山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮cDNA文庫(kù)構(gòu)建和分析-論文網(wǎng)

1、山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮cDNA文庫(kù)構(gòu)建和分析-論文網(wǎng)論文摘要：為了研究山葡萄不同成熟期過(guò)程中的關(guān)鍵基因，以轉(zhuǎn)色期（50%著色）山葡萄果皮為材料，提取總RNA合成cDNA，連接到質(zhì)粒載體pDNR-LIB上，采用電穿孔法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5中，成功構(gòu)建了山葡萄果皮cDNA文庫(kù)。文庫(kù)質(zhì)量鑒定表明，原始文庫(kù)滴度為1.1210 pfumL ，擴(kuò)增后的文庫(kù)滴度為2.8210 pfumL ，重組率接近100%，插入片段大小范圍在0.52kb之間，平均約為0.8kb，表明應(yīng)用SMART 技術(shù)已成功構(gòu)建了山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮cDNA文庫(kù)。論文關(guān)鍵詞：山葡萄,文庫(kù),轉(zhuǎn)色期山葡萄（V.amurensisRupr）亦稱(chēng)東北葡

2、萄，分布于我國(guó)東北、華北以及俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)和朝鮮半島，是我國(guó)重要的野生果樹(shù)資源。山葡萄對(duì)嚴(yán)寒具有極強(qiáng)的抗性，并且漿果果香濃郁，風(fēng)味獨(dú)特，因而成為我國(guó)東北釀造葡萄酒的主要原料。山葡萄作為葡萄屬中最抗寒的一個(gè)種，是典型的非躍變型果實(shí)，其生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)表現(xiàn)為雙“S”曲線(xiàn)特點(diǎn)。根據(jù)果實(shí)在不同時(shí)期的生長(zhǎng)特點(diǎn)和生長(zhǎng)快慢，將漿果的生長(zhǎng)發(fā)育分為三個(gè)階段：第、期為快速生長(zhǎng)期，第期為緩慢生長(zhǎng)期，處于第期末和第期開(kāi)始之間的時(shí)期稱(chēng)作轉(zhuǎn)色期（Veraison）。轉(zhuǎn)色期是葡萄學(xué)家描述漿果成熟生長(zhǎng)和顏色改變的開(kāi)始，它是一個(gè)形態(tài)（大小、硬度、色澤）和內(nèi)部生理生化呈現(xiàn)劇烈變化的時(shí)期，其表現(xiàn)為生長(zhǎng)加速，漿果開(kāi)始軟化并伴隨著可溶性糖含量

3、的增加和有機(jī)酸含量的下降；表皮葉綠素發(fā)生降解并逐漸消失，紅色品種的花色素開(kāi)始積累，與香氣、味道有關(guān)的次生化合物也開(kāi)始生成。cDNA文庫(kù)是目前發(fā)現(xiàn)新基因和研究基因功能的基本工具，反映的是來(lái)源細(xì)胞當(dāng)時(shí)基因組表達(dá)出的基因序列信息。因而可以從cDNA文庫(kù)中篩選到目的基因，并直接用于該基因的表達(dá)。cDNA文庫(kù)在研究特定類(lèi)型細(xì)胞基因組的表達(dá)狀態(tài)以及表達(dá)基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢(shì)。從cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取克隆，從5或3端測(cè)序獲得150500bp的短序列稱(chēng)為表達(dá)序列標(biāo)簽（ExpressedSequenceTags,ESTs）。將獲得的EST序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較，獲得對(duì)基因組結(jié)構(gòu)、表達(dá)等認(rèn)識(shí)的基因

4、組研究策略被稱(chēng)為植物表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）計(jì)劃。EST反映的是基因的編碼部分，所以EST計(jì)劃可以直接獲得基因表達(dá)的信息。本文采用Clontech公司的cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒以pDNR-LIB為載體，構(gòu)建了山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮的cDNA文庫(kù)。從而提供了在分子生物學(xué)角度上研究山葡萄果實(shí)品質(zhì)形成、產(chǎn)量形成及采收期的選擇提供了理論的依據(jù)，為在分子水平上更深層次的研究相關(guān)成分的生物合成機(jī)理、抗病的分子機(jī)制及相關(guān)基因的克隆，篩選積累基礎(chǔ)材料。1材料與方法1.1材料山葡萄品種雙豐（V.amurensiscv.ShuangFeng）采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所國(guó)家山葡萄種質(zhì)資源圃。在果實(shí)轉(zhuǎn)色期（50%著色）采摘，

5、材料采后洗凈擦干，立即置于液氮中冷凍，于-80冰箱保存，取果皮作為供試材料。1.2試劑CreatorSMARTcDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒購(gòu)自Clontech公司；感受態(tài)細(xì)胞EscherichiacoliElectro-cellsDH5和DNAmarkerDL2000均購(gòu)自TaKaRa生物技術(shù)公司；RQ1RNase-FreeDNase購(gòu)自Promega公司；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?.3總RNA的提取山葡萄果皮總RNA提取采用改良的CTAB法，對(duì)提取出的總RNA進(jìn)行純化。具體步驟如下：將沉淀后的RNA用40lDEPC水溶解，分別加入5l10ReactionBuffer，5lDnase（8:1

6、:1），混合均勻，稍離心，37消化30min；加DEPC水至總體積300l，再加300l氯仿抽提一次，取上清加入3倍體積的無(wú)水乙醇，1/10體積的3molL的NaAc，-20沉淀30min；于4下以13000rmin離心30min，棄上清，沉淀用75%乙醇洗滌23次，真空或自然干燥，再用DEPC水溶解，置于-70下保存?zhèn)溆?。?.1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)RNA的純度和是否降解，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定含量。1.4cDNA文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)具體操作步驟參照CreatorSMARTcDNALibraryConstructionKit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取1L總RNA（約1g）用于合成cDNA第一鏈，取2L單鏈c

7、DNA做模板進(jìn)行長(zhǎng)距離PCR（LD-PCR）。反應(yīng)參數(shù)為：95中預(yù)變性1min；95變性15s，68延伸6min，共24個(gè)循環(huán)；至4時(shí)結(jié)束反應(yīng)。引物為：SMARTIVOligonucleotide：5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3；CDS/3PCRPrimer：5-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)NN-3；5PCRPrimer：5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3。取5LPCR產(chǎn)物在1.1%瓊脂糖凝膠電泳觀(guān)察雙鏈cDNA的分子量分布情況。取50L雙鏈cDNA，用蛋白酶K消化，再以SfiI酶切，然后用CHROMASPIN-400Column過(guò)柱