細胞融合與單克隆抗體1

1、第三章第三章 細胞融合與單克隆抗體細胞融合與單克隆抗體3.1 細胞融合細胞融合(cell fusion)定義定義: :在離體條件下用人工的方法把在離體條件下用人工的方法把 不同種的細胞通過無性方式融不同種的細胞通過無性方式融 合成一個雜合細胞的技術(shù)合成一個雜合細胞的技術(shù)。3.1.1細胞融合的發(fā)展歷史“自發(fā)自發(fā)”細胞融合現(xiàn)象：細胞融合現(xiàn)象：1838年年 muller 多核的腫瘤細胞多核的腫瘤細胞1858年年 virchow 正常組織、發(fā)炎組織及腫正常組織、發(fā)炎組織及腫 瘤組織瘤組織多核細胞多核細胞1873年年 luginbuhl 天花病人天花病人多核體血細胞多核體血細胞1875年年 lange

2、蛙類血液細胞發(fā)生合并蛙類血液細胞發(fā)生合并重要事件重要事件v19621962年年,(,(日日) )岡田善雄岡田善雄 仙臺病毒促細胞融合仙臺病毒促細胞融合v 70 70年代年代,(,(華裔加籍華裔加籍) )高國楠高國楠 pegpeg促植物原生促植物原生 質(zhì)體的融合質(zhì)體的融合v 80 80年代，電融合年代，電融合植物細胞融合：植物細胞融合： 1972年（美）年（美）p.s.carlson雜種煙草雜種煙草現(xiàn)代植物細胞融合的開始現(xiàn)代植物細胞融合的開始 1978年（德）梅歇爾斯年（德）梅歇爾斯“potomo”“pomoto ” 3.1.2 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與細胞融合植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與細胞融合 (proto

3、plast and cell fusion)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)植物細胞融合3.1.3 3.1.3 動物細胞融合動物細胞融合 動物細胞融合是研動物細胞融合是研究細胞遺傳信息轉(zhuǎn)究細胞遺傳信息轉(zhuǎn)移，基因在染色體移，基因在染色體上的定位以及創(chuàng)造上的定位以及創(chuàng)造新細胞株的有效途新細胞株的有效途徑。徑。腫瘤細胞與樹突狀腫瘤細胞與樹突狀細胞的融合細胞的融合人纖維肉瘤細胞與小鼠畸胎瘤細胞融合人纖維肉瘤細胞與小鼠畸胎瘤細胞融合1978年年(瑞士瑞士)埃勒門斯埃勒門斯 (美國美國)柯路斯柯路斯3.1.4 細胞融合的誘導細胞融合的誘導誘導融合的方法誘導融合的方法: :物理法物理法:電場刺激電場刺激 激光激光 顯微操作

4、顯微操作 化學法化學法:聚乙二醇聚乙二醇(peg)結(jié)合高結(jié)合高ph、 高鈣離子法高鈣離子法生物法生物法:仙臺病毒仙臺病毒不同細胞融合的條件及其主要應(yīng)用不同細胞融合的條件及其主要應(yīng)用來來 源源前處理前處理融合方法融合方法主要應(yīng)用主要應(yīng)用動物細胞動物細胞不需不需仙臺病毒、仙臺病毒、pegpeg、電融合電融合生產(chǎn)單克隆生產(chǎn)單克隆抗體抗體植物細胞植物細胞脫壁脫壁pegpeg、電融合、電融合創(chuàng)造植物新創(chuàng)造植物新品種品種微生物細胞微生物細胞脫壁脫壁pegpeg高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新菌種菌種仙臺病毒誘導仙臺病毒誘導仙臺病毒仙臺病毒(sendal virus)也稱日本血凝病毒也稱日本血凝病毒hvjhvj，屬粘病

5、毒副流感，屬粘病毒副流感類群，是類群，是rnarna病毒，多型顆粒狀，易在小病毒，多型顆粒狀，易在小鼠中蔓延。鼠中蔓延。 融合的可能機制：融合的可能機制： 病毒被膜含有糖蛋白，其表面還分布有許多具有神經(jīng)氨酸酶和凝血活性的突起，神經(jīng)氨酸酶可降解細胞膜上的糖蛋白，使細胞膜局部凝集，再通過膜上蛋白質(zhì)分子的重新分布，使膜中的脂類分子重排，而打開質(zhì)膜，導致細胞融合。仙臺病毒誘導仙臺病毒誘導融合過程：融合過程：1. 病毒顆粒附著細胞膜上起搭橋作用，使細胞 粘著成堆，在4冰浴中細胞緊密靠近，但不 發(fā)生融合。2. 37 溫浴后，粘結(jié)部位的細胞膜破壞，形成 通道，細胞質(zhì)流通、融匯。3. 病毒顆粒進入細胞質(zhì)，此時

6、兩個細胞合并、 變圓，完成融合，全過程約1530分鐘。4. 細胞核也相互合并,完成細胞融合仙臺病毒誘導仙臺病毒誘導仙臺病毒誘導仙臺病毒誘導peg誘導誘導peg聚乙二醇聚乙二醇(polyethylene glycol) 商品名：卡波蠟商品名：卡波蠟(carbowax)多聚化合物，分子式多聚化合物，分子式h(och2ch2)noh實驗室用實驗室用peg平均分子量在平均分子量在20020,000一般：一般：1,000固體固體常用分子量：常用分子量：40006000peg誘導誘導融合的可能機制融合的可能機制？脫水作用能使細胞凝聚，并使膜結(jié)構(gòu)發(fā)生脫水作用能使細胞凝聚，并使膜結(jié)構(gòu)發(fā)生 變化變化？改變膜表面

7、電荷或膜電位，而導致膜上蛋改變膜表面電荷或膜電位，而導致膜上蛋 白質(zhì)顆粒聚集及膜脂分子隨之發(fā)生重排之白質(zhì)顆粒聚集及膜脂分子隨之發(fā)生重排之 故。故。 ？peg誘導誘導初步分析初步分析 可能是由于帶有大量負電荷的可能是由于帶有大量負電荷的pegpeg分子和原分子和原生質(zhì)體表面的負電荷間，在鈣離子的連接生質(zhì)體表面的負電荷間，在鈣離子的連接下形成靜電鍵，促使異源的原生質(zhì)體間的下形成靜電鍵，促使異源的原生質(zhì)體間的粘著和結(jié)合，在高粘著和結(jié)合，在高phph、高鈣離子溶液的作、高鈣離子溶液的作用下，將鈣離子和與質(zhì)膜結(jié)合的用下，將鈣離子和與質(zhì)膜結(jié)合的pegpeg分子洗分子洗脫，導致電荷平衡失調(diào)并重新分配，使兩脫

8、，導致電荷平衡失調(diào)并重新分配，使兩種原生質(zhì)體上的正負電荷連接起來，進而種原生質(zhì)體上的正負電荷連接起來，進而形成具有共同質(zhì)膜的融合體。形成具有共同質(zhì)膜的融合體。peg誘導誘導pegpeg誘導過程注意事項：誘導過程注意事項：peg誘導誘導懸浮法：將細胞懸于懸浮法：將細胞懸于40405050的的peg4000peg4000進行進行 溶，處理溶，處理1 12 2分鐘為宜。分鐘為宜。離心法離心法：先將細胞混合物懸于先將細胞混合物懸于30304040的的 peg4000peg4000，再離心進行融合，則可適，再離心進行融合，則可適 當延長融合時間，以當延長融合時間，以5 58 8分鐘為宜。分鐘為宜。 控制

9、與分子量、濃度和處理時間控制與分子量、濃度和處理時間pegpeg誘導注意事項：誘導注意事項：l 輔以輔以515的的dmso或在融合前用或在融合前用 pha處理一下，效果更好。處理一下，效果更好。lph值以值以ph7.48.0為宜，或略偏堿性為宜，或略偏堿性 ph8.08.2。peg誘導誘導peg融合法優(yōu)點融合法優(yōu)點 效率高 材料方便，操作簡易 效果穩(wěn)定peg誘導誘導peg融合法缺點融合法缺點 對細胞有毒性peg誘導誘導物理電融合誘導物理電融合誘導電融合誘導電融合誘導機制機制在直流電脈沖的誘導下在直流電脈沖的誘導下, , 原生質(zhì)體質(zhì)膜表面原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位變化的電荷和氧化還原電

10、位變化, , 使原生質(zhì)體粘使原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂, ,進而質(zhì)膜開始連接進而質(zhì)膜開始連接, ,直到閉合成完整的細胞融合體直到閉合成完整的細胞融合體電融合誘導法原理示意圖電融合誘導法原理示意圖電融合誘導電融合誘導電融合優(yōu)點：電融合優(yōu)點：u融合效率高，可達融合效率高，可達5080u產(chǎn)生雜交細胞的頻率高，是產(chǎn)生雜交細胞的頻率高，是peg法的法的100倍。倍。 u操作簡便、穩(wěn)定，但需設(shè)備。操作簡便、穩(wěn)定，但需設(shè)備。u對細胞無毒害作用。對細胞無毒害作用。u可在顯微鏡下觀察操作?？稍陲@微鏡下觀察操作。電融合誘導電融合誘導融合率融合率融合細胞的細胞核總數(shù)融合細胞的細胞核總數(shù)視野內(nèi)

11、全部細胞的細胞核總數(shù)視野內(nèi)全部細胞的細胞核總數(shù) 100融合率融合率=植物細胞融合基本過程植物細胞融合基本過程1. 去除細胞壁以獲得大量的原生質(zhì)體去除細胞壁以獲得大量的原生質(zhì)體2. 誘導細胞融合形成雜種細胞誘導細胞融合形成雜種細胞 細胞相互靠近細胞相互靠近 形成細胞橋形成細胞橋 最關(guān)鍵的一步最關(guān)鍵的一步 胞質(zhì)滲透胞質(zhì)滲透 細胞核融合細胞核融合3. 篩選篩選,培養(yǎng)培養(yǎng),促進細胞分裂促進細胞分裂,分化分化,4. 從細胞團從細胞團,愈傷組織到最后成株愈傷組織到最后成株動物單個細胞的獲得動物單個細胞的獲得動物細胞融合基本過程動物細胞融合基本過程組織的獲得組織的獲得組織的消化組織的消化誘導細胞融合形成雜種

12、細胞誘導細胞融合形成雜種細胞 篩選，培養(yǎng)篩選，培養(yǎng)植物體細胞雜交和動物細胞融合的比較植物體細胞雜交和動物細胞融合的比較比較項目比較項目植物體細胞雜交植物體細胞雜交動物細胞融合動物細胞融合細胞融合的原理細胞融合的原理細胞膜的流動性、細胞膜的流動性、植物細胞全能性植物細胞全能性細胞膜的流動性細胞膜的流動性細胞融合的方法細胞融合的方法去處細胞壁后誘去處細胞壁后誘導原生質(zhì)體融合導原生質(zhì)體融合使細胞分散后誘使細胞分散后誘導細胞融合導細胞融合誘導方法誘導方法物理（顯微操作、物理（顯微操作、電融合電融合）化學（聚乙二醇）化學（聚乙二醇）物理、化學方法物理、化學方法（同左）（同左）滅活的病毒滅活的病毒用途用途

13、獲得雜種植株獲得雜種植株制備單克隆抗體制備單克隆抗體影響細胞融合的因素影響細胞融合的因素 (1) 親本細胞表面性質(zhì)，表面覆蓋絨毛而不規(guī)則 者較易融合；表面光滑者較難融合。(2) 細胞種類不同，融合效果不同，如腹水癌及 株化細胞較易融合，而淋巴細胞或血球細胞 幾乎不融合。 (3) 細胞融合時需要適宜溫度和運動狀態(tài)。如仙 臺病毒誘導歐利希氏腹水癌細胞融合時，于 37 振搖時易于融合，且融合效率與病毒量 呈正比。但在34 振搖則融合率下降。在 37時不振搖則幾乎不融合。 影響細胞融合的因素影響細胞融合的因素(4)細胞融合過程中，通常耗氧量較大缺氧時經(jīng)常 不融合。空氣中含氧量大于20時有一定融合率，但

14、有些細胞在無氧條件下也可融合。(5)有些細胞融合時需要ca2+，否則不融合，細胞蛋 白質(zhì)亦發(fā)生變化。實驗表明sr2+、ba2+、mg2+、 mn2+等離子可代替ca2+但有效濃度較ca2+大 的多。融合時最適合的離子強度一般為0.1mol/l(6)最適合的ph為7478之間，在此范圍之外， 融合率均較低。影響細胞融合的因素影響細胞融合的因素融合細胞的特征及其意義融合細胞的特征及其意義染色體組不穩(wěn)定，尤其種間雜交細胞,培養(yǎng)過程中染色體會逐漸丟失 理論研究基因定位和繪制基因圖工作中 十分有用應(yīng)用價值單克隆抗體 植物育種融合細胞類型融合細胞類型同核體（同核體（homokaryon）異核體異核體(he

15、terokaryon）多核體（多核體（polykaryon）異胞質(zhì)體異胞質(zhì)體(heterocybrid) 同核體同核體(homokaryon)同源細胞的融合體。由于是同源細同源細胞的融合體。由于是同源細胞，它們的基因型及表現(xiàn)型完全一胞，它們的基因型及表現(xiàn)型完全一樣。樣。異核體異核體(heterokaryon) 非同源細胞的融合體。一般是親源非同源細胞的融合體。一般是親源關(guān)系較近的細胞，這種親和雜種細關(guān)系較近的細胞，這種親和雜種細胞含有雙親全部細胞核和細胞質(zhì)物胞含有雙親全部細胞核和細胞質(zhì)物質(zhì)，其發(fā)育的個體也是可育的，如質(zhì)，其發(fā)育的個體也是可育的，如煙草屬種間的細胞雜種。煙草屬種間的細胞雜種。多核體多核體(polykaryon) 含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。親含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。親源關(guān)系較遠的細胞間融合，融合體以一源關(guān)系較遠的細胞間融合，融合體以一個細胞的核物質(zhì)為主，只加入另一細胞個細胞的核物質(zhì)為主，只加入另一細胞少量遺傳物質(zhì)，如胡蘿卜與羊角芹形成少量遺傳物質(zhì)，如胡蘿卜與羊角芹形成部分親和的雜種細胞。部分親和的雜種細胞。異胞質(zhì)體異胞