抗癌藥靶向(葉酸介導(dǎo))納米給藥系統(tǒng)的研究

1、南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院 碩士學(xué)位論文抗癌藥靶向（葉酸介導(dǎo)）納米給藥系統(tǒng)的研究 姓名：劉海 申請學(xué)位級別：碩士 專業(yè)：藥物化學(xué) 指導(dǎo)教師：朱亮 20070501 摘要 摘要目的：合成葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白（）；制備載藥葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白納 米粒（），并對其包封率及其靶向性進(jìn)行評價。方法：、葉酸在縮合劑的作用下與牛血清白蛋白偶聯(lián)。以葉酸與白蛋白的偶聯(lián) 率為評價指標(biāo)，運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計優(yōu)化葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白的合成條 件。 、用去溶劑法制備納米粒。同樣也采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計方法設(shè)計納米粒的 制備實(shí)驗(yàn)，以包封率為評價指標(biāo)篩選最佳的制備工藝。 、選擇肺癌細(xì)胞作為靶細(xì)胞，而人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（）作為 正常的對照細(xì)胞。整

2、個實(shí)驗(yàn)分為五組：生理鹽水組、砒霜組、載藥 三個劑量組、葉酸阻斷組、載藥白蛋白納米粒（）組。采 用，法進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。 、采用直接注射法建立小鼠肝癌模型。而后取肝癌小鼠分為三組：游離 鈣黃綠素組、包裹鈣黃綠素的組和包裹鈣黃綠素的組， 進(jìn)行體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)。 、取肝癌小鼠隨機(jī)分成四組：生理鹽水組、包裹砒霜的組、包裹砒 霜的組、羥基脲組。尾靜脈給藥，進(jìn)行藥效實(shí)驗(yàn)。以生存時間 為評價指標(biāo)。結(jié)果：、運(yùn)用最優(yōu)合成條件合成了偶聯(lián)率為 的葉酸偶聯(lián)牛血清白 蛋白；而在最佳條件下制備的納米粒包封率為。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯 示：當(dāng)砒霜濃度為肛時，對靶細(xì)胞的抑制率為，而對 正常細(xì)胞僅為；對靶細(xì)胞的抑制率為，對薩常細(xì)胞為。 、

3、不同載體包裹的藥物在體內(nèi)的蓄積不同。組肝濃度峰值明顯高 于組，二者峰值也明顯高于游離鈣黃綠素組。動物模型藥效實(shí)驗(yàn) 顯示三理赫水組小鼠生存期為，而組為： 組為；羥基脲組為。結(jié)論：采用溫和條件下合成的制成的載藥納米粒，對靶細(xì)胞具有特異性 殺傷作用：，外，載藥能顯著延腫瘤小鼠的存期。酸偶聯(lián) 摘要 白蛋白納米粒具有主動靶向性并且該主動靶向性是通過葉酸介導(dǎo)的。關(guān)鍵詞：三氧化二砷；葉酸；納米粒；靶向性；肝癌模型 ：， （）， ， （） ， ： ， ， ， ： （ ） ， ， ， ：， ： ， ， ， ， ： ； 學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明 學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工

4、作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得南昌大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。 學(xué)位論文作者簽名手寫，： 每簽字同期：？叩年否月， 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學(xué)位論文作者完全了解 南昌大學(xué) 有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)南昌大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。 （

5、保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書）學(xué)位論文作者簽名（手寫）： 劣奔 導(dǎo)師簽名。掏：莽知簽字同期：刎年 ， 多月 只 簽字同期：沖月 ，學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向：工作單位： 電話：通訊地址： 郵編： 第章引言 第章引言 腫瘤已成為嚴(yán)重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病，其死亡率在發(fā)達(dá)國家居第位（）、發(fā)展中國家居位（），占全球人類死亡總數(shù)的。因此近半個世紀(jì)以來攻克腫瘤一直是各國政府與科研、醫(yī)療機(jī)構(gòu)的主要任務(wù)之一。化療作為腫瘤三大常規(guī)治療方法之一，已成為腫瘤治療不可缺少的手段。目前臨床上常用的抗腫瘤藥物有多種，其中細(xì)胞毒性型藥物達(dá)”種，化療用藥多以后者為主。腫瘤化療的根本目的是在保證患者安全的情況下以藥物

6、消滅腫瘤細(xì)胞，即要求所使用的藥物對機(jī)體正常細(xì)胞無損害而對腫瘤細(xì)胞呈敏感的殺滅作用，達(dá)到安全、有效治愈腫瘤的目的心。然而，實(shí)際上臨床使用的抗腫瘤化療藥物均有不同程度的毒副作用， 有些嚴(yán)重的毒副反應(yīng)是限制藥物用藥劑量和使用的直接原因。發(fā)生這些毒副反應(yīng)的主要原因在于化療藥物缺乏對腫瘤部位的特異性，大劑量給藥時產(chǎn)生非特異性毒性，甚至對正常組織造成嚴(yán)重的損傷。因此，人們希望尋找出一種可以提高腫瘤組織內(nèi)藥物濃度而下常組織中藥物濃度較低的一種治療方法，從而減少藥物帶來的毒副反應(yīng)。藥物靶向技術(shù)就是為了解決這些問題而提出的并己成為整個藥學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。 隨著對腫瘤分子水平研究的不斷深入，在腫瘤細(xì)胞表面或腫

7、瘤相關(guān)血管表面發(fā)現(xiàn)了一系列受體，它們與腫瘤生長增殖密切相關(guān)并在腫瘤組織過度表達(dá)，它們與特異性抗體或配體結(jié)合可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)化。這種腫瘤特異性的受體為腫瘤治療提供了靶點(diǎn)，把傳統(tǒng)的化療藥物和新發(fā)現(xiàn)的腫瘤特異性的配體或抗體結(jié)合，可增懇锏鬧琢鲅裥圓跎僖锏畝靖弊饔謾磽猓行涮謇嗨莆錕刪赫種婆涮逵?xùn)V芴宓慕岷希?并在與受體結(jié)合后誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)化。”。研究發(fā)現(xiàn)葉酸受體在下常組織中的表達(dá)高度保守，只在肺、腎、脈絡(luò)膜、胎盈中有低到中等水、表達(dá)，足在大部分惡性腫瘤巾，如卵巢癌、子寓內(nèi)膜癌、腎癌、乳腺癌、 第章引言肺癌、結(jié)腸癌和鼻口癌中均高度表達(dá)或過度表達(dá)，有時可比正常組織高出”倍。 等對比研究下常細(xì)胞系和幾種惡性細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，

8、惡性細(xì)胞系比正常細(xì)胞系的葉酸受體至少高出倍，最高可達(dá)倍。研究惡性腫瘤患者的活檢標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性腦瘤、腎細(xì)胞癌及大部分卵巢癌患者均高度表達(dá)葉酸受體】。 葉酸又名維生素，可還原為四氫葉酸。四氫葉酸是一碳單位轉(zhuǎn)移酸的輔酶，參與一碳單位的代謝及嘌呤和胸腺嘧啶的從頭合成。在生物體內(nèi)，有兩種內(nèi)化葉酸的機(jī)制：一是低親和力的跨膜蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)四氫葉酸和二氫葉酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；另一是高親和力的糖蛋白受體即葉酸受體，吸收葉酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。葉酸受體收集胞外葉酸及葉酸衍生物，通過內(nèi)化方式將其帶入細(xì)胞，是介導(dǎo)葉酸進(jìn)入細(xì)胞的主要途徑。利用葉酸作為配體，結(jié)合藥物，通過葉酸與其受體結(jié)合介導(dǎo)的靶向給藥系統(tǒng)正倍受關(guān)注。 白蛋白納米粒是以白

9、蛋白作為載體，包封或吸附藥物，經(jīng)過固化分離而形成的實(shí)心球體，其粒徑一般”納米（）之間，屬一種固態(tài)膠體藥物釋放體系。白蛋白納米載體具有高度靶向、藥物控制釋放、提高難溶藥物的溶解度和吸收率優(yōu)點(diǎn)，提高藥物療效和降低毒副作用陽。白蛋白是一種杰出的藥物載體，具有無毒、可生物降解性，既在體內(nèi)受蛋白酶的作用而降解；當(dāng)藥物與白蛋白結(jié)合后，可阻止藥物從注射部位的釋放，使藥物緩慢釋放陽叫。 國外有利用葉酸介導(dǎo)一些藥物或者診斷試劑至腫瘤部位的研究；同時也有用修飾的納米粒將寡聚核苷酸轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)的研究。國內(nèi)有利用磁導(dǎo)向的脂質(zhì)體和微球方面的研究。四川大學(xué)華西藥學(xué)院張良珂等人先將白蛋自制備成納米粒，而后與葉酸偶聯(lián)，再用異硫

10、氰酸熒光素對其進(jìn)行標(biāo)記，最后用熒光定量的方法觀察腫瘤細(xì)胞射納米粒的攝取情況，證實(shí)了可通過葉受體介導(dǎo)的方法將藥物濃集葉酸受體豐富的腫瘤部位。 本實(shí)驗(yàn)擬先將葉酸清白蛋，偶聯(lián)，然后進(jìn)行分離純化，進(jìn)而得到。 第章引育種用于腫瘤靶向的囊材；而后將所得囊材制備成包裹有砒霜的納米粒，并在細(xì)胞水平和腫瘤模型動物體內(nèi)研究其對腫瘤的主動靶向性及其藥效作用。 第章材料和辦法 第章材料與方法實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器實(shí)驗(yàn)動物： 小鼠購自于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（合格證號：粵監(jiān)證字）細(xì)胞株： 人肺癌細(xì)胞株購于武漢大學(xué)生命科學(xué)院中國典型培養(yǎng)物保藏中心 小鼠肝癌細(xì)胞購于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離自正常人骨髓血（

11、骨髓樣本由一附院血液科提供）主要試劑： 牛血清白蛋白 上海新量化工試劑有限公司 葉酸 上海新量化工試劑有限公司 碳二亞胺鹽酸鹽（） 上海三杰生物技術(shù)有限公司 戊二醛溶液 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 三氧化二砷 上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站 培養(yǎng)基 公司 無葉酸 培養(yǎng)基 公司 胎牛血清（） 杭卅四季青生物公司 公司 胰蛋白酶 公司 公司 鈣黃綠素 上海試劑廠。主要儀器設(shè)備： 第章材料和方法 電子天平 德國公司 型數(shù)顯恒溫水浴箱 常州國營華東電子管廠 恒溫磁力攪拌器 金壇市富華儀器有限公司 離心機(jī) 上海安亭 旋渦混合器 上海精科 超聲細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝 超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備廠 恒溫：培養(yǎng)箱 型酶

12、聯(lián)免疫檢測儀 國營華東電子管廠 透射電鏡 熒光分光光度計 上海三科儀器有限公司 紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司實(shí)驗(yàn)方法葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白的制備，分離以及偶聯(lián)率的測定葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白的合成與分離 將葉酸溶于的磷酸緩沖液（）中，加入后于磁力攪拌器上攪拌活化分鐘，再加入 牛血清白蛋白的溶液，攪拌下反應(yīng)數(shù)小時即得引。將反應(yīng)液過 一柱，收集前段淡黃色有乳光部。冷凍干燥即得。葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 精密稱取葉酸 ，用的定溶于 的容量瓶中，得的葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別吸取葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、 于個 的容量瓶中，用的定容至刻度，用的作空白對照，在 處測紫外吸收。繪制葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。偶聯(lián)率的測定 將葉酸偶聯(lián)牛

13、血清白蛋白溶于的中，加入適量的胰籃白酶溶液，于水浴中消化 后，離心取上清液在 處測紫外吸收。計算葉酸的賾，最后汁算出葉脧的偶聯(lián)率（）。 偶降麗鬻器醬 第章材料和方法 合成條件的篩選 葉酸偶聯(lián)率越高，納米粒對腫瘤的靶向性就越高。為了獲得具有較高偶聯(lián)率的葉酸偶聯(lián)白蛋白。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)和大量的預(yù)實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)最終確定考察葉酸用量、與葉酸摩爾比、反應(yīng)時間三因素，并進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，。以偶聯(lián)率為考察指標(biāo)，篩選最佳合成工藝。用統(tǒng)計軟件，進(jìn)行三因素三水平正交設(shè)計資料的方差分析（見表）。 表因素水平表載藥白蛋白納米粒的制備砷標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定矧 精密稱取干燥恒重的三氧化二砷 ，加入 溶液（ ），加熱溶解后定

14、容至 ，即得炫的砷標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取砷標(biāo)準(zhǔn)儲備液 ，加入 幾的：。 ，定容至 ，即得 的砷標(biāo)準(zhǔn)工作液。 分別吸取砷標(biāo)準(zhǔn)工作液（ ）、 于砷化氫發(fā)乍瓶中，加蒸餾水至 ，于各發(fā)生瓶中分別加入硫酸 ， 碘化鉀溶液 ，搖勻后水浴保溫分鐘，再加入 ：溶液（臨用時配置） ，充分搖勻水浴保溫分鐘后，加入無砷鋅粒 （同一批弓），立即接卜塞有乙酸鉛棉花的導(dǎo)管并插入有 吸收液的吸管中（接用水封），水浴反應(yīng)小時，產(chǎn)塵的砷化氰用吸收液（ 第章材料和力法： 一：乙醇為：）吸收，測定各管吸收液。值，重復(fù)次，計算砷標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)。鈣黃綠素的熒光掃描和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用值的磷酸緩沖液配制鈣黃綠素溶液。于熒光分光光度計下選擇激

15、發(fā)波長為 ，而發(fā)射波長選擇 一 之間進(jìn)行掃描。選擇合適的發(fā)射波長進(jìn)行熒光定量實(shí)驗(yàn)。 精密吸取。 的鈣黃綠素溶液、 于 的容量瓶中，用值的磷酸緩沖液稀釋至刻度。選擇激發(fā)波長 ，發(fā)射波長為 測定熒光強(qiáng)度。繪制鈣黃綠素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。白蛋白納米粒的制備 將：。用少量 溶液加熱溶解后冷卻，再將牛血清白蛋白溶于其中，待完全溶解后調(diào)節(jié)值微堿性，室溫下緩緩（逐滴）加入無水乙醇，攪拌半小時待溶液出現(xiàn)混濁后再緩緩加入戊二醛溶液乜引，繼續(xù)攪拌固化 。將反應(yīng)液倒入離心管中，于離心機(jī)（ ）中離心，用水反復(fù)洗三次后，真空干燥。 將鈣黃綠素溶于牛血清白蛋白的水溶液中，然后同上操作，制各載有鈣黃綠素的白蛋白納米粒。納米粒的形態(tài)

16、和粒徑檢查 取一定量的納米粒于吐溫水溶液中超聲分散一段時間后，在 透射電鏡下拍照。包封率的測定 稱取三氧化二砷白蛋白納米粒 分散于胰蛋白酶水溶液中，水浴中消化 后，于 離心分鐘后，精密吸取上清液再稀釋。取一定量的稀釋液加入砷化氫發(fā)生瓶，用新銀鹽法測定砷的含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算砷的濃度，并根據(jù)稀釋倍數(shù)計算砷的總濃度。 白蛋自納米粒中。含量 包封率一 。 ：。投藥量空白回收率和加樣回收率的測定 空白叫收率的測定：精密吸取 砷標(biāo)準(zhǔn)儲備液（ ）和 空白納米粒，加入 胰蛋白酶溶液在水浴中消化 后，加水至 ，于 離心分鐘，精密吸?。呵逡阂裕旱谋壤麴s水稀釋定容， 第章材料和方法 空白回收率朵蠹警取 稀釋液

17、新銀鹽法測定砷含量。 加樣回收率的測定：稱取三氧化二砷白蛋白納米球 ，按照包封率的測定方法測定砷含量。精密吸取砷標(biāo)準(zhǔn)儲備液 和已測定濃度的載藥納米球 ，加入 胰蛋白酶溶液在水浴中消化 后，加水至 ，于 離心分鐘，精密吸取上清液以：的比例用蒸餾水稀釋定容。 加樣回收率笪墮壘專磊囂考產(chǎn)。溉取稀釋液用新銀鹽法測定砷含量。 砷的加入量納米粒制備條件的優(yōu)化 白蛋白納米粒的包封率越高，則發(fā)揮治療作用需要的納米粒的量就越少：另外包封率也是納米粒質(zhì)量評價的一個重要指標(biāo)。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)最終確定選擇：。用量、牛血清白蛋白的濃度、乙醇與溶液的體積比三因素各取三水平進(jìn)行工藝優(yōu)化（見表）。以包封率為評價指標(biāo)畸硼

18、。 表因素水平表，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組刪 肺癌細(xì)胞，以含 青霉索、 。鏈霉素、的 第章材料和方法培養(yǎng)液，在、含體積分?jǐn)?shù)為的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 人骨髓日充質(zhì)于細(xì)胞，取出加入抗凝劑的正常骨髓血 和 含胎牛血清的生長液混合后。置于含體積分?jǐn)?shù)為的、孵箱中培養(yǎng)，待到在顯微鏡下觀察有明顯細(xì)胞貼壁時換液，細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶后傳代，“別。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 本實(shí)驗(yàn)分為五組：生理鹽水組（正常對照組）、砒霜組、載藥白蛋白納米粒組、載藥葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒組（高、中、低濃度），以及葉酸阻斷組，進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。繪制肺癌細(xì)胞和細(xì)胞生長曲線（法） 將細(xì)胞接種于個孔培養(yǎng)板中

19、，每板接種孔，另平行設(shè)一實(shí)驗(yàn)孔只加培養(yǎng)液，用于測定時作為調(diào)零孔；細(xì)胞接種密度約個，每孔加入細(xì)胞懸液，分別繼續(xù)培養(yǎng)、和 ，每個時間點(diǎn)各取一板用于實(shí)驗(yàn)測定。 每孔加入（ ） ，繼續(xù)培養(yǎng) 后終止培養(yǎng)，小心吸出孔內(nèi)上清液，每孔加入 ，用震蕩混合儀震蕩 ，使結(jié)晶充分溶解。 選擇 波長酶標(biāo)儀測定每孔光吸收值（屯）。以時間（）為橫坐標(biāo)， 光吸收值（。）為縱坐標(biāo)作圖繪制細(xì)胞生長曲線。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種于個孔板中，細(xì)胞接種密度約個，每孔加入肛細(xì)胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)幾天后進(jìn)入對數(shù)生長期，用于實(shí)驗(yàn)（用無葉酸 培養(yǎng)液在加藥前一天換液陽）。 每組均設(shè)個平行復(fù)孔以及個調(diào)零孔，加入對應(yīng)組的溶液 。兩塊培養(yǎng)板按同樣方法操作。分別培養(yǎng) 和