生物樣品前處理方法

1、置含有抗凝劑的試管中，25003000rpm離心510min，淡黃色上清液，約為全血的50-60% 藥物動力學，生物利用度，臨床治療藥物濃度監(jiān)測置試管中，于37或室溫放置30min1h，血液 凝固后，剝?nèi)ピ嚬鼙谏系难灒?5003000rpm離心510min，淡黃色液體，約為全血20-40% 血清的獲取量小，但血清成分更接近于組織液的化學成分，測定血清中有關(guān)物質(zhì)的含量，比全血更能反映機體的具體情況加入抗凝劑混合，防止凝血后影響測定 對于與紅細胞結(jié)合的藥物，以及血漿濃度低或藥物在血漿與紅細胞分配比不恒定的情況下應用一一. 生物樣品的種類生物樣品的種類一般采集時間尿（規(guī)定時間內(nèi)采集尿液體積和排入尿

2、中的藥物總量）藥物濃度高，但變化 體內(nèi)藥物清除 以原形、I相及II相代謝物等多種形式通過尿液排出排出 預測藥物代謝過程、類型,計算藥物尿清除率、生物利用度的研究。在漱口后15min，安靜狀態(tài)下采集口腔內(nèi)自然流出的唾液；也可在刺激下快速采樣，石蠟片，聚四氟乙烯塊，紗布球，檸檬酸，維生素C等置于舌尖，棄取初始部分后采集 血漿游離藥物濃度（P）密切相關(guān)，可使用唾液樣品CS/CP比值較恒定時，可代替血樣進行TDM及藥代動力學研究頭發(fā)組織：腦、心、肝、脾、肺、腎、胃等去除生物樣品中的大分子雜質(zhì)，滿足測定方法對分析樣品的要求保護儀器性能，改善分析條件分離并富集所要測定的成分 藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放測定

3、藥物的總濃度 二二.生物樣品處理的目的生物樣品處理的目的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)內(nèi)源性酸內(nèi)源性酸內(nèi)源性酸藥藥藥藥藥加入強酸 超濾法加入中性鹽 加熱法酶水解法 溶劑解法加入重金屬鹽 三三.前處理過程及方法前處理過程及方法1.1-溶劑解法溶劑解法原理原理：使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生：使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變變 化而使化而使蛋白質(zhì)凝聚蛋白質(zhì)凝聚 。 常用有機溶劑常用有機溶劑：乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃：乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃 試劑用量試劑用量：溶劑體積：溶劑體積與與血樣比為血樣比為1 13 3 1 1操作操作：有機溶劑與血漿或血清按一定比例混合：有機溶劑與血漿或血清按一定比例

4、混合后后 離心分離離心分離，取上清液作為樣品。注意，取上清液作為樣品。注意采用采用 超速離心超速離心 （12000rpm12000rpm）分離）分離1 12min2min1.2 加入中性鹽加入中性鹽原理原理：中性鹽使蛋白質(zhì)脫水而沉淀：中性鹽使蛋白質(zhì)脫水而沉淀 常用中性鹽常用中性鹽：飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸：飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽鹽 及及枸櫞酸鹽等枸櫞酸鹽等 試劑用量試劑用量：飽和飽和硫酸銨硫酸銨與與血清比例為血清比例為2 21 1 操作操作：血清與中性鹽按一定比例混合后超速離心：血清與中性鹽按一定比例混合后超速離心 （10000rpm10000rpm）分離）分離1 12min2

5、min，取上清液，取上清液作為樣品作為樣品。上清液上清液pH 7.0pH 7.07.77.7。1.3 加入強酸加入強酸原理原理：強酸與蛋白質(zhì)形成不溶性鹽而沉淀。：強酸與蛋白質(zhì)形成不溶性鹽而沉淀。 常用常用：1010三氯醋酸、三氯醋酸、6 6高氯酸、高氯酸、5 5偏磷酸等。偏磷酸等。 操作操作：血清與強酸的比例為：血清與強酸的比例為1 1：0.60.6混合，離心（混合，離心（10000rpm10000rpm）1 12min2min，即可。，即可。 上清液上清液 pH 0pH 04 4，不適于酸性下分解，不適于酸性下分解的藥物的藥物。過量酸的排除過量酸的排除：過量三氯醋酸可通過煮沸或乙醚：過量三氯

6、醋酸可通過煮沸或乙醚提取提取除除去；高氯酸、偏磷酸等可用碳酸鉀、醋酸鉀或氫氧化鈉去；高氯酸、偏磷酸等可用碳酸鉀、醋酸鉀或氫氧化鈉等中和后加乙醇使產(chǎn)生高氯酸鉀（鈉）沉淀被除去。等中和后加乙醇使產(chǎn)生高氯酸鉀（鈉）沉淀被除去。 1.4 酶水解法酶水解法測定一些測定一些酸不穩(wěn)定及蛋白結(jié)合牢酸不穩(wěn)定及蛋白結(jié)合牢的藥物的藥物枯草菌溶素枯草菌溶素：使組織溶解，使藥物析出。：使組織溶解，使藥物析出。 一種細菌性堿性蛋白分解酶，可在較寬的一種細菌性堿性蛋白分解酶，可在較寬的pHpH活圈活圈（PH7.0PH7.011.011.0）內(nèi)使蛋白質(zhì)的肽鍵降解，在）內(nèi)使蛋白質(zhì)的肽鍵降解，在50506060具具有最大活力。有

7、最大活力。 優(yōu)點優(yōu)點：可避兔某些藥物在酸及高溫下降解，對與蛋白質(zhì)：可避兔某些藥物在酸及高溫下降解，對與蛋白質(zhì)結(jié)合牢的藥物（如保泰松、苯妥英納），可顯著改善回結(jié)合牢的藥物（如保泰松、苯妥英納），可顯著改善回收率；可用有機溶劑直接提取酶解液而無乳化現(xiàn)象。收率；可用有機溶劑直接提取酶解液而無乳化現(xiàn)象。不適用不適用于在堿性下易水解的藥物于在堿性下易水解的藥物。1.5 超濾法超濾法性質(zhì)性質(zhì)：以：以多孔性半透膜多孔性半透膜（超濾膜）作為分（超濾膜）作為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)。離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)。 特點特點：無需加熱；無需添加化學試劑；無：無需加熱；無需添加化學試劑；無相變化；無破壞性；樣品量少；簡便

8、快捷相變化；無破壞性；樣品量少；簡便快捷，結(jié)果穩(wěn)定可靠，結(jié)果穩(wěn)定可靠 應用應用：游離藥物首選方法，尤其適合：游離藥物首選方法，尤其適合TDM TDM 操作操作：分子量截留值在：分子量截留值在5 5萬左右的超濾膜萬左右的超濾膜過濾可將分子量大的血漿蛋白以及結(jié)合了過濾可將分子量大的血漿蛋白以及結(jié)合了藥物的血漿蛋白分離。藥物的血漿蛋白分離。尿中和有些血中的藥物尿中和有些血中的藥物葡萄葡萄糖醛糖醛酸酸硫硫酸酸2、綴合物的水解、綴合物的水解由于由于綴合物較原型藥物具有較大的極性綴合物較原型藥物具有較大的極性，不易被有機溶劑，不易被有機溶劑提取，所以：提取，所以： 酸水解酸水解可加入適量的鹽酸液?？杉尤脒m

9、量的鹽酸液。 酶水解酶水解對于遇酸及受熱不穩(wěn)定的藥物，常用對于遇酸及受熱不穩(wěn)定的藥物，常用 葡萄糖醛酸苷酶葡萄糖醛酸苷酶、硫酸酯酶硫酸酯酶或兩者的混合酶或兩者的混合酶3.分離、純化和濃集分離、純化和濃集3-1. 3-1. 液液- -液萃取法液萃取法 LLELLE 乳化現(xiàn)象乳化現(xiàn)象：加固體：加固體NaClNaCl；離心；低溫冰箱中快速凍凝；離心；低溫冰箱中快速凍凝 對于對于極性大極性大的藥物：離子對提取法；提取烷基化法的藥物：離子對提取法；提取烷基化法有機溶劑 (1、2)生物樣品（水溶）(1)藥物內(nèi)源性雜質(zhì)溶解度、沸點低、無毒、與水不溶：乙酸乙酯、乙醚（1.2%水）堿性藥物于堿性；酸性藥物于酸性

10、。酸性；水溶性堿性；親脂性的3-2. 固相萃取法固相萃取法 SPE原理原理：不同填料作固定相的微型小柱，當含有藥物的生物樣：不同填料作固定相的微型小柱，當含有藥物的生物樣品溶液通過時，由于受到吸附、分配、離子交換或其它親和品溶液通過時，由于受到吸附、分配、離子交換或其它親和力作用，藥物或雜質(zhì)被保留在固定相上，用適當溶劑清洗雜力作用，藥物或雜質(zhì)被保留在固定相上，用適當溶劑清洗雜質(zhì)后，再用適當溶劑洗脫藥物。質(zhì)后，再用適當溶劑洗脫藥物。 親脂型親脂型大孔吸附樹脂，親脂型鍵和硅膠大孔吸附樹脂，親脂型鍵和硅膠規(guī)格規(guī)格 親水型親水型硅膠，硅藻土，棉纖維硅膠，硅藻土，棉纖維 離子交換型離子交換型3-2. 3

11、-2. 固相萃取法固相萃取法 SPESPE泵甲甲醇醇1.柱預處理2.進樣3.凈化4.洗脫水水樣品弱溶弱溶劑劑強溶強溶劑劑固相提取步驟示意圖：被測組分的濃集被測組分的濃集 真空蒸發(fā)或抽真空揮發(fā) 直接通入氣流使溶劑揮發(fā)抽真空氮氣或空氣分子中含有活潑氫者活潑氫者極性大檢測器不夠靈敏揮發(fā)性低對熱不穩(wěn)定增加藥物穩(wěn)定性改變藥物的極性和揮發(fā)性，改善被測組分的色譜行為提高對光學異構(gòu)體分離的能力 化學衍生化化學衍生化4.化學衍生化化學衍生化GC衍生化反應類型：衍生化反應類型： 烷基化烷基化；酰化酰化；硅烷化硅烷化 活潑氫被烷基、?；?、硅烷基取代光譜光譜GCGC、HPLCHPLC色色譜分析譜分析HPLC-化學衍生

12、化方法化學衍生化方法柱前衍生法柱后衍生法熒光衍生化反應電化學衍生化反應非手性衍生化反應HPLC-化學衍生化發(fā)生衍生化反應前后反應特征點擊添加標題紫外衍生化反應 先進的處理技術(shù)先進的處理技術(shù) 1. 固相微萃取固相微萃取 SPME基于待測物質(zhì)在樣基于待測物質(zhì)在樣品和萃取涂層中的品和萃取涂層中的平衡分配的過程。平衡分配的過程。相似相溶原理相似相溶原理材料：材料：聚二甲基硅氧烷聚二甲基硅氧烷聚丙烯酸酯聚丙烯酸酯SPME 與與GC 及及HPLC聯(lián)用聯(lián)用2. 柱切換技術(shù)柱切換技術(shù) 是一種在線的固相分離技術(shù)切換閥3. 微透析技術(shù)微透析技術(shù)MDMD是一種膜分離技術(shù)，利用膜透析原是一種膜分離技術(shù)，利用膜透析原理

13、，對細胞液進行流動性連續(xù)采樣，在理，對細胞液進行流動性連續(xù)采樣，在不破壞生物體內(nèi)環(huán)境的情況下，直接插不破壞生物體內(nèi)環(huán)境的情況下，直接插到生物活體內(nèi)采樣進行原位測定到生物活體內(nèi)采樣進行原位測定 將微透析探針植于需要取樣的部位將微透析探針植于需要取樣的部位，用與細胞間液非常接近的，用與細胞間液非常接近的生理溶液生理溶液以以慢速度灌注，由于膜內(nèi)外欲測組分的慢速度灌注，由于膜內(nèi)外欲測組分的濃濃度差度差而使得膜外的體內(nèi)欲測組分進入膜而使得膜外的體內(nèi)欲測組分進入膜內(nèi)，并被灌注液帶到體外，進入儀器進內(nèi)，并被灌注液帶到體外，進入儀器進行分析。行分析。生物樣品定量分析方法限度要求生物樣品定量分析方法限度要求生物

14、樣品定量分析方法限度要求生物樣品定量分析方法限度要求置含有抗凝劑的試管中，25003000rpm離心510min，淡黃色上清液，約為全血的50-60% 藥物動力學，生物利用度，臨床治療藥物濃度監(jiān)測置試管中，于37或室溫放置30min1h，血液 凝固后，剝?nèi)ピ嚬鼙谏系难灒?5003000rpm離心510min，淡黃色液體，約為全血20-40% 血清的獲取量小，但血清成分更接近于組織液的化學成分，測定血清中有關(guān)物質(zhì)的含量，比全血更能反映機體的具體情況加入抗凝劑混合，防止凝血后影響測定 對于與紅細胞結(jié)合的藥物，以及血漿濃度低或藥物在血漿與紅細胞分配比不恒定的情況下應用一一. 生物樣品的種類生物樣品

15、的種類去除生物樣品中的大分子雜質(zhì)，滿足測定方法對分析樣品的要求保護儀器性能，改善分析條件分離并富集所要測定的成分 藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放測定藥物的總濃度 二二.生物樣品處理的目的生物樣品處理的目的1.1-溶劑解法溶劑解法原理原理：使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生：使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變變 化而使化而使蛋白質(zhì)凝聚蛋白質(zhì)凝聚 。 常用有機溶劑常用有機溶劑：乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃：乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃 試劑用量試劑用量：溶劑體積：溶劑體積與與血樣比為血樣比為1 13 3 1 1操作操作：有機溶劑與血漿或血清按一定比例混合：有機溶劑與血漿或血清按一定比例混合后后 離心分離

16、離心分離，取上清液作為樣品。注意，取上清液作為樣品。注意采用采用 超速離心超速離心 （12000rpm12000rpm）分離）分離1 12min2min1.2 加入中性鹽加入中性鹽原理原理：中性鹽使蛋白質(zhì)脫水而沉淀：中性鹽使蛋白質(zhì)脫水而沉淀 常用中性鹽常用中性鹽：飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸：飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽鹽 及及枸櫞酸鹽等枸櫞酸鹽等 試劑用量試劑用量：飽和飽和硫酸銨硫酸銨與與血清比例為血清比例為2 21 1 操作操作：血清與中性鹽按一定比例混合后超速離心：血清與中性鹽按一定比例混合后超速離心 （10000rpm10000rpm）分離）分離1 12min2min，取上清液，取上清液作為樣品作為樣品。上清液上清液pH 7.0pH 7.07.77.7。被測組分的濃集被測組分的濃集 真空蒸發(fā)或抽真空揮發(fā) 直接通入氣流使溶劑揮發(fā)抽真空氮氣或空氣3. 微透析技術(shù)微透析技術(shù)MDMD是一種膜分離技術(shù)，利用膜透析原是一種膜分離技術(shù)，利用膜透析原理，對細胞液進行流動性