菌種傳代與復蘇

1、菌種傳代與復蘇菌種傳代與復蘇( 實操 )一、菌種傳代與復蘇1.1 菌種是從事微生物學及生命科學研究的根本材料，在醫(yī)學領域中， 診 斷制品的制備，菌苗的生產、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗及藥品 微生 物檢驗等都有一套完整的菌種、微生物具有生命活力，在傳代過程中易 發(fā)生變 異甚至死亡，因此菌種傳代與保藏是一項重要的根底工作。1.2 菌種代號國內藥品微生物檢驗所用的菌種代號是 CMCC(F 或) CMCC(B ，) CMCC- 中-國醫(yī) 學菌種保藏中心，B代表細菌，F(xiàn) 代表真菌。金黃色葡萄球菌 CMCC(B)26003 大腸桿菌 CMCC(B)44102 枯 草芽孢桿菌 CMCC(B)63501

2、 白色念珠菌 CMCC(F)98001 黑曲霉 CMCC(F)980031.3 傳代和接種1.3.1 菌種凍干粉復蘇1.3.1.1 把凍干菌種管、滅菌 1ml 滴管、雙碟、鑷子、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、 營 養(yǎng)瓊脂斜面數(shù)支，移入接種室或凈化臺。1.3.1.2 先用砂輪將凍干菌種安瓿瓶頸部挫出挫痕， 再將凍干菌種管外壁 用 75% 酒精擦洗消毒，稍干，用 75% 乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內，待干。 點燃 酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上燒灼紅熱，用滅菌滴管吸取營養(yǎng) 肉湯培 養(yǎng)基，滴在灼熱的菌種管封口一端，是驟冷而炸裂。1.3.1.3 取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口翻開，放入滅菌雙碟內， 領 取一只

3、滅菌滴管，在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干 菌攪 動促使溶解，隨即吸出管內菌液，分別接種至營養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯 內，并 將滴管及菌種管投入消毒液內，將已接種的營養(yǎng)肉湯及營養(yǎng)瓊脂斜面 進行培養(yǎng)。1.3.2 菌種斜面?zhèn)鞔僮?.3.2.1 培養(yǎng)基應新鮮制備，如斜面已無冷凝水者，不宜再使用。標簽 上 注明菌種名及菌種編號。至冰箱取出的菌種斜面，應在室溫放置約 30 分 鐘，待 溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺。1.3. 2.2 點燃酒精燈，用左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰旁，右手拿接種 棒后端，將接種環(huán)燒紅 30 秒，隨后將全部接種棒金屬局部在火焰上燒灼，往 返 通過 3 次。

4、左手將管口在火焰上旋轉燒灼，右手無名指，小指及掌部夾住棉 塞， 撥開棉塞，將接種環(huán)深入管內先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移 至菌苔 上，刮去少量菌苔，隨即取出接種環(huán)，并將菌種管口移至火焰旁。1.3. 2.3 堵上棉塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面一支，照上述操作打 開棉塞，將接種環(huán)深入管內至瓊脂斜面的底部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜 面的 外表曲折移動，使細菌劃在斜面的外表上。1.3. 2. 4 取出接種棒，在火焰旁將培養(yǎng)基管棉塞堵上，然后將接種過細菌的 接 種棒在火焰上燒灼滅菌。4 菌種的培養(yǎng)與保存大腸桿菌35? 37C培養(yǎng)48h ;金黃色葡萄球菌30? 35C培養(yǎng)48h ;枯 草芽

5、抱桿菌30? 35 C培養(yǎng)48h ;白色念珠菌23?28C培養(yǎng)7天；黑曲霉23? 28 C 培養(yǎng) 7 天。1.4.2 將培養(yǎng)物管自培養(yǎng)箱取出后放入冰箱 2? 8 C 保存，一般 2 個月 轉種一次。1 .5菌懸液的制備1.5.1 取上述培養(yǎng)好的菌種斜面移入接種室或凈化工作臺，放置室溫后，用接種環(huán)取菌苔少許接種至營養(yǎng)肉湯中 10ml/支，已滅菌，將已接種畢的細 菌管 置 35? 37C 培養(yǎng) 18? 24小時，取岀備用。一般于冰箱中保存可用兩周。取上述培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液濃菌液1ml,加到9mI 0.9%無菌 氯化鈉溶液混勻，為 10=再取另一只刻度吸管吸取菌液 1ml 加到 9mI0. 9%

6、 無菌氯化鈉 溶液中混勻，為IO2以此類推，稀釋至含活菌數(shù)在50? 100個。用平板計數(shù)。1.5.3 此稀釋菌液用于試驗后加陽性對照，可在一周內使用。1. 6 記錄1.6.1 傳代和接種使用后，應做好?菌種傳代接種記錄?。1.6.2 菌懸液制備后，應做好?菌液制備使用記錄?。二、依據(jù)：中國藥典2021年版二部及菌種使用說明書f 實操2.1 標準菌的來源 標準菌株由中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學菌種保藏中心 China Medicalculture collection ,CMCC 提供的冷凍枯燥菌種 0 代或由上級藥檢部門已 接 種好的菌種斜面 3 代。黑曲霉的 0 代菌種為保存于含 1 5%甘油

7、的 0.9% 無菌 氯化鈉溶液中的孢子懸液冷存管。中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學微生物 菌種保藏管理中心提供的冷凍枯燥菌種的標簽CMCCB 代表細菌bacteria,CMCC F代表真菌fungi 每種菌具有固定的代號。2.2 標準菌的驗收從菌種保藏中心購置的原始菌種管是玻璃安瓿裝的凍干菌，接收同時應檢 查是否有隨菌種附有的相關資料。接收菌種時應檢查安瓿的數(shù)量和名稱，和每 一支安瓿的完整性。在相應的菌種接收記錄上記上所有的關于菌種的信息，如 名稱、數(shù)量和接收日期等。在菌種安瓿及菌種管上粘貼標簽，內容包括：菌種 名稱、菌種代號、代次、接收日期、接收人、貯存條件、有效期至。新購入的 0代原始菌種儲存于

8、一20 C,有效期為三年。從上級藥檢部門購置的已接種好 的菌種斜面3代應檢查菌種管是否完好。儲存于 28 C,有效期為3個 月。2.3 標準菌的復蘇、復壯及標準儲藏菌株的制備2.3.1 物品及試劑：接種針、酒精燈、移液管、 75% 酒精及 75%酒精棉球2.3.2 培養(yǎng)基改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基 : 用于黑曲霉復蘇、 復壯 . 液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基 : 用 于生孢梭菌復蘇、復壯 . 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 : 用于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿 菌、大腸埃希菌、乙型 副傷寒沙門菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復蘇、 復壯。改良馬丁培養(yǎng)基 : 用于白色念珠菌復蘇、復壯 .2.3.3 操作步驟：a. 翻開潔凈工作臺。

9、b. 在安瓿的外外表用 75%的酒精擦拭并讓其自然風干。開啟安瓿時c. 用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線， 用手輕輕將安瓿掰開d. 以無菌方法用一無菌吸管從已準備好的上述液體培養(yǎng)基中移取0.50.8ml 到安瓿中。e. 輕輕地旋轉安瓿以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解。f. 用無菌吸管將安瓿內菌液全部轉接到相應的液體培養(yǎng)基。g. 根據(jù)安瓿上所標明的不同菌種類型而將其培養(yǎng)于相應的溫度細菌培養(yǎng) 溫度3035C，培養(yǎng)1824h ;真菌培養(yǎng)溫度2328C,培養(yǎng)35天。 觀察是 否渾濁，渾濁說明菌種復蘇生長；假設不渾濁，細菌應延長培養(yǎng)時間至 7 天，真 菌應延長培養(yǎng)時間至 14 天，假設仍未渾濁，

10、滅菌處理。h. 黑曲霉的菌懸液先室溫待菌懸液融化后用無菌吸管吸取管內液體12 滴滴在改良馬丁瓊脂斜面上，用吸管涂布均勻，置2328 C培養(yǎng)57天，斜面正 面為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不應有雜色，斜面?zhèn)让鏌o色，接近菌層 培養(yǎng)基 略帶黃色。確認后用含有 0.05% ml/ml 的吐溫 -80 的 0.9%無菌氯 化鈉溶液洗 脫到無菌試管中。i. 取經復蘇后的上述細菌菌液 810ml 至液體培養(yǎng)基中按 g 項操作對菌 種 進行復壯。以無菌技術向復壯后的菌種中參加 100ml20% 的無菌甘油混勻， 12ml/ 管分裝于凍存管。每個菌種制備 10支，按順序進行編號，最后一支做為 質 控管進行質量控制，

11、即進行相應確實認。其余作為儲藏管。黑曲霉的 h 項 下洗脫液按h項下方法進行復壯，制成復壯后的孢子懸液20ml。以無菌技術向復壯 后的菌種中參加 20ml 、30%的無菌甘油混勻，1 2ml/ 管封存于凍存管。制備 10 支，按順序進行編號，最后一支做為質控管進行質量控制， 即進行相應確實 認。其余作為儲藏管。 將上述制備好的凍存管逐支粘貼標簽。 內容包括：菌種 名稱、菌種代號、編號、代次、制備日期、制備人、貯存條 件、有效期至等。j .儲藏菌種管制備成功，儲存于一20 C,有效期為三年。2.3.4 菌種確認 用無菌接種環(huán)從質控管中取細菌培養(yǎng)物接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，或 相應的宜于該細菌生

12、長的鑒別平板上，劃線別離出單個菌 落。然后在3035 C下培養(yǎng)23天；同樣的方法取真菌到玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板，并在2328 C下培養(yǎng)7天；培養(yǎng)后，觀察其菌落形態(tài)，應符合該菌種形態(tài)特征。2.3.5 污染處理假設在該平板上發(fā)現(xiàn)有其他菌落生長，那么說明或操作有污染或菌種不純。 將此被 污染了的培養(yǎng)物滅菌處理。 可尋找原因重新別離挑選純菌落轉接斜面菌 種作為第四代。 并重新制備儲藏菌種管2.3.6 菌種的傳代與保藏 將菌種接種至一新鮮培養(yǎng)基上， 每萌發(fā)一次即稱為一代， 因此，當原始菌 種復溶并轉至新培養(yǎng)基內生長，即認為已傳代一次，從菌種保藏中心 獲得的冷 凍枯燥的菌種為第 0 代，冷凍枯燥的原始菌種

13、開啟后轉種后為第1 代，直到第 3 代為工作菌種。菌種的傳代次數(shù)自原始菌種凍干粉起不得超過 5 代。菌種的傳代保藏過程：2.3.3 項下標準菌的復蘇為傳第一代，復壯為第二代。 傳第三代時取 1 支 凍存 管自然解凍，將其轉接斜面菌種作為工作用菌種。此時，工作用菌種為第 3 代。工作 用菌種，分為兩類：一類用于定期傳代W3 ，一類用于實驗用 S3。定期傳代用菌的傳代其操作步驟如下斜面接種法 ：1從冰箱冷藏室中取出菌種斜面后，應在室溫放置約 30 分鐘。2將裝有新鮮配制的培養(yǎng)基菌種保藏管管壁上注明菌名及接種日期，和 傳代 菌種一并移入潔凈工作臺，翻開紫外燈照射1h。3關閉紫外燈。 點燃酒精燈， 左

14、手握住菌種斜面，將管口靠近火焰上方， 右 手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅約 30 秒，隨后將接種棒金屬局部在火焰上燒 灼，往 返通過三次。4右手用無名指、 小指及掌部夾住管塞， 左手將管口在火焰上旋轉燒灼， 右 手再輕輕拔開管塞，將接種環(huán)伸入管內先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，隨即取出接種棒并將菌種管口移至火焰上方。5塞上管塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面或改良馬丁瓊脂斜 面 一支，照上述操作翻開管塞，將接種環(huán)伸入管內至瓊脂斜面的底部向上劃一條直線，然后從底部向上作連續(xù)曲線劃線，一直劃到斜面頂端，使細菌接種 在斜面的外表上。6取出接種環(huán)，在火焰上方將培養(yǎng)基管蓋上塞

15、子，然后將接種過細菌的 接種 環(huán)在火焰上燒灼滅菌。7將已接種好的細菌管置 3035 C細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)2224h，真菌管置2328 C真菌培養(yǎng)箱最多培養(yǎng) 7天。當工作用菌種傳代代數(shù)小于 5時，可直接用上一代工作用菌種轉接下一代 工作用菌 種，如：(W3)可直接轉接為(W4)。按上述程序操作，直至(W4)轉為(W5) 為止，需重新接種，舊的工作菌種進行銷毀。菌種培養(yǎng)條件及時間培養(yǎng)基保存條件及 時間大腸埃布菌(CMCC(B)44102)30 35 C22 24h營養(yǎng)瓊脂 培養(yǎng)基旨2 C8 C 保存3個月金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003)30 35 C22 24h營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基旨2 C8 C

16、保存3個月枯草芽抱桿菌(CMCC(B)63501)O30 35 C22 24h營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基旨2 C8 C 保存3個月銅綠假單胞菌(CMCC(B)10104)O30 35 C22 24h營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基旨2 C8 C 保存3個月乙型副傷寒沙門 菌(CMCC (B) 50094)30 35 C22 24h營養(yǎng)瓊脂 培養(yǎng)基2 C8 C 保存3個月生抱梭菌(CMCC(B)64941)O30 35 C22 24h營養(yǎng)瓊脂 培養(yǎng)基旨2 C8 C 保存3個月VV/白色念珠菌(CMCC(F)98001)23 28 C最多7天改良馬丁瓊 脂培養(yǎng)基2 C8 C 保存3個月黑曲霉(CMCC(F)98003)23 28 C最多7天改良馬丁瓊 脂培養(yǎng)基2 C 保存