。酸堿度:適于香菇菌絲生長的培養(yǎng)液的ph值是5-6。ph值在3.5-4.5適于香菇原基的形成和子實體的發(fā)育。在段木腐化過程中，菇木的ph值不斷下降，從而在形成子實體之后收集氣生菌絲。疏水蛋白的檢測及分離純化：將收獲并經冷凍干燥的氣生菌絲在液氮中研磨至精細粉末。所得粉末稱重后，按照料液比1:10（m/v）迅速轉移至經沸水預熱的抽提液（2% sds，0.05mol/l tris ph6.8）中，保持100抽提10min，然后將此懸濁液4000r/min離心15min后收集沉淀。無菌水洗滌沉淀中殘留的sds并經

17、4000r/min離心10min后收集沉淀，重復此操作68次。將離心所得沉淀置于抽提液（氯仿:甲醇=2:1）中，65抽提10min并過濾收集不溶物，重復此操作5次后冷凍干燥。所得干燥材料稱重后，按照25mg/ml加入100%tfa，置于冰浴中解離6h。將tfa懸濁液12000r/min離心15min，收集上清液并用氮氣吹干后加入適量60%乙醇水溶液于25靜置溶解12h。將60%乙醇水溶液12000r/min離心30min，收集上清液后置于4透析除去乙醇。將透析所得蛋白水溶液在漩渦混合儀上劇烈震蕩5min，得到疏水蛋白組裝體懸濁液。將組裝體懸濁液12000r/min離心30min，收集沉淀。最后

18、，所得沉淀物經冷凍干燥后置于密閉容器中室溫保存?zhèn)溆谩Ｊ杷鞍椎姆治觯哼@一步主要是分析疏水蛋的白晶體結構和在與細胞相似的溶液中疏水蛋白的形態(tài)、結構和疏水蛋白的氨基酸序列。從而推測它的功能以及得出對應的cdna序列，為研究它的生物學功能、生產應用和基因克隆,建立基因文庫做準備。提取出疏水蛋白后就需要進行對蛋白質序列的分析測定，蛋白質測序可通過edman degradation（edman 降解）過程完成，而當前的蛋白質測序方法依賴于質譜技術（mass spectrometry，ms）完成。蛋白質結構的確定要借x射線晶體學或者核磁共振等技術才能完成。疏水蛋白mrna的提?。涸跍y定出疏水蛋白的一級結構后可以根據中心法則中基因表達過程的翻譯的配對關系推測出mrna的一級結構。但是這樣推測的結果和真菌細胞內真實的mrna可能會存在一定的差異，所以還需要對細胞內疏水蛋白的mrna進行測定，mrna序列的測定也需要借助核磁共振和質譜技術。疏水蛋白的基因克?。菏杷鞍谆蛉Lcdna的序列獲得后只要再設計出合成兩個分別互補于疏水蛋白cdna片段兩端的小片段引物就可以在pcr擴增儀中進行疏水蛋白的基因克隆。各