病原菌的分離培養(yǎng)和純化

1、普通植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)十七、病原菌得分離培養(yǎng)與純化一、目得要求(1) 了解分離與純化微生物得基本原理及方法。(2) 掌握倒平板得方法與組織分離、稀釋分離、平板劃線分離得基本操作技術(shù)。(3) 掌握在平板、斜面及液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)病原菌及觀察其培養(yǎng)性狀得方法。二、基本原理植物病原菌得分離培養(yǎng),就是植物病理實(shí)驗(yàn)室工作中得基本技能。為了獲得某 微生物得純培養(yǎng)，一般就是根據(jù)該微生物對(duì)營養(yǎng)、酸堿度、氧氣等條件要求不同，而供給它 們適宜得生活條件，即讓病原菌生活在適宜得培養(yǎng)基上，或加入某種抑制劑造成只利于此菌 生長，而抑制其她菌生長得環(huán)境.從而得到純菌株。植物病原頁菌得分離方法主要有組織分離 法與稀釋分離法兩種。

2、最常用得方法就是組織分離法，而稀釋分離法主要用于病組織上產(chǎn)生 大量砲子得病原真菌得分離。病原細(xì)菌得分離方法以劃線分離法為最常用，在有些情況下也 采用稀釋分離法。為了獲得分離菌得純培養(yǎng)，必須要進(jìn)行分離菌得純化，純化得方法類似于分 離工作中采用得稀釋分離法或劃線分離法。三、材料、儀器與用具1材料(依當(dāng)?shù)厍闆r進(jìn)行選擇，下列材料供參考)(1) 稻瘟病葉、病節(jié)、病穗頸(pyric u 1 a r ia orycae)。(2) 玉米大斑病葉(exserohilum t urcicum)0玉米彎抱菌葉斑病葉(c u r v u lar i a 1 u n ata)。(4 )玉米小斑病葉(bipo 1 ari

3、s may dis)。(5)番茄灰霉病果(botryt i s cinefc a )。(6 )黃瓜菌核病果(sclerotinia s c I erotio r um)(7)黃瓜細(xì)菌性角斑病葉(pscu d omo n as syringa e p v .lac h r y mans)。(8)水稻白葉枯病葉(xant h o mo n as canipc s tmspv、o r y eue)o（10）白菜軟腐病葉（e r u dnia c a r otovo ra su b sp.c a rotovora）2 .培養(yǎng)基pda培養(yǎng)基;肉膏蛋白陳培養(yǎng)基;加寄主組織煎汁得培養(yǎng)基等。3. 儀器與用品超

4、鏡工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、吸管、吸水紙、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、 銀子、接種鏟（針）、接種環(huán)（銀）、70%灑精、0.1 %升汞、灑精燈、火柴、記號(hào)筆、橡皮筋 套、可調(diào)式電爐、鋁鍋等。0升汞溶液配制:升汞1 e濃鹽酸2. 5 ml蒸館水1000m 1 o 先將升汞溶于鹽酸中，待充分溶解后，再加水稀釋。升汞就是劇毒藥物，在操作時(shí)應(yīng)特別小心。四、實(shí)驗(yàn)操作（一）病原真菌得分離1組織分禽法按照以下步驟進(jìn)行：（1）取火菌培養(yǎng)皿一個(gè),宜于濕紗布上，在皿蓋上用玻璃鉛筆注明分離日期、材料與分離人得 姓名。提示:為了保證無菌操作，應(yīng)注意下而幾點(diǎn)：工作前最好將所需得物品都放在超凈工作 臺(tái)內(nèi)，工作中臨時(shí)去取容易帶來

5、雜菌;保證工作人員自身得潔凈,工作前用肥皂洗手；無菌操 作前還要用7 0%酒精擦拭雙手;工作中，特別在使用無菌操作間時(shí)，呼吸要輕，不要說話。用無菌操作法向培養(yǎng)皿中加入25%乳酸1-2滴（可減少細(xì)菌污染），然后將融化而冷至6 0 c左右得pda培養(yǎng)基倒人培養(yǎng)皿中，每皿倒1015m 1，輕輕搖動(dòng)使之成平面。凝固后即成 平板培養(yǎng)基。提示:加入25%乳酸12滴,可基本保證平板上不出現(xiàn)污染細(xì)菌苗落。除乳酸 外，在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)每咕匾种萍?xì)菌得生長，也就是常用得方法。加青霉素（20 u g/ml） 可以抑制g+細(xì)菌生長：加多黏霉素b（5.0 ug/ml）可以抑制g細(xì)菌生長;加鏈霉素（40 u g/ml

6、）或氯霉素（50ug/ml河以抑制大部分細(xì)菌得生長。除了氯篷素可在火菌前加入外, 其她抗菌素都應(yīng)在火菌后并冷卻到45c左右（以手背觸三角瓶感到燙,但尚可以忍耐為宜）時(shí) 加入。倒平板過程中只要遵循“穩(wěn)、輕、快”要領(lǐng)，不必在火焰上方，一般很少污染。（3）取真菌葉斑病得新鮮病葉（或其她分離材料），選擇典型得單個(gè)病斑，用剪刀或解剖刀從 病斑邊緣（病健交界處）切取小塊（海邊長3-4mm）病組織數(shù)塊。提示:選擇新想病得組織作為 分離得材料，可以減少腐生菌混入得機(jī)會(huì)。腐生菌一般在發(fā)病很久而已經(jīng)枯死或腐敗得部分 滋生,因此，一般斑點(diǎn)病害應(yīng)在臨近健全組織得部分分離。(4) 將病組織放人70%灑精中浸35 s后,

7、按無菌操作法將病組織移人0升汞液中分別 表面消毒0.5、1、2、3、5r a in(也可使用其她表而消毒劑)，如植物組織柔嫩,則表而消毒時(shí) 間宜短;反之則可長些。然后放入火菌水中連續(xù)漂洗三次，除去殘留得消毒劑。提示：先用70% 得灑精浸2、3s就是為了消除寄主表面得氣泡,減少表而張力,70%得酒精亦用于表而消毒，處 理得時(shí)間較短(一般數(shù)秒至lmin)。升汞溶液消毒得時(shí)間因材料而異，可自30s至30min不等, 一般情況下，需時(shí)間3, 5mine(5) 用無菌操作法將病組織移至平板培養(yǎng)基上，每皿內(nèi)放4 - 6塊。提示:在將病組織小塊移放 到平板表面之前，應(yīng)將其在無菌吸水紙上吸去多余得水,以大大減

8、少病組織附近出現(xiàn)細(xì)菌污 染。(6) 將培養(yǎng)皿倒巻放人2512左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。一般3-4d后觀察待分離菌生長結(jié)果。(7) 若病組織小塊上均長岀較為一致得菌落,則多半為要分離得病原菌。在無菌條件下，用 接種針(鏟)自菌落邊緣挑取小塊移入斜面培養(yǎng)基上，在25C左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，數(shù)日后,觀察菌 落生長情況,如無雜菌生長，即得該分離病菌純菌種，便可置于冰箱中保存。提示:除根據(jù)菌落 得一致性初步確左長出得菌落就是否目標(biāo)菌外，還要在顯微鏡下檢査,進(jìn)一步確左。如果就是 對(duì)未知病原菌得組織分離，則要將長岀得蕾落分別轉(zhuǎn)出，通過進(jìn)一步得接種實(shí)驗(yàn)明確哪一種 為英病原菌。在組織分離工作中，如果植物材料體積較大且較軟(

9、如患灰霉病得番茄果實(shí))，在 分離過程中可直接挖取內(nèi)部患病組織移人平板培養(yǎng)基上，完成分離工作。2. 稀釋分離法(1) 取火菌培養(yǎng)皿三個(gè)，平放在濕紗布上，編號(hào),并注明日期、分離材料及分離人姓統(tǒng)。(2) 用火菌吸管吸取火菌水,在每一皿中分別注入0. 51.0ml(3) 用移植環(huán)薛一滴泡子懸浮液，與第一個(gè)培養(yǎng)皿中得火菌水混合，再從第一個(gè)培養(yǎng)皿移三環(huán) 到第二個(gè)培養(yǎng)皿中，混合后再移三環(huán)到第三個(gè)培養(yǎng)皿中。(4) 將熔化開冷卻到4550c得培養(yǎng)基，分別倒在三個(gè)培養(yǎng)皿中(為防止細(xì)菌污染，也可以向 每個(gè)培養(yǎng)皿中事先加入1-2滴25%乳酸)，搖勻，凝固，要使培養(yǎng)基與稀釋得菌液充分混勻。提 示:倒平板時(shí)得培養(yǎng)基溫度一

10、立要掌握好，過熱易將病原菌燙死而使分離失敗,過冷則倒入培 養(yǎng)皿中后難以形成平板，而成為起伏不平得表而,不利于分離。為大體估計(jì)培養(yǎng)基溫度,可將盛 培養(yǎng)基得器皿靠在人手背上，如果手背感到燙但尚可以忍耐，則大體為4 55 Os（5）將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)后置恒溫箱（251 3 ）中培養(yǎng)，數(shù)日后觀察菌落生長情況。（6）挑菌。將培 養(yǎng)后長岀較為整齊一致得單個(gè)菌落分別挑取,接種到斜而培養(yǎng)基上，置25C左右培養(yǎng)。待菌長 出后，檢查菌就是否單純，若有其她菌混雜，就要再一次進(jìn)行分離純化,直到獲得純株培養(yǎng)。（二）病原細(xì)菌得分離病原細(xì)菌得分離方法以稀釋分離法與劃線分離法為最常用。在進(jìn)行分離 之前,首先應(yīng)對(duì)病組織材料進(jìn)行細(xì)菌學(xué)

11、初步診斷，即經(jīng)過鏡檢確認(rèn)有噴菌現(xiàn)象以后，才對(duì)該病 組織作分離工作。稀釋分離法就是最經(jīng)典得標(biāo)準(zhǔn)分離法,方法同上述貞菌分離。除去上述稀 釋分離法以外，較為方便得就是劃線分離法：（1）預(yù)先把熔化好得肉膏蛋白腺培養(yǎng)基倒在培養(yǎng)皿中，凝成平板后.翻轉(zhuǎn)放在30c恒溫箱中24h,使表面無水滴凝結(jié)。也可凝成平板后直接使用。（2）將病組織先用0.1%升汞表而消毒0.52min,再用無菌水換洗3次后，放在火菌培養(yǎng)皿 中得火菌水中，用火菌玻棒研碎，并讓組織碎塊在水中浸泡2060m in,讓細(xì)菌釋放到火 菌水中。（3）用火菌得接種組（接種環(huán)）蘸取浸泡液在F燥得培養(yǎng)基平板表而劃線，盡量不要把平板表 而劃破。劃過第一批線后

12、得接種環(huán)應(yīng)放在火焰上燒灼.冷卻后直接在第一批劃線得末端向另 一方向劃線?；鹁笤賱澋谌尉€。提示：劃過第一批線后接種弭放在火焰上燒過這一步驟 非常重要，這樣做可以使第一批線與第二批線上得細(xì)菌數(shù)量相差很大。（4）用玻璃鉛筆在培養(yǎng)皿上寫上分離材料、日期與分離者姓名后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，放在2628c 恒溫箱中培養(yǎng)。1 3d后觀察有無細(xì)菌生長，在哪些地方有單菌落生長出來?其中得優(yōu)勢單菌 落應(yīng)為待分離菌形成得。（5）仔細(xì)挑取病原菌得單菌落，并移植到斜而培養(yǎng)基上。同時(shí)，再把單菌落用火菌水稀釋成懸浮 液作第二次劃線分離，經(jīng)培養(yǎng)后出現(xiàn)得菌落在形態(tài)特征都趨于一致，并與典型描述得特征相一 致時(shí)，即表明已獲得純培養(yǎng)。最

13、好要經(jīng)過連續(xù)三次單菌落得分離，才能確保純化。（三）真菌、細(xì)菌培養(yǎng)性狀觀察1. 真菌培養(yǎng)性狀觀察取已分離、純化得某種真菌菌種，按前述稀釋分離法中（1）-（5 ）步 驟進(jìn)行，待某培養(yǎng)皿中形成單個(gè)菌落后觀察。記載以下內(nèi)容:菌落顏色、菌叢密集及繁茂程度、 就是否有色素分泌出來而滲透到培養(yǎng)基中、菌落生長速度快慢等。同時(shí)要記載培養(yǎng)基種類（成 分及ph）與培養(yǎng)溫度、光照條件。2. 細(xì)菌培養(yǎng)性狀觀察（1）仿照上述真菌菌落形成步驟，觀察記載以下內(nèi)容:菌落顏色、菌落邊緣形狀、菌落表而就是 光亮還就是粗糙或有皺折、菌落隆起情況、就是否有色素分泌到培養(yǎng)基中，菌落生長速度快 慢,就是否有特殊氣味形成等。同時(shí)要記載培養(yǎng)基

14、種類（成分及ph）與培養(yǎng)溫度、光照條件。（2）用接種銀（環(huán)）蘸細(xì)菌菌種后，通過無菌操作在肉膏蛋白腺等斜而培養(yǎng)基表面從下向上劃一 直線，過23d后長出得細(xì)菌群體稱為菌苔，可仿照觀察記載細(xì)菌菌落得記載內(nèi)容，記載菌苔顏 色、邊緣形狀、表面就是光亮還就是粗糙有皺折、隆起情況、就杲否有色素分泌到培養(yǎng)基中, 就是否有特殊氣味生成，生長速度快慢等。也要記載培養(yǎng)基種類（成分及ph）與培養(yǎng)溫度、光 照條件。（3）用接種銀（環(huán)）蘸取細(xì)菌菌種后，通過無菌操作，將其接種在某種液體培養(yǎng)基中，數(shù)日后觀察 記載培養(yǎng)基中就是否變混濁、就是否有色素、氣體、沉淀生成，培養(yǎng)液表而就是否可生成菌 膜等。也要記載培養(yǎng)基種類（成分及ph

15、）與培養(yǎng)溫度、光照條件。五、所需時(shí)間流程1 .病原真菌分離組織分離：切取病組織，表而消毒，無菌水洗移人平板：lh稀釋分離:配總 子懸液，倒平板i 1培養(yǎng)7-1 0 d分離菌移人斜面30min培養(yǎng)7 - 1 0 d檢査斜面上分離菌產(chǎn) 抱30 m in保存菌種2. 病原細(xì)菌分離劃線分離:倒平板沾菌懸液劃線,lh。稀釋分離3. 病原真菌、細(xì)菌菌落培養(yǎng)性狀觀察平板上形成單菌落-3d觀察迦些寫報(bào)告4. 病原細(xì)菌菌苔培養(yǎng)性狀觀察 斜面上形成菌苔i-3d觀察30min寫報(bào)告5. 病原細(xì)菌液體培養(yǎng)性狀觀察接菌于液體培養(yǎng)基30m i n培養(yǎng)2-3d觀察3 0 min寫報(bào)告六、實(shí)驗(yàn)作業(yè)1、上交分離得病原真菌、細(xì)菌

16、菌種。2. 寫出病原真菌、細(xì)菌培養(yǎng)性狀觀察得實(shí)驗(yàn)報(bào)告。七、思考題1. 如果要分離得病原真菌就是鞭毛菌中得腐蘇菌、疫鑫菌等應(yīng)當(dāng)如何進(jìn)行才會(huì)獲得更好得效果？2. 在分離病原真菌時(shí)，向平板培養(yǎng)基中加人乳酸為什么會(huì)大大減少細(xì)菌得污染？3. 如果要從上壤中分離某種病原菌，應(yīng)當(dāng)采取什么樣得分離方法會(huì)更有效？4. 觀察記載貞菌及細(xì)菌得培養(yǎng)性狀有何意義？ 5.怎樣才能知道您獲得得病原貞菌、細(xì)菌得 菌種就是否就是純培養(yǎng)？附1常用得幾種典型得病原菌分離方法1. 斑點(diǎn)病原菌得分離。從病斑部分切取每邊35mm得小塊組織，在70%灑精中浸數(shù)秒鐘 后，移人0得升汞水溶液中處理3-5 r ain,以火菌水沖洗3次，移宜培養(yǎng)皿得培養(yǎng)基中，然 后培養(yǎng)。2. 維管朿組織內(nèi)病原菌得分離。從根莖維管朿組織分離病菌，可先將寄主病部表而用70%灑 精擦拭消毒，將表皮組織用火菌得解剖刀削去，然后切取其中小塊變色得維管朿組織，用升汞 或漂白粉液消毒后，用火菌水沖洗幾次，移宜培養(yǎng)基面上。3. 根腐病病原菌得分離。根腐或基腐病得分離,由材料得大小決左。材料小得可仿照斑點(diǎn)病 得分離法,材料大得則可以用維管束組織內(nèi)病原得分離法。4. 肉質(zhì)組織中病原菌得分禽。多肉得根、