基于葉綠體DNA+PCRRFLP分析柿及其近緣種親緣關系

1、園藝學報，（）： 2014411224742480 http: / www. ahs. ac. cn acta horticulturae sinica e-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140724；修回日期：20141031 基金項目：國家十二五農(nóng)村領域科技計劃課題（2013bad14d0502） 基于葉綠體dna pcr-rflp分析柿及其近緣種親緣關系 梁晉軍，梁玉琴，傅建敏* （國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心，中國林業(yè)科學研究院經(jīng)濟林研究開發(fā)中心，鄭州 450003） 摘 要：應用5對葉綠體dna（cpdna）特異引物對柿及其近緣的8個種共32個基因型的cpdna進

2、行pcr擴增。采用7種限制性內(nèi)切酶對其擴增產(chǎn)物酶切位點變異分析表明，在供試柿屬植物中存在豐富的種間多態(tài)性，但供試22個柿種內(nèi)基因型未檢測到變異位點。應用ntsys中upgma法聚類和主坐標分析表明：柿與金棗柿最近緣，其次分別是油柿、云南野毛柿、浙江柿和君遷子，而與美洲柿和烏柿相距較遠。野柿（浙江）為柿的變種，聚類結(jié)果也表明野柿（浙江）與柿有一定差異。 關鍵詞：柿；cpdna；pcr-rflp；遺傳多樣性；親緣關系 中圖分類號：s 665.2 文獻標志碼：a 文章編號：0513-353x（2014）12-2474-07 genetic relationships of diospyros kak

3、i and related diospyros species using chloroplast dna pcr-rflp markers liang jin-jun，liang yu-qin，and fu jian-min* （china paulownia research center，non-timber forest research and development center，chinese academy of forestry，zhengzhou 450003，china） abstract：five special primer pairs of chloroplast

4、genome were used to amplified chloroplast dna （cpdna）regions in 8 diospyros species including 32 genotypes. the products were digested by seven restriction enzymes. the results showed high interspecific cpdna variations within the genus diospyros. twenty-two d. kaki genotypes were detected no visual

5、ly variation in this study. d. kaki had closely relationship withjinzaoshi，followed by d. oleifera，d. artrotricha，d. lotus and d. glaucifolia，but distant from d. virginiana and d. cathayensis in diagram based on the upgma cluster analysis by ntsyspc 2.10e program. wild persimmon（zhejiang）is a variet

6、y varietas of persimmon. the result showed that wild persimmon（zhejiang）is not closely similar to d. kaki. key words：diospyros kaki；cpdna；pcr-rflp；genetic diversity；genetic relationship 柿（diospyros kaki thunb.）品種多數(shù)為六倍體，2n = 6x = 90，但也有少量九倍體，2n = 9x = 135（zhuang et al.，1990）。前人已經(jīng)通過各種分子標記對柿及其近緣種親緣關系進行

7、研究，但結(jié)果差異較大。yuri和shozo（1994）通過對柿及其近緣種葉綠體dna（cpdna）和線粒體dna（mtdna） * 通信作者 author for correspondence（e-mail：fjm371） 12期 梁晉軍等：基于葉綠體dna pcr-rflp分析柿及其近緣種親緣關系 2475 的rflp分析，發(fā)現(xiàn)老鴉柿與柿最近緣；keizo等（1998）對柿屬植物cpdna pcr-rflp分析的結(jié)果表明柿與美洲柿最近緣；hu等（2008）、guo和luo（2011）分別用cpdna pcr-rflp和ssr分析表明柿與君遷子最近緣；keizo等（2008）用nrdna的it

8、s區(qū)和cpdna matk序列分析的結(jié)果表明柿與油柿最近緣。此外，hu等（2008）和tang等（2014）分別用cpdna pcr-rflp和its，matk序列變異分析證明金棗柿為一個新種。 由于柿倍性復雜，其核基因組結(jié)構(gòu)和序列也是復雜多變，從核基因組開發(fā)分子標記有一定難度，相較于核基因，葉綠體基因組結(jié)構(gòu)和序列非常保守，所以葉綠體基因組能很好地用于種間甚至種內(nèi)系統(tǒng)進化和親緣關系的研究（randall et al.，1998）。目前，基于cpdna的pcr-rflp的分子標記已廣泛用于遺傳多樣性、系統(tǒng)進化和植物種類鑒定等研究（claudia et al.，2004；pharmawati et

9、 al.，2004；bao et al.，2005）。本研究中通過對4個柿近緣種（君遷子、浙江柿、金棗柿和油柿）cpdna全基因組測序結(jié)果對比分析，找出變異較大的4個區(qū)段（trnh-matk、rpob-petn、trns-trnfm和ndha）和1個功能基因（rbcl）片段，并設計特異引物對32份柿屬植物的5個cpdna區(qū)域進行pcr-rflp分析，以期為柿及其近緣種親緣關系提供有效證據(jù)。 1 材料與方法 1.1 材料 試材為柿及其近緣種共8種，1個變種32個基因型（表1）。烏柿、美洲柿和油柿于2014年采自陜西楊陵國家柿種質(zhì)資源圃，其余于2013年采自國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心柿種質(zhì)資源圃。

10、 1.2 cpdna區(qū)域選擇與引物設計 2013年6月采用kerstin等（2008）改良的蔗糖密度梯度離心分離法提取4個柿近緣種（金棗柿、君遷子、浙江柿和油柿）的葉綠體總dna；超聲波隨機打斷dna，電泳回收所需大小片段，加上接頭進行文庫制備；最后用illumina-miseq測序儀完成規(guī)定數(shù)據(jù)的測序。采用calera assembler組裝軟件對測序結(jié)果進行組裝。使用dogma軟件對基因進行注釋，最后經(jīng)過人工校正，用clustalx對4個全基因組序列進行對比，找出差異較大的4個區(qū)段（trnh-matk、rpob-petn、trns-trnfm和ndha）和差異較小的1個功能基因（rbcl）

11、片段。 針對所選5個區(qū)段上、下游，利用primer 5.0軟件設計特異引物（表2），并用oligo7.0軟件對引物進行評價，選出最優(yōu)特異引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.3 dna提取、pcr擴增和限制性酶切 1.3.1 dna提取和pcr擴增 2013年6月采用ctab法（doyle & doyle，1987）從柿幼嫩葉片中提取植物總dna，2014年4月進行補充試驗。 2014年4月試材dna在bio-red公司pcr儀上進行pcr擴增。反應總體積為25 l，內(nèi)含1 pcr緩沖液（含1.5 mmol l-1 mg2+），250 mol l-1 dntp，10 mmol l

12、-1 tris-hcl，50 mmol l-1 kcl，0.2 mol l-1 primers，1.25 u taq dna polymerase，dna 40 ng。pcr程序為94 預熱3 min，1個循環(huán)；94 變性45 s，52.7 56 退火1 min（表2），72 延伸1 min 15 s 2 min 30 s，35個循環(huán)；最后72 延伸5 min，4 保溫。pcr產(chǎn)物通過gelred染色的2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。bio-red公司凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄譜帶。 2476 園 藝 學 報 41卷 表1 試驗材料 table 1 the materials in this stud

13、y 學名 scientific name 倍性水平ploidy level 編號 code 種/品種名 specie/cultivar name 脫澀類型astringent type 來源 source diospyros lotus 2n = 2x = 30 1 君遷子（雌）date plum（female） 陜西 shaanxi 2n = 2x = 30 2 君遷子（雄）date plum（male） 陜西 shaanxi d. glaucifolia 2n = 2x = 30 3 浙江柿chekiang persimmon 浙江 zhejiang d. kaki thunb. var.

14、 silvestris 2n = 6x = 90 4 野柿（浙江）wild persimmon（zhejiang） 浙江 zhejiang d. oleifera 2n = 2x = 30 5 油柿oily persimmon 浙江 zhejiang d. virginiana l. 2n = 6x = 90 6 美洲柿（雌）common persimmon（female） 美國 usa 2n = 6x = 90 7 美洲柿（雄）common persimmon（male） 美國 usa d. sp. 2n = 2x = 30 8 金棗柿jinzaoshi 浙江 zhejiang d. cat

15、hayensis 2n = 6x = 90 9 烏柿woolly-flowered persimmon 陜西 shaanxi d. artrotricha 2n = 2x = 30 10 云南野毛柿yunnan yemaoshi 云南 yunnan d. kaki thunb. 2n = 6x = 90 11 富有fuyuu pcna 日本 japan 12 次郎jirou pcna 日本 japan 13 晚御所oku-gosho pcna 日本 japan 14 陽豐youhou pcna 日本 japan 15 禪寺丸zenjimaru pvna 日本 japan 16 湖南鳥柿huna

16、n niaoshi pca 湖南 hunan 17 黑柿blank persimmon pca 日本 japan 18 斤柿jin persimmon pca 日本 japan 19 正月 akagaki pvna 日本 japan 20 甜寶蓋baogai tianshi pcna 湖北 hubei 21 秋焰qiuyan pcna 湖北 hubei 22 羅田甜柿luotian tianshi pcna 湖北 hubei 23 磨盤柿 mopanshi pca 河北 hebei 24 長安懷抱月changan huaibaoyue pca 陜西 shaanxi 25 臺灣正柿taiwan

17、zhengshi pca 臺灣 taiwan 26 牛頭柿niutoushi pca 福建 fujian 27 野柿1號 wild persimmon 1 湖南 hunan 28 野柿2號 wild persimmon 2 湖北 hubei 29 野柿3號 wild persimmon 3 湖北 hubei 30 野柿4號 wild persimmon 4 江蘇 jiangsu 31 野柿5號 wild persimmon 5 湖北 hubei 2n = 9x = 135 32 平核無hiratanenashi pva 日本 japan 注：pcna：完全甜柿；pca：完全澀柿；pvna：不完

18、全甜柿；pva：不完全澀柿；：未知。 note：pcna：pollination-constant and non-astringent；pca：pollination constant astringent；pvna：pollination variant non-astringent；pva：pollination variant astringent；：unknown. 表2 cpdna特異引物序列及擴增條件 table 2 cpdna the sequence and amplification conditions of cpdna special primer pairs in t

19、his study 區(qū)域 region 正向引物 squence forward（53） 反向引物 sequence reverse（53） 退火溫度/ annealing temperature 片段長度/bp fragment lengthtrnh-matk attcttcgtcgccgtagtaaa ggcggatttggtatttgga 55 2 200 rpob-petn aaagttcttccgtcaagc tccccatactacgagtgaaa 52.7 2 000 trns-trnfm gctatcaaccactcagccatct gaggtcacgggttcaaatc 56

20、 1 000 ndha attcagtttgataacctgctac tttggctatcgtcttgttcta 53 1 500 rbcl ggagggatttatgtcaccac ttgtattcggctcaatcctt 55 1 500 12期 梁晉軍等：基于葉綠體dna pcr-rflp分析柿及其近緣種親緣關系 2477 1.3.2 酶切反應 應用apo、hinf、taq、mse、mbo、ava和dra 7種限制性內(nèi)切酶（購自neb公司）對擴增出的cpdna片段進行酶切。酶切反應體積為15 l，內(nèi)含6 l pcr產(chǎn)物，2 4 u限制性內(nèi)切酶和1 限制性內(nèi)切酶反應緩沖液，酶切時間為10

21、h，除taq反應溫度為65 外，其余均為37 。酶切產(chǎn)物通過gelred染色的2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。bio-red凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄譜帶。 根據(jù)擴增片段酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜上條帶的有或無標記為1或0，建成原始矩陣。應用ntsys 2.10，依據(jù)upgma（unweighted pair group method arithmetic averages）法進行聚類分析。 2 結(jié)果與分析 2.1 柿及其近緣種cpdna pcr-rflp的多態(tài)性 設計的5對特異引物均能在供試32份柿及其近緣種中擴增出一條譜帶，通過2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測出擴增產(chǎn)物無明顯長度差異。 5個pcr擴增后的產(chǎn)

22、物經(jīng)過apo、hinf、taq、mse、mbo、ava和dra 7種限制性內(nèi)切酶酶切，35對特異引物/限制性內(nèi)切酶組合中有22對（62.9%）檢測到明顯的種間差異，共獲得181個片段，其中105個片段（58%）呈現(xiàn)多態(tài)性。在rpob-petn、trns-trnfm、ndha、rbcl區(qū)域均未檢測到ava的酶切位點，trnh-matk、rpob-petn、ndha區(qū)域與其余6種限制性內(nèi)切酶組合均存在豐富的種間多態(tài)性，說明本試驗所選區(qū)域種間存在較大變異；而rbcl區(qū)域僅有一個酶切組合存在多態(tài)性，說明在關鍵功能基因片段（rbcl）處柿近緣種存在較少變異，以此反推所選近緣種均與柿親緣關系較近。在所有3

23、5對酶切組合中未檢測到22個柿種內(nèi)試材有酶切位點差異，表明柿種內(nèi)葉綠體基因組十分保守。 由圖1可以看出，依據(jù)trnh-matk/dra、rpob-petn/mbo兩種區(qū)域/酶切組合可明確將8個種，1個變種，分為9組：1和2：君遷子；3：浙江柿；4：野柿（浙江）；5：油柿；6和7：美洲柿；8：金棗柿；16：烏柿；10：云南野毛柿；11 15：柿品種。在22對多態(tài)性酶切組合中，僅trns-trnfm/apo組合能檢測出君遷子（1和2）的雌雄位點變異（圖1，d）；僅trnh-matk/dra（圖1，a）組合能檢測出柿變種野柿（浙江）與柿位點變異（圖1，a中4與11 15）。ndha/mbo（圖1，c

24、）組合可能有存在柿種內(nèi)些微長度差異（未記錄新條帶），尚待進一步驗證。 材料16 32全部為無差異位點柿種內(nèi)品種，未單獨列出。 2.2 柿及其近緣種間的親緣關系 根據(jù)所得到酶切位點變異數(shù)據(jù)建成的原始矩陣，利用ntsys-pc version 2.10軟件計算sm相似指數(shù)，upgma法進行聚類（圖2），柿種內(nèi)22個品種無差異歸為柿種下；同時進行8個種種間主坐標分析（圖3），雌雄（君遷子和美洲柿）歸為一種，柿種內(nèi)22個品種和1個變種野柿（浙江）歸為柿種下。在圖2和圖3中，六倍體柿與同為多倍體的美洲柿和烏柿相似性最差，分布位置最遠，表明柿與烏柿和美洲柿親緣關系相對較遠，盡管柿與烏柿、美洲柿倍性相同，但

25、cpdna序列變異較大，表明兩者有不同的起源祖先，這與前人研究結(jié)果（nakasuka et al.，2002；choi et al.，2003；guo & luo，2006；guo et al.，2006；hu et al.，2008）一致；柿與金棗柿、油柿和云南野毛柿聚為一類，且柿與二倍體金棗柿相似度最高，親緣關系最近，該結(jié)果與hu等（2008）和guo等（2011）關于柿與君遷子最近緣的結(jié)果不同。 2478 園 藝 學 報 41卷 圖1 部分柿及其近緣種cpdna pcr產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后2.5%瓊脂糖凝膠電泳圖譜 1 16見表1，ma為dl2000，mb為50 bp ladder。

26、 fig. 1 restriction patterns of amplified and digested products of chloroplast genomic dna from diospyros spp. 116 refer to the numbers list in table 1. ma：dl2000；mb：50 bp ladder. 圖2 pcr-rflp分析的upgma聚類圖 fig. 2 dendrogram of all genotypes from the upgma cluster analysis based on pcr-rflp data 12期 梁晉軍

27、等：基于葉綠體dna pcr-rflp分析柿及其近緣種親緣關系 2479 圖3 柿屬植物種間pcr-rflp主坐標分析散點圖 fig. 3 diagram showing the relationships among species based on principal coordinates analysis by pcr-rflp 3 討論 前人通過ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子southern雜交（nakasuka et al.，2002）；檢測dna重復位點序列同源性（choi et al.，2003）；srap、irap、remap（guo & luo，2006；guo et al

28、.，2006）；cpdna pcr-rflp多態(tài)性分析（hu et al.，2008）均表明美洲柿與柿親緣關系較遠，本試驗結(jié)果與之一致。但keizo等（1998）通過對東南亞部分柿屬植物包括24個種的限制性內(nèi)切酶酶切研究，用鄰接法分析表明柿與美洲柿、君遷子聚成一組，導致結(jié)果不完全相同的原因是所選材料和擴增區(qū)段不同。 有研究用cpdna pcr-rflp和ssr分析表明柿與君遷子親緣關系最近（hu et al.，2008；guo & luo，2011）；而本試驗結(jié)果表明柿與君遷子、浙江柿親緣關系較遠，柿與金棗柿、油柿、云南野毛柿聚為一類，親緣關系較與君遷子和浙江柿更近（圖2，圖3），導致兩種不同

29、結(jié)果最可能的原因是選用擴增區(qū)域和限制性內(nèi)切酶的不同。keizo等（2008）通過用nrdna its區(qū)和cpdna matk序列分析表明柿與油柿最近緣，這與本試驗中柿與金棗柿、油柿、云南野毛柿聚為一類的結(jié)果（圖2）相一致，就柿與油柿的葉片表觀形態(tài)而言，柿也與油柿相近。本試驗結(jié)果表明柿種內(nèi)無酶切位點差異與前人（yuri & shozo，1994；keizo et al.，1998；hu et al.，2008）用同一方法得到的結(jié)果一致。 金棗柿曾被學術(shù)界認定為柿的一個二倍體品種（楊勇 等，1999），后經(jīng)hu等（2008）和tang等（2014）分別用cpdna pcr-rflp和its，mat

30、k序列變異分析證明金棗柿為一個新種。本試驗中柿與金棗柿能完全分開，支持金棗柿為一新種的結(jié)論。 references bao y，lu b r，ge s. 2005. identification of genomic constitutions of oryza species with the b and c genomes by the pcr-rflp method. genetic resources and crop evolution，52：6976. choi y a，tao r，keizo y，sugiura a. 2003. genomic distribution of t

31、hree repetitive dnas in cultivated hexaploid diospyros spp.（d. kaki and d. virginiana）and their wild relatives. genes genet syst，78：301308. claudia c，muhamment t，phillip d g. 2004. discrimination of diploid crucifer species using pcr-rflp of chloroplast dna. hortscience，39 (7)：15751577. doyle j j，do

32、yle j l. 1987. a rapid dna isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. phytochem bul，19：1115. 2480 園 藝 學 報 41卷 guo d l，luo z r. 2006. genetic relationships of some pcna persimmons（diospyros kaki thunb.）from china and japan revealed by srap analysis. genet res crop evol，53：15971603

33、. guo d l，luo z r. 2011. genetic relationships of the japanese persimmon diospyros kaki（ebenaceae）and related species revealed by ssr analysis. genet mol res，10 (2)：10601068. guo d l，zhang h q，luo z r. 2006. genetic relationships of diospyros kaki thunb and related species revealed by irap and remap

34、 analysis. plant sci，170：528533. hu d c，zhang q l，luo z r. 2008. phylogenetic analysis in some diospyros spp.（ebenaceae）and japanese persimmon using chloroplast dna pcr-rflp markers. scientia horticulturae，117：3238. keizo y，chitose h，shinya k，hitofumi i，ayako l，akira k，akira s，dan e p. 2008. sequenc

35、e analyses of the its regions and the matk gene for determining phylogenetic relationships of diospyros kaki（persimmon）with other wild diospyros（ebenaceae）species. tree genetics & genomes，(4)：149158. keizo y，shinya k，dan e p，naoki u，suranant s，akira s. 1998. phylogenetic relationship of diospyros ka

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