抗體純化大全

1、其它不同飽和度硫酸銨溶液的配制見表1 ；抗體的純化 第一節(jié)硫酸銨沉淀法 基本原理硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質。用此方法可以將主要的免疫球蛋白從樣品中分離，是免疫球蛋白分離的常用方法。 高濃度的鹽離子在蛋白質溶液中可與蛋 白質競爭水分子，從而破壞蛋白質表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來。各種蛋白質的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質。這種方法稱之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來表示。硫酸銨因其溶解度大， 溫度系數小和不易使蛋白質變性而應用最廣。試劑及儀器組織培養(yǎng)上清液、血清樣品或腹水等硫酸銨（NH4）S04飽和硫酸銨溶液（SAS）蒸餾水-P

2、BS（含0.2g/L疊氮鈉）（見附錄一）透析袋-超速離心機-pH計-磁力攪拌器 實驗步驟以腹水或組織培養(yǎng)上清液為例來介紹抗體的硫酸銨沉淀。各種不同的免疫球蛋白鹽析所需硫酸銨的飽和度也不完全相同。通常用來分離抗體的硫酸銨飽和度為33% 50%。、配制飽和硫酸銨溶液（SAS）將767g（ NH4）2SO4邊攪拌邊慢慢加到1升蒸餾水中。用氨水或硫酸調到pH7.0。此即飽和度為100%的硫酸銨溶液（4.1 mol/L, 25）；精選文庫21、2、保留上清液并測量體積;邊攪拌邊慢慢加入等體積的SAS到上清液中，終濃度為1:1（V/V）；將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6小時或攪拌過夜（4 C ,使蛋白質充分沉

3、淀。1、蛋白質溶液10 000離心30 min （ 4C。棄上清保留沉淀;2、將沉淀溶于少量（10-20ml ） 疊氮鈉透析24-48小時（40P BS-0.2g/L，每隔3-6疊氮鈉中。沉淀溶解后放入透析袋對PBS-0.2g/L小時換透析緩沖液一次，以徹底除去硫酸氨；3、透析液離心，測定上清液中蛋白質含量。應用提示一、先用較低濃度的硫酸氨預沉淀，除去樣品中的雜蛋白。1、邊攪拌邊慢慢加SAS到樣品溶液中，使?jié)舛葹?0.5:1（V/V）;2、將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6小時或過夜（4 C;3、3000 g離心30 min （ 4 C ,保留上清液;4、上清液再加 SAS到0.5:1 （V/V），

4、再次離心得到沉淀。將沉淀溶于PBS,同前透析，除去硫酸氨；5、雜蛋白與欲純化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差別很大時，用預沉淀除雜蛋白是非常有效 的；二、為避免體積過大，可用固體硫酸氨進行鹽析（硫酸氨用量參考表1 ）；三、硫酸氨沉淀法與層析技術結合使用，可得到更進一步純化的抗體。參考文獻1、 Burd, R.S., Raymo nd, C.S., Ratz, C. A and Du nn, D丄（1993） A rap id p rocedure forp urify ing IgM monoclonal an tibodies from murine ascites using a DEAE-di

5、sk. Hybridoma二、沉淀樣品（如腹水）20 000 離心30 min，除去細胞碎片;三、透析精選文庫75%80%90%32、 T.G.庫珀著，徐曉利主譯生物化學工具人民衛(wèi)生出版社出版（1980 ）, 353。（夏泉）表1.室溫下硫酸氨飽和度由起始濃度（ S1）提高到終濃度（S2）時需加硫酸氨的量（g/L）0%10%20%25%30%33%35%40%45%50%55%60%65%70%12, 135.精選文庫456 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 662 76757 86 118 137 150 183

6、216 251 288 326 365 406 449 494 592 6492959 78 91 123 155 189 225 262 300 340 382 424 520 6193049 61 93 125 158 193 230 267 307 348 390 485 58319 30 62 94 127 162 198 235 273 314 356 449 54612 43 74 107 142 177 214 252 292 333 426 52231 63 94 129 164 200 238 278 319 411 50631 63 97 132 168 205 245 2

7、85 375 46932 65 99 134 171 210 250 339 4313366 101 137 176 214 302 39233 67 103 141 179 264 3533469 105 143 227 31434 70 107 190 2753572 153 23736115 19877 15779第二節(jié)DEAE離子交換層析法 基本原理 離子交換層析是蛋白質純化的常規(guī)方法，與硫酸氨沈淀法聯(lián)合使用可以非常有效地純化抗 體。DEAE是一種陰離子交換劑， 當蛋白質溶液通過 DEAE柱時，帶負電荷的蛋白質可以被 DEAE 吸精選文庫5pH值大于待純化抗體層析柱(2.5cm?20

8、cm-緩沖液-緩沖液-緩沖液-緩沖液附，帶正電荷的蛋白質則不被吸附而隨溶液流出。純化抗體時可選擇 等電點的緩沖液，此時抗體帶負電荷可以通過電價鍵吸附于DEAE離子交換劑上，然后用增加鹽濃度 的方法將抗體洗脫?？梢杂眠B續(xù)梯度法洗脫，也可以用不連續(xù)梯度（分段洗脫）法洗脫。本 文以 腹水中mAb的純化為例來介紹此方法。試劑及儀器抗體樣品（小鼠腹水或經硫酸氨沉淀的抗體）-DEAE離子交換劑（陰離子交換齊9）A: 25mmoI/L Tris-HCI pH 8.8 +35 mmol /L NaCI B: 25mmoI/L Tris-HCI pH 8.8 +70mmol /L NaCIC: 25mmoI/L

9、 Tris-HCI pH 8.8 +500 mmoI /L NaCID: 25mmol/L Tris-HCI pH 8.8 -PBS （見附錄一） 透析袋(MW CO 10 000) -磁力攪拌器 -蠕動泵和部分收集器 -紫外檢測儀 -梯度發(fā)生器 -電導儀 -pH計 離心機精選文庫6實驗步驟整個層析過程最好在 4 C進行，可在冷室操作;1、抗體樣品對緩沖液 B透析過夜（4 0 ；2、按說明處理DEAE離子交換劑。然后用緩沖液 A平衡。用20倍體積緩沖液 A洗交換劑, 可用過濾或離心法反復洗到流出液的電導率等于緩沖液A;3、將處理好的DEAE離子交換劑懸浮在緩沖液 A中，裝入層析柱。4、用等體積

10、的緩沖液 D稀釋透析過的抗體樣品，使之與緩沖液A的離子強度一致;5、稀釋后的樣品10 000離心10 min （4C，除去沉淀變性的蛋白質;6、層析柱與蠕動泵、部分收集器及紫外檢測儀連接;7、抗體樣品以1ml/min流速上柱，然后用緩沖液 直到流出液在280 nm 的吸光度小于0.05 ；A洗柱1ml/min，將未吸附的蛋白質洗出。用線性梯度緩沖液（35-500 mmol/L NaCI ）&吸附的蛋白質，用連續(xù)增加NaCI的濃度來洗脫?；蚍侄尉彌_液（35、70、140、280、500 mmol/L NaCl ）洗脫。流速 1ml/min ，分部收集 洗脫液2ml /管（圖2-4-1 ）;9、據

11、紫外檢測結果，將抗體峰部分合并。裝入透析袋對 冷凍（視抗體的穩(wěn)定性而定）；PBS（含0.2g/L疊氮鈉）4 透析或10、DEAE離子交換劑可按照商品說明再生使用。圖2-4-1 DEAE離子交換柱層析純化小鼠IgG1、大部分小鼠的單克隆抗體IgG可在50200mmol/L NaCl濃度之間洗脫。2、可用SDS-PAGE或定量免疫學方法流速：1ml/min樣品：0.5ml腹水檢測方法（RIA、ELISA）檢測各部分洗脫液的抗體存在及效價。精選文庫7實驗要點及說明精選文庫81、要得到滿意的分離結果，每ml DEAE離子交換劑所加樣品中蛋白質總量最好不超過10mg。2、用經硫酸銨沉淀初步純化的抗體代替

12、小鼠腹水作為樣品，可得到更好的純化結果。3、如抗體與DEAE離子交換劑不能有效的結合，可將起始緩沖液的 到可以有效結合為止。pH提高0.1個單位,直4、如果沒有合用的蠕動泵和部分收集器，可用手工上樣和收集。洗脫液每管收集 然后用分光光度計測定各管280nm波長的吸光度值。0.5-2ml ,5、該方法可按比例擴大。用適合于高流速的大柱和相應的交換劑來純化大量的蛋白質樣品。參考文獻1. Corthier, G., Boschetti, E. and Charley- Poula in, J. (1984) Imp roved method for IgG purification from var

13、ious animal species by ion exchange chromatography J. Immunol. Meth . 66, 75-79.2、張保真編譯西安醫(yī)科大學出版（1986 ）免疫組織化學理論與技術69-71。（夏泉）第三節(jié)羥磷灰石層析純化抗體基本原理羥磷灰石Ca10（PO4）6（OH）2吸附蛋白質的機理， 通常認為與其晶體表面的Ca2+和P043-兩種基團相關。因為帶電基團緊密排列于晶體表面，可能通過偶極子之間的相互作用來吸附蛋白質。樣品被吸附劑吸附后，用適當的洗脫液（較高濃度的鹽溶液）沖洗，可使之解析。解析下來的物質在流經層析柱的過程中向前移動，遇到前面新的吸附

14、劑可再被吸附。在反復的吸附一解析一再吸附一再解析的過程中，由于待分離物質與吸附劑之間的吸附能力不同， 它們沿洗脫液流動方向移動的速度也不相同，所以在洗脫過程中各組分便會由于移動速度不同而被分離?？贵w與其它蛋白質一樣可以用羥磷灰石吸附柱層析進行純化。精選文庫9精選文庫10層析柱（2.5cm?20 cm-吸附緩沖液:-洗脫緩沖液:20mmol/L 磷酸鉀緩沖液 pH6.8 含 30mmol /L NaCl500mmol/L 磷酸鉀緩沖液 pH6.8 含 30mmol /L NaCl-PBS （見附錄1)10倍稀釋,試劑及儀器抗體樣品（腹水或培養(yǎng)上清液）羥磷灰石（Hydroxylapatite 有售

15、）透析袋(MW CO 10 000)-磁力攪拌器-蠕動泵和部分收集器-紫外檢測儀-梯度發(fā)生器離心機 實驗步驟 1、羥磷灰石柱的準備：將羥磷灰石懸浮于吸附緩沖液中，使之充分水合后裝柱。用 體積的吸附緩沖液洗柱；2、樣品的預處理：含抗體的樣品先在4 0對吸附緩沖液透析過夜或用該緩沖液再將透析或稀釋后的樣品4 000 g離心15min （4C）;3、儀器安裝：將蠕動泵、紫外檢測儀和部分收集器與層析柱連接;4、上樣：將樣品上清液以1ml/min的流速加到柱上，然后用20 柱體積的吸附緩沖液洗柱;5、抗體的洗脫：提高磷酸鹽的濃度可以將抗體洗脫。常用的方法有兩種：一種是用梯度發(fā) 生器進行線性濃度梯度洗脫，

16、濃度為20 500 mmol/L的磷酸鉀緩沖液；另一種方法是用不連續(xù)濃度梯度洗脫，例如可以用35、70、140、280和500 mmol/L的磷酸鉀緩沖液依次分段洗脫。收集洗脫液2ml /管（圖2-4-2 ）;6、合并洗脫液中含抗體的部分（見下面檢測）對PBS透析。根據抗體的穩(wěn)定性 4 C或冷凍精選文庫11防腐（0.2g/L疊氮鈉）保存;圖2-4-2羥磷灰石柱層析純化單克隆抗體IgG流速：1ml/min 樣品：腹水1ml檢測方法1、單克隆抗體IgG通常在200 400mmol/L磷酸鉀濃度之間洗脫。2、可用SDS-PAGE或定量免疫學方法（RIA、ELISA），檢測各部分洗脫液的抗體。應用提示

17、1、每100ml羥磷灰石可吸附大約500 ml細胞培養(yǎng)上清液或 3 ml的腹水或血清中所含的抗體。2、使用羥磷灰石柱較適合的柱長/直徑 可以在5/1 15/1之間（典型尺寸：2.5cm ? 20 cm柱長）。3、在吸附過程中應避免有對鈣的親和力大于磷酸鹽的物質（如 以免減少羥磷灰石的吸附容量。EDTA和檸檬酸等）的存在,4、用過的羥磷灰石柱可以用吸附緩沖液平衡再生后重復使用?；蚣尤爰妆剑?或疊氮鈉（0.2g/L ）儲存。0.03%， V/V)5、如果沒有合適的蠕動泵和部分收集器，可手工加樣和收集洗脫液 度計2ml /管，并用分光光測定各管在280nm波長的吸光度。6、與本方法類似的吸附和洗脫過

18、程也可用來純化其它蛋白質。參考文獻p urificati on fluids by chromatogra phy on an alytical and prep arative scales. Hybridoma 6 ,219-228.Bukovsky, J. and Kenn ett, R.H. (1987) Sim pie and rapid an tibodies from cell culture supern ata nt and ascitesof monoclonalhydroxyla patite（夏泉）第四節(jié) 抗體的辛酸純化法基本原理精選文庫12精選文庫13含有IgG的上清

19、對PBS透析，然后分裝、置-20 C保存。沉淀不同來源IgG的辛酸參考用量IgG來源辛酸用量（每10ml腹水或上清）在人、羊或兔血清或 含有IgG的培養(yǎng)上清中及小鼠的腹水中加入辛酸，可與其中大部分蛋白質形成沉淀，而對 IgG的性質沒有影響，因此是純化IgG的有效途徑。沉淀后經離心即可獲得IgG。辛酸沉淀法與硫酸銨沉淀法比較其主要優(yōu)點為可減少聚合物的形成，但與其相同，所得的抗體純度不夠，還需用其它方法以進一步提高其純度。試劑及儀器 s腹水或細胞培養(yǎng)上清 s 0.06 mol/L醋酸鈉緩沖液（PH4.0 ）（見附錄1） s 1N HCl s 辛酸（ 正-八碳酸，n-octanoic acid ）

20、s 1N NaOH s PBS （見附錄） s 透析袋（MWCO 10,000） s電磁攪拌器 s離心機 操作步驟用燒杯加20ml 0.06 mol/L 醋酸鈉緩沖液（pH4.0 ）到10ml腹水或細胞培養(yǎng)上清中;用1N HCl調節(jié)pH到4.8，后滴加辛酸同時用力攪拌，具體用量參見表1 ;在室溫下繼續(xù)攪拌 30分;5, 000材室溫離心30分，保留上清;用1N NaOH調節(jié)pH到5.7 ;鼠400卩1700 1700 1750 1質量檢察 上清中IgG的純度可用SDS-PAGE分析及合適的酶標免疫測試法測定其免疫活性來確定。上清中可能存在少量雜質，可通過DEAE離子交換層析除去。參考文獻1.

21、Russo,C., Callegaro,L.,La nza,E., and Ferron e,S. (1983) Purificati on of IgG monoclonal an tibody by cap rylic acid precip itatio n. J. Im mun ol. Meth. 65,269-271精選文庫142. Steia nbuchM and Audra n,R. (1969) The isolatio n of IgG from mammalia n sera with the aid of cap rylic acid. Arch.Biochem.Bio

22、phys. 134, 279-284（朱正美）第五節(jié)Sephadex凝膠過濾純化抗體 基本原理凝膠過濾又稱分子篩層析。是一種借助分子篩效應將分子大小不同的混合物進行分離的方 法。交聯(lián)葡聚糖凝膠 Sephadex是常用的層析介質。它是一種含有許多網眼的球形小顆粒， 網眼大小分布均一。當分子大小不同的混合物通過凝膠柱時，其中較大的分子不能進入凝膠網眼，將毫無阻力或阻力很小地隨洗脫液流出，而小分子物則能擴散進入網眼，被阻滯在層析柱上，分子量越小，擴散出來所耗時間就越長。因此分子大小不同的 MoAb可以借助分子 篩效應進行分離提純。本文以IgM的純化為例介紹此方法。IgM因分子特別大（900 kd）而

23、不能進入凝膠顆粒的網孔，可首先被洗脫達到初步純化的目的。試劑和器材-Sephadex G 100 或 G 200粗制IgM-MoAb培養(yǎng)物或抗血清，腹水等精選文庫15層析柱（1.0 cm?30 cn或 1.5cm?40 cm檢測的第一蛋白峰即為IgM-MoAb。5、濃縮與保存: 流動透析過夜。 保存?zhèn)溆谩?洗脫緩沖液：0.01mol/L Tris-HCI 緩沖液 pH 8.0 含 0 .5mol /L NaCI透析袋(MW CO 10 000)-磁力攪拌器-部分收集器-紫外檢測儀離心機 步驟1、樣品處理：將腹水、抗血清或培養(yǎng)上清液離心4000 00分鐘，以除去細胞碎片。較稠的腹水和血清需適當稀

24、釋；2、裝柱：根據樣品量選擇合適的層析柱，將0.01mol/L pH 8.0 含0 .5mol /L NaCl的Tris-HCl緩沖液加到柱長的1/4處，然后將漂洗溶漲的Sephadex G 100 或G 200傾入柱中，自然沉降30分鐘，再用同樣的緩沖液平衡柱1小時，流速0.5ml/min ；儀器連接：將紫外檢測儀和部分收集器與層析柱連接;4、上樣和洗脫：待柱上平衡緩沖溶液接近凝膠上表面時，緩慢加入樣品溶液0.5ml/min。當樣品液 面接近凝膠上表面時，加少量緩沖液清洗柱壁，然后接上緩沖液洗脫并收集1-2ml/ 管。280nm將280nm檢測的第一蛋白峰合并，移入透析袋在磁力攪拌器上 4

25、CM PBS 透析后的溶液可經聚乙二醇或五氧化二磷真空干燥濃縮后，分裝封管，-20 C檢測 1、可用SDS-PAGE或定量免疫學方法（RIA、ELISA）檢測各部分洗脫液的抗體。2、IgM-MoAb 般在外水體積洗脫。應用提示 1、凝膠過濾不變換洗脫液，一次裝柱后可反復使用多次。操作簡單，快速經濟。精選文庫166、如無合用的部分收集器，可手工收集1-2ml/管，用分光光度計測定各管吸光度值。1、周本正編著層析技術及其應用湖北科學技術出版社(1992)28-302、實驗可重復性高，樣品回收幾乎可達100%，且方法溫和，不易引起 生物樣品變性失活,可進行大量樣品的分離純化。3、用于小分子物(如無機

26、鹽)從大分子物(MW20 000 )分離的層析柱，柱體積應大于樣品體積4-10倍，其高與直徑的比例應為5:1-15:1 ;用于大分子物之間的分離(如免疫球蛋白之間的分離)，則柱體積應大于樣品體積25-100倍，高與直徑的比例應為20:1-100:1。4、Sephadex凝膠裝柱時，應灌制均勻無斷層和氣泡。在整個操作過程中，凝膠應始終保 持在液面以下。5、提取的IgM濃度過低或反復凍融會引起變性，應分裝后在-70 (或 -20。凍存，或者加0.2g/L疊氮鈉在4 C可保存數月。參考文獻2、M.Z.阿塔西，C.J.范奧斯，D.R.阿勃索洛姆 主編 鄭昌學,吳安然等譯分子免疫學科學出版社(1988)

27、 212-214 第六節(jié) 免疫球蛋白G的親和層析純化法(蛋白 A或蛋白G法) 基本原理蛋白A是金黃色葡萄球菌的細胞壁(cell wall)(cell wall)成分。蛋白G是G組鏈球菌的細胞壁(cell wall)(cell wall)成分。這兩種蛋白質分子可通過免疫球蛋白的FC區(qū)和大多數哺乳動物(mammal;mammalian)(mammal;mammalian)的 IgG 結合(見表 1)。利用基因工程 (GeneticEngineering)(Genetic Engineering)技術，將蛋白A和蛋白G分子中與Fc區(qū)結合的結構域部分的基因融合，所產生的融合蛋白，則具有更廣泛的IgG結

28、合特異性。蛋白A、蛋白G或融合蛋白A/G與免疫球蛋白Fc段的結合性能使它成為可用于IgG分離的、天然的親和配基。將這些配基蛋白結合到固體支持物上，提供了應用親和層析純化抗體的一步法的基礎。試劑及儀器 l含igG的樣品 l PBS(見附錄) l裝有2ml固相化的蛋白A、蛋白G或蛋白A/G的小型層析柱(有商品供應) l 透析袋(MWCO 10,000)精選文庫17如果條件充許，將層析柱與蠕動泵、分步收集器和UV監(jiān)測器相連;至少用10ml結合緩沖液，以1ml/min速度，洗滌柱中的2ml親和層析介質;上樣;一旦樣品進入凝膠，用結合緩沖液洗柱（至少10個柱體積），直至A280nm小于0.03 ;用洗脫

29、緩沖液洗脫所結合的IgG,分布收集2ml/管;收集過程中，每管立即加入0.1ml中和緩沖液，以中和洗脫所得的IgG液。含IgG的各管對PBS透析,其后根據抗體的穩(wěn)定性 或冷凍保存。，加入防腐劑（0.020g/L疊氮鈉），置4 C實驗要點及說明通?？赏ㄟ^SDS-PAGE分析或通過適當的免疫方法 分進行純度鑒定和免疫活性測定。（如 Western blot, ELISA 等），對洗脫組1.上樣量由層析柱的對特定免疫球蛋白的容量確定, 對于人IgG的容量約為18mg ;2ml柱對于小鼠IgG的容量約10mg ,結合緩沖液：0.1mol/L Tris-HCI pH 7.5 + 0.15moI/L Na

30、CI分步收集器（可按需要選用）洗脫緩沖液：0.1mol/L Gly-HCI pH2.8+0.15mol/L NaCI中和緩沖液：1moI/L Tris-HCI pH 8.0蠕動泵（可按需要選用）I UV監(jiān)測器I pH計 操作步驟*樣品（可為血清、腹水、含有igG的單克隆和多克隆抗體的細胞上清液樣品在4 C,對結合緩沖液透析過夜，或將其與至少1 : 1稀釋的結合緩沖液混合;2.柱上結合的抗體被洗脫的速度很快，通常在第一洗脫流份中;精選文庫1850000 。，按要求稀釋到 20mmol/L TE83.下列緩沖液也可用為結合緩沖液：含0.15mol/L NaCl的50mmol/L硼酸鈉pH8.0,或

31、含0.15mol/L NaCl的0.1 mol/L 磷酸鹽液pH7.5。高鹽結合緩沖液(1 mol/L NaCl )可能增 加總的柱結合容量約 50% ;4.應用pH8.0-9.5的緩沖液作為結合緩沖液，通常能增加蛋白A對小鼠IgG的結合力;5.對于蛋白G的層析柱，可用低pH的結合緩沖液，如PH5.0含0.15 mol/L NaCl的50mmol/L醋酸緩沖液；6.對pH敏感的抗體，需用比較溫和的洗脫液，如:含0.2mol/L NaCl的0.1mol/LTris-醋酸 pH7.7 或 3mol/L KCl 或 5.0mol/L KI 或 3.5mol/L MgCl2 ;7.蛋白G也能與IgG的

32、CH1區(qū)結合，所以不能用于F(ab 與Fc的分離;8.如果無蠕動泵和部分收集器可用，也可利用重力進行上樣及洗脫，手動收集2ml /管,用分光光度計測定280nm的吸光度。參考文獻 1. Bjorck,L, And Kronvall,G. (1984) Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG bi nding reage nt. J. Immu nol. 133,969-9742.Eliass on, M.QIss on, A., Palmcramtz,E.,Wiberg,k.,l ngan

33、 as,M.,Guss,B.,L in dberg,M., andUlldh,M.(1988)Chimeric IgG-bi nding recep tor engin eered from sta phylococcal p roti n A and stre ptococcal p rotein G.J.Biol.Chem.263,4323-4327.(張文利、朱正美) 第七節(jié)應用酶解從IgG制備F( ab )的方法 基本原理本文介紹應用胃蛋白酶及菠蘿蛋白酶從IgG制備F( ab)2的方法。這兩種酶均在免疫球蛋白的絞鏈區(qū)雙硫鍵的下方分解IgG (見圖1)，裂解產物為三個片段，即兩個相同的F

34、ab段和一個Fc段，F(xiàn)ab段即抗原結合片段，含有一條完整的輕鏈和半條重鏈，分子量約 首選的酶是胃蛋白酶，它在IgG的絞鏈區(qū)二硫鍵的近C末端切斷重鏈，生成大、小兩個片段，大片段為Fab雙體，稱為F( ab ),其功能與Fab相同。胃蛋白酶可用于大多數的小鼠 的IgG 1及IgG 2 a以及大鼠、人和兔的IgG抗體制備F( ab )2但不能用于小鼠的IgG 2 b 抗體。應用本法，可通過HPLC測定組分的大小來判定水解的程度。F( ab )組分在分子量100000部分洗脫，而IgG則在分子量150000的流分中。由于小鼠IgG 1抗體抗胃蛋白酶，或使酶水解為較小的肽段，因此可采用菠蘿蛋白酶，或經

35、過預試來選擇確定合適的蛋白酶。圖2-7-1 IgG不同蛋白酶水解部位示意圖 試劑及儀器I 0.2mol/L TE8: 0.2mol/L Tris-HCl pH 8.0 + 10mmol/L EDTA精選文庫19l 2mol/L醋酸,PH3.7 : 103ml冰醋酸+ 17.2克醋酸鈉用蒸餾水配至1Ll 70mmol/L 醋酸 / NaCl , pH4.0 : 70m mol/L ,50m mol/L ,pH4.0 （22ml冰醋酸，1.15 克醋酸鈉，2.29克NaCl，用蒸餾水配至1L l胃蛋白酶：10mg/ml胃蛋白酶溶于70m mol/L 醋酸/ NaCI液pH4.0，現(xiàn)用現(xiàn)配 l 1

36、mol/L Tris pH9.2 （121 克 Tris 堿溶于 1L 蒸餾水，以 HCI 調至 pH9.2） l 50m mol/L TE7 : 50m mol/L Tris-HCl pH7.0 + 2 mol/L EDTA l 2-巰基乙醇l碘乙酰胺儲存液：50 mmol / L 碘乙酰胺液l 50m mol/L TE7 碘乙酰胺應用液：（加1%體積的碘乙酰胺儲存液到50m mol/L TE7 中,現(xiàn)用現(xiàn)配l菠蘿蛋白酶：10mg/ml的50m mol/L TE7 液，在臨水解前配制。加入2-巰基乙醇至終濃度為0.5卩mol/L，在37 C保溫15分鐘，以使酶活化 l 10，000 MWCO

37、濾膜的濃縮裝置 l分級范圍10000-250000的分子排阻層析 HP LC系統(tǒng)l可分離150000蛋白質的凝膠過濾（分子排阻）柱?？捎脙筛睆?.5cm、凝膠床高80cm的柱子*，以30ml/小時的流速，來分離 10-100mg的IgG l水浴 l透析帶（10000 MWCO ）。用前在含0.1mmol/L EDTA的蒸餾水中煮沸、清洗 操作步驟（一）酶解IgG樣品的用量 通常酶解50-200mg IgG ，可生成20-100mg F(ab )2。對于新抗體，可先用 5-15 mg試做,以確定所用酶對抗體的水解能力；(二) igG的濃度及予處理 將IgG濃縮到10-15 mg/ml ，為進行

38、胃蛋白酶水解，IgG要先對0.02 mol/L TE8 透析，為 進行菠蘿蛋白酶水解，IgG要先對50mmol/LTE7透析；(三)胃蛋白酶水解法1 .用2 mol/L醋酸(pH 3.7 )將抗體液的pH調到4.0-4.2 ,將胃蛋白酶終濃度稀釋到30g/L(W/W );2.在37 C水浴中保溫酶解。每次取樣10卩通過HPLC測定水解組分的分子大小。在水解過程中，HPLC測定的洗脫峰應從IgG的單峰變成兩個峰，分子量小的組分是F(ab )2。水解通常需要6-12小時；3.當水解到IgG濃度100g/L ,或F(ab 峰2的大小不再增加時，加入1 mol/L Tris (pH9.0 )，調節(jié)反應

39、液到 pH 8.0，以終止反應。(四)菠蘿蛋白酶水解法1 .向抗體溶液中加入已活化的菠蘿蛋白酶液，達到需要的濃度。對不同抗體，所需的酶濃度要先用預實驗來確定，一般的酶濃度在5-40g/L (W/W)之間；精選文庫20)2 fragments2.反應過程中，同胃蛋白酶水解法一樣，用HPLC來監(jiān)測水解的程度;3.當水解到IgG濃度100g/L ，或F(ab峰的大小不再增加時，加入碘乙酸至終濃度 0.5mmol/L，終止反應。(五)產物F(ab ) 2的分離 1.用經過0.2 mol/L TE8 平衡的凝膠過濾柱，按分子量大小來分離水解組分 2.分離后，將分子量100000的F(ab )峰合并、濃縮

40、.圖2-7-2產物F(ab ) 2與IgG的分離 實驗要點及說明 1 .胃蛋白酶的活性對 pH高度敏感，在最適 pH范圍外，pH下降其活性會明顯增加，pH 上升，其活性則會明顯下降；2 .大多數的lgG1的水解需6-12小時。也可將水解液置4 C水解過夜。小鼠IgG3很難被酶解消化成F(ab ) 23.當需要完全不含IgG或Fc段的F(ab )2 水解產物還需通過抗-Fc俛疫吸附柱純化 (請參閱參考文獻1),或通過蛋白 A-瓊脂糖柱純化；4.水解的程度也可通過非還原性的7. 5% SDS-PAGE與考馬氏藍染色來測定。參考文獻1.Glennie, MJ., Tutt, AL. And Gree

41、nman, J. (1993) Preparation of multispecific F(ab )2and F(ab )3 antibody derivatives. In Tumor Immuology. A Pratical Approch (eds. Gallagher , G., Rees, RC. And Rey nolds, CW.). pp.225-244. Oxoford Un iversity P ress.2. Lamoyi, E. And Niso noff, A. (1983) Prep aration of F(abFrom mouse IgG of variou

42、s subclasses. J. Im mun ol. Meth. 56, 235-243.(朱正美) 第八節(jié)從F(ab )2制備Fab 基本原理在F(ab )2絞鏈區(qū)的雙硫鍵可用巰基乙醇使之還原，得到具有游離SH基的Fab,隨后可用碘乙酸使Fab的游離SH基烷基化，從而防止其再氧化生成F(ab )2 試劑與設備 l 0.2 mol/L TE8: 0.2 mol/L Tris-HCl, pH 8.0 + 10m mol/L EDTAl 2-ME還原溶液：220mmol/L 2-巰基乙醇+1 mmol/L EDTA(在通風櫥中配置此溶液) l 250mmol/L 碘乙酸：250mmol/L 碘乙

43、酸儲存液 l HPLC系統(tǒng)及凝膠過濾柱(同前) l透析袋。經過在含 0.1mmol/L EDTA水中煮沸及沖洗 操作步驟1. F(ab的濃縮：將所得的 F(ab 液濃縮到0.5-15mg/ml范圍;2.還原:精選文庫21(1)醇);(2)在25 C水浴中保溫30分鐘;加入1/10體積的250m mol/L 碘乙酸，以封閉游離的SH基;在25 C水浴中保溫10分鐘;用HPLC分析法，通過比較F(ab )2原液與還原生成的 Fab的量，來檢測還原度。Fab1 )。Fab的分子量為50000 ；(5)在F(ab )2之后被洗脫，使得洗脫的峰形改變(見圖(6)在大多數的情況下，大于950g/L的F(a

44、b )2被還原為Fab3. Fab產物的分離:(1)如果在制備液中僅存在少量的未還原的F(ab )2是符合實驗需要的，殘余的 2-巰基乙醇和碘乙酸可通過對緩沖液透析以除去；(2)如果還原不夠充分，或需要Fab完全與未還原的 F(ab )分離，則可在0.2 mol/L TE8液中通過凝膠過濾法進行分離，合并、濃縮分子量為50000的Fab峰。圖2-7-4 Fab產物與F(ab )2的分離(圖 240 )實驗要點及說明1.上述操作也會使IgG的部分重鏈雙硫鍵還原，但因非共價相互作用還可維持重鏈與輕鏈 的連系，故不影響Fab段與重鏈的結合性能。 然而，在非還原性 SDS-PAGE分析圖譜中，則 可看

45、到完整的Fab(分子量大約50000Da )及輕鏈(大約 25000Da )兩條條帶；2.可用100g/L的非還原性SDS-PAGE,來檢測反應液中 F(ab 的還原程度。F(ab 約分子量100000Da，F(xiàn)ab在50000 Da，而已還原的重鏈及輕鏈分子量為 25000 Da ， 容易分辨。條帶條帶參考讀物Glennie, MJ., McBride, HW,. Worth, AT And Stevenson, GT. (1987) Preparation performanee of bispecific F(ab丫 )2 antibody containingrtkeietFabImmu

46、 nol. 139, 2367-2375.第九節(jié)免疫球蛋白A純化andfragme nts. J.基本原理免疫球蛋白A (IgA )可由多種組織和器官產生，如粘膜，骨髓，淋巴結等。血中IgA以單精選文庫22向F(ab )2液中加入1/10體積的2-巰基乙醇還原液(終濃度為20m mol/L 2-巰基乙精選文庫23體或聚合體形式存在，含量約為210 80mg，骨髓瘤病人血清中IgA水平增加。IgA分lgA1 和IgA2兩種亞型，其中IgA1亞型占總IgA的90%以上，并在鉸鏈區(qū)結合有特征性的0 連接寡糖鏈。（見第六篇，第二章）。實驗中常需對總IgA及IgA1亞型進行分離、純化和鑒定。IgA純品價

47、格昂貴，如能自己制備，則可節(jié)省資金。一、IgA的抗體親和層析分離 原理 利用IgA抗體對IgA抗原的特異結合特性。溴化氰活化的Sepharose-4B凝膠與多克隆抗IgA 抗體，或抗IgA1亞型單抗共價交聯(lián)制備親和層析柱。 經親和柱分離，即可得到總IgA或lgA1 亞型純品。試劑和儀器I多克隆抗IgA抗體，或抗IgAI亞型單抗I抗體一Sepharose-4B偶聯(lián)膠：制備過程參見（第二篇，第一章），或購買成品膠I 0.22微I孔濾膜I層析柱I 0.01mol/L 硼酸鈉，pH 8.0I 0.25moI/L甘氨酸一鹽酸緩沖液，pH 2.7I Tris-HCI 緩沖液，pH 8.0I PBS緩沖液保存液：含 0.02% NaN3 的 0.01moI/L 硼酸鈉，pH 8.0試管紫外分光光度儀離心機 操作步驟 1.收集5ml血清，27,000g , 4 C離心30min。上清經0.2