植物基因工程

1、第六章植物基因工程課程基因工程原理與技術班級生物科學05生物技術05教師詹亞光 范桂枝學期第二學期課時6學時上課日期課的類型理論授課章節(jié)第六章植物基因工程（1）植物基因轉化受體系統(tǒng)的條件（2）植物基因轉化受體系統(tǒng)的類型和特性。（3）植物基因工程載體的種類和特性（4） 根癌農桿菌Ti質粒的結構與功能：T-DNA、Vir區(qū)操縱子的基因結構與功能。（5）農桿菌Ti質?；蜣D化機理（6）農桿菌Ti質粒的改造及載體構建（7）載體構建中常用的選擇標記及報告基因（8）根癌農桿菌的轉化程序及操作原理（9）外源基因在植物中的表達教學目的 和要求了解植物基因轉化受體系統(tǒng)的類型、特性掌握Ti質粒的結構與功能，植物載

2、體構建原理，植物基因工程常用的載體類型。重點根癌農桿菌Ti質粒介導的基因轉化的原理和方法難點植物載體構建原理教材分析關鍵點轉基因植物的獲取和檢測主要教具 和設備材 料投影儀、電腦、常規(guī)教學設備教法:板書與多媒體授課相結合思考題1.植物基因工程載體種類？2.根癌農桿菌轉化程序？心得在自然界的許多雙子葉植物中，常常發(fā)生一種嚴重危害植物生長的病害一一冠癭。已知90多科，600多種雙子葉植物都能感染這種病。一般認為單子葉植物和裸子植物對此病不敏 感。70年代中期，世界上幾個實驗室發(fā)現(xiàn)誘發(fā)腫瘤的根癌農桿菌中含有大量的誘瘤質粒Ti（tumor-inducing plasmid）,且證實了腫瘤的形成正是由于

3、pTi中的特定片段 -T-DNA轉移并穩(wěn)定地整合進植物細胞核基因組中的結果；由于其上載著的冠癭堿合成基因和激素合成基 因表達，因此分泌冠癭堿并形成腫瘤。人們就把這種冠癭的形成過程稱作天然的植物細胞轉化系統(tǒng)。農桿菌將自身的 DNA 插入植物細胞誘發(fā)腫瘤只對其本身是有益的，重要原因之一是因 為農桿菌誘發(fā)植物細胞合成冠癭堿為自己提供食物。 植物自身不能利用這種物質， 只能為它 的合成付出代價， 別的細菌也不能利用它， 在自然條件下， 只有農桿菌能分泌分解冠癭堿的 酶，將這些特異產物作為唯一的碳源和氮源來利用。腫瘤的產生是由于 T-DNA 上的激素合成基因所致，刺激細胞生長而產生腫瘤，這是 T-DNA

4、 轉入的一個副產品。Ti質粒給自己設計出一套為其自身存活的非常優(yōu)秀的進化格局：它感染植物細胞，使 之出現(xiàn)愈傷組織增生，后者便產生出供帶有Ti質粒的細菌用作能源、碳源和氮源的冠癭堿；而冠癭堿的產生又可激發(fā) Ti質粒轉移到原先沒有存在這種質粒的土壤農桿菌中去，如此周而復始得到不斷發(fā)展。Ti質粒是一類理想的植物基因工程載體，通過它們可以將外源DNA轉移到植物細胞，并再生出能夠表達外源基因的轉基因植物。Ti質粒還具有若干其他載體所不具備的優(yōu)點：（1）T-DNA能夠進行高頻的轉移，而且這種轉移的DNA通常是以未發(fā)生變化的完整形式整合到植物的核基因組上。（2）Ti質粒不存在包裝限制問題，大到50kb的外源

5、DNA也能順利地包裝與轉移。一、 植物基因工程載體種類據載體的功能和構建過程，可把有關載體分為四大類型（九種載體）?？寺≥d體、中間載體、卸甲載體、轉化載體據載體的功能和構建過程，可把有關載體分為四大類型，九種載體。1、 克隆載體（目的基因的克隆載體）通常由多拷貝的 E.coli 小質粒為載體功能：保存和克隆目的基因。2、 中間載體又分為中間克隆載體和中間表達載體。 中間克隆載體：由大腸桿菌質粒插入 T-DNA 片段及目的基因、標記基因等構建而成。功能：構建中間表達載體的基礎。 分為：中間粘粒載體、質粒粘粒愈合載體、基因標記載體。中間表達載體：含有植物特異啟動子的中間載體 功能：作為構建轉化載體

6、的質粒。3、 卸甲載體解除武裝的 Ti 質?；?Ri 質粒。（ onc+ - onc-）功能：作為轉化載體的受體質粒4、 轉化載體最后用于目的基因導入植物細胞的載體，亦稱工程載體。 它是由中間表達載體和卸甲載體構建而成。 分為一元載體系統(tǒng) （順式載體） 和雙元轉化載體系統(tǒng) （反式載體） 。一元載體系統(tǒng)包括共整合載體和拼接末端載體（ SEV）。二、 根癌農桿菌Ti質粒1、Ti 質粒的類型、結構與功能（ 1 ）類型Ti質粒是根癌農桿菌染色體以外的遺傳物質，為雙股共價閉合的環(huán)狀DNA分子，分子量為95156 x 106D，約150 200 Kb長。根據其誘導的冠癭堿種類不同，Ti質?？煞譃槿悾赫卖~

7、堿型( octopine)：pTiAch5, pTiA6NC, pTiB653, pTiAg162胭脂堿型( nopaline )： pTiT37, pTiT38, pTiC58農桿堿型(agrop ine) 和農桿堿素型( agroci nopine) 或琥珀堿型( succ in amop ine)( 2)結構和功能各種 Ti 質粒都可分為四個區(qū)：T-DNA區(qū)(tran sferred-DNA regio ns ):是農桿菌侵染植物細胞時，從Ti質粒上切割下來轉移到植物細胞的一段 DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關。Vir區(qū)(Virulenee region ):該區(qū)段上的基因能

8、激活 T-DNA轉移，使農桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒性區(qū)。T-DNA區(qū)與vir區(qū)在質粒上彼此相鄰，合起來約占Ti質粒DNA的1/3。Con區(qū)(region of replication):質粒結合轉移位點編碼區(qū)，該區(qū)段上存在著與細菌間接合轉移的有關基因(tra)，調控Ti質粒在農桿菌之間的轉移。冠癭堿能激活tra基因，誘導Ti質粒轉移，因此，稱之為接合轉移編碼區(qū)。Ori區(qū)(origin of replication ):該區(qū)段基因調控Ti質粒的自我復制，稱之為復制起始區(qū)。3種成分與Ti質粒腫瘤誘導有關：T-DNA ：它可轉移至宿主細胞，是一種可移動因子。毒性區(qū)：vir基因可產生轉移活動蛋白，對

9、增強植物細胞的轉化是必須的。土壤農癌桿菌染色體基因 ：間接參與轉化， 負責將細菌細胞接合于植物上。2、T-DNA 的基因結構和功能(1 ) T-DNA 的結構特點長約 23Kb在T-DNA的5和3端都有真核表達信號， 如TATAbox，AATAAbox及polyA等。T-DNA的兩端左右邊界各為25bp的重復序列，即邊界序列，分別稱之為左邊界(BL或TL)和右邊界(BR或TR )。該25bp邊界序列屬保守序列(TGACACGATATATTGGCGGGTAAAC )。通常右邊界序列更為保守，左邊界在某些情況下有所變化。左邊界 的缺失突變仍能致瘤，但右邊界缺失則不致瘤，這時幾乎完全沒有T-DNA

10、的轉移，這說明右邊界在 T-DNA 的轉移中的重要性。胭脂堿型腫瘤，為一連續(xù)的一段序列，長約23.4Kb，有腫瘤系，僅一個拷貝，有的T-DNA是多拷貝的。章魚堿型腫瘤：T-DNA分左右兩部分(TL-DNA和TR-DNA )，各自帶有左右邊界序列。左 區(qū)的順序變化不大，長度約13Kb，通常一個拷貝，但也有幾個拷貝首尾相連排列。含章魚堿合成酶基因和致瘤基因。TR-DNA較短，長約6-7Kb，拷貝數達數個 或數十個，有的腫瘤系中沒有 TR-DNA 。 TR-DNA 編碼 5個基因，如甘露堿和冠癭堿合成酶基因。(2)T-DNA 上的編碼基因及功能章魚堿型和胭脂堿型 T-DNA 的轉錄有下述共同特點:在

11、植物受傷組織分泌的信號分10倍，也具誘導表達特性。T-DNA 的兩條鏈都是有意義鏈；T-DNA 上每個基因都有各自的啟動子；基因的轉錄由植物細胞 RNA聚合酶II完成；T-DNA具典型的真核生物 RNA合成起始和終止的調節(jié)信號，在其 5端轉錄起始處有TATA 和CAAT盒。另外，至少在5個T-DNA基因中發(fā)現(xiàn)有一個8bp的相同順序（TTTCAA GA）， 同時 AATAAA 加尾信號也在同一條鏈上發(fā)現(xiàn)。植物或農桿菌中可能有甲基化或去甲基化的調節(jié)基因活性。3、Vir區(qū)操縱子的基因結構與功能毒性區(qū)的大多數基因產物都控制T-DNA的轉移，這個區(qū)域的突變往往導致農桿菌感染植物能力的下降。（1）Vir區(qū)

12、操縱子的基因結構章魚堿型Ti質粒：Vir區(qū)大小為40kb，含有VirA、B、C、D、E、F、G、H（ PinF）等8個操 縱子，共 24個基因。大多數操縱子含有多個基因 VirA（1）、 VirB（11）、 VirC（2）、 VirD（ 4） VirE （ 2）、 VirF （ 1 ）、 VirH （ 2）。胭脂堿型Ti :有7個操縱子，少一個 VirF，它們的第一個操縱子也不同，章魚堿型Ti是VirH，而胭脂堿型Ti是Tzs，其功能也不同。Vir區(qū)基因的表達有兩種方式： 組成型表達；在無植物誘導分子存在下依然保持一定的表達水平，virA ， virG 、 virH誘導型表達： 這些基因的表達

13、必須在土壤農桿菌感染植物時， 子作用下才能啟動表達，如 virB 、 C、 D、 E virG雖屬于組成型表達，但有植物信號分子存在下表達量提高（2）Vir區(qū)操縱子的基因的功能Vir A單個基因，2.4kb，僅編碼一條多肽。Vir A編碼一種結合在膜上的化學受體蛋白（92KD ），可直接對植物產生的酚類化合物感應，是一種感應蛋白。Vir A的活化：當AS與Vir A的受體部分結合后，會使整個Vir A蛋白構象發(fā)生變化，其 C端活化。Vir A蛋白的胞質區(qū)有自激酶的功能，可在保守的組氨酸殘基上磷酸化，從而Vir A蛋白被激活。激活后的 Vir A具有轉移其磷酸基至 Vir G蛋白的一個宿存的天冬

14、氨酸殘基的 能力，使Vir G蛋白激活。Vir G Vir G，只有1Kb，單基因，編碼DNA結合蛋白，其C端有DNA結合活性，N端具有 磷酸化的酸性結構。從總體效應講，Vir G基因是屬于組成型表達的，這對于細菌迅速地將外部環(huán)境信號傳遞到 細胞內十分有利。當磷酸化的A蛋白將其磷酸基轉到 Vir G保守的天冬氨酸殘基上時，使Vir G蛋白活化，活化Vir G蛋白可以二體或多體形式結合到Vir啟動子的特定區(qū)，從而成為其它Vir基因轉錄的激活因 子，打開Vir B、C、D、E、H等幾個基因。Vir A或G突變后會減弱或完全失去對其 他Vir位點活化的誘導，VirA及Vir G的這種調控作用被稱為雙

15、因子調控體系。Vir H、Vir F 及 Tzs這些基因對質粒是特異的，在章魚堿型中有Vir F、Vir H，在胭脂堿型中有Tzs。Vir H ：對植物產生的某些殺菌或抑菌化合物起解毒作用，從而使自身生不受抑制，可增強 致瘤能力。Vir F :編碼一個23KD蛋白，通過Vir系統(tǒng)傳遞到植物細胞中，對 T-DNA起運輸作用。Tzs:大部分胭脂堿型菌株的 Ti質粒上均有Tzs基因，轉運玉米素合成酶基因，在細菌中表達 后將玉米素分泌到細胞外。 該細胞分裂素被植物吸收后， 能促進農桿菌感染部位的植物組織 脫分化和細胞分裂，提高植物對農桿菌轉化的感受性。三、農桿菌Ti質粒基因轉化機理1. T-DNA 的

16、加工及轉移首先在下鏈25bp重復序列的右邊界左起第 3和第4堿基間剪切，從缺口的3端開始合成新的 DNA鏈，并一直延伸到左邊界第22bp處。置換出原來的下鏈，形成ssDNA，即T鏈。VirD蛋白的功能：VirDI及VirD2分別編碼16KD和47KD蛋白，與T-DNA的加工有關，決定 在邊界重復序列的特定位點上形成切口，產生T鏈斷裂。VirD2蛋白的功能：特異剪切，并與T鏈的5端共價結合。導向功能；2. T鏈蛋白復合體的形成及 VirE的功能T鏈必須橫向跨越細菌細胞膜、細菌細胞壁、植物細胞壁、植物細胞膜及核膜才能整合進植 物基因組。T鏈以一種DNA-蛋白復合體（T復合體）的形式存在。目前已知至

17、少兩種 Vir特異蛋白即VirE2和VirD2與T鏈蛋白復合體的形成有關。VirE2的功能：編碼ssDNA結合蛋白，該蛋白可非特異地一與任何 ssDNA結合，通過與T鏈非 共價結合，VirE2可包被T鏈形成細長的核-蛋白絲，使ssDNA抗3和5外切核酸酶和內切核酸 酶。3. T鏈復合體通過細菌細胞膜的轉運及VirB的功能（1 ） VirB 的功能VirB 啟動子有 11個基因， 大多數編碼跨膜蛋白或膜結合蛋白， 能在膜上形成一種類似細菌接 合轉移時從供體菌轉至受體菌所必須的結構一一接合孔或性毛。T-DNA通過這種孔由細菌進入植物細胞。同時， VirB 也可能起運輸和提供能量的作用。按功能，可將

18、 VirB 蛋白分成五類：R:在內膜上或內膜內的某些蛋白，可能作為T復合體的受體；A :此類蛋白可能作為能源，作為一種ATP酶促進T復合體被泵出細菌細胞，VirBII可能是這種A類蛋白。C:形成通道的作用，如：VirB4是一種富集蛋白，無疏水區(qū)，無信號肽，可能在T鏈轉運中起一種結構作用，形成至少一部分特殊的通道結構。S:載體蛋白，起運載T復合體穿過通道的作用，這類蛋白可能與所有膜成分（內膜、外 膜及周膜）有關。P:位于外膜上，可能作為結合植物細胞膜的一種受體。（2）T復合體向植物細胞核的轉運VirD2可能以一種極性方向，將 T復合體定向至核孔，而 VirE2則作為一種促進因子，保證很 長的T復

19、合體在進入核孔時不受干擾。在T-DNA轉移過程中，VirD2具有火車頭的作用，牽制T復合體以5端到3端的方向向核遷移， 而VirE2則只助推器的角色，幫助未折疊的長形T復合物不被打斷，并方便其向核運動。已知VirE2-ssDNA可以抗拒內切酶的作用，如核酸外切酶VII對VirE2-ssDNA降解能力將相當于對ssDNA的6%，對S1核酸酶的效果也相似。4、細菌染色體上與T-DNA轉移有關的基因目前已知農桿菌染色體上有 10個基因與T-DNA轉移有關，它們主要涉及細菌與植物 細胞的接觸和細菌向植物傷口的趨化性。chvE 編碼一個葡萄糖和半乳糖結合蛋白，主要結合組成植物細胞壁的單糖；可 能由于識別

20、植物受傷產生的糖單體，導致細菌向植物傷口的趨化性；在低pH值、磷酸饑餓條件下啟動VirG表達。chvD 編碼一種細菌ATP結合蛋白，在低pH值、磷酸饑餓條件下誘導 VirG蛋白含 量升高，然后VirA接受AS信號，刺激VirG轉化成活性形式，啟動其他 VirG基因表 達。chvA、chvB、 chvC-與環(huán)狀:-1，2-葡聚糖的合成和運輸有關；chvB產物催化合成葡聚糖，chvA產物將多糖從胞質運到胞外，影響農桿菌對植物細胞的附著能 力。pscA和Exoc與多糖的合成有關，并影響農桿菌對植物細胞的附著能力。四、農桿菌Ti質粒的改造及載體構建1、野生型Ti質粒直接作為基因工程載體的障礙：（1）分

21、子量大，160240Kb ；（2）有各種限制性內切酶的多個切點；（3）T-DNA區(qū)中含有許多編碼基因與基因轉移無關，如致瘤基因，其存在還會導致植物體 喪失形態(tài)發(fā)生能力；（4）Ti質粒不能在大腸桿菌中復制。2、Ti質粒構建的幾個重要因素（1）右邊界序列；（2）完整的Vir基因群；（3）有獨特的酶切點；（4）有在植物中可表達的選擇性基因；（5）有在細菌中可表達的選擇性基因；（6）章魚堿型農桿菌品系需要獨特的增強子。3、載體構建先將T-DNA片段克隆到大腸桿菌質粒中，并插入外源基因，最后通過三親交配或接合轉 移把外源基因引入農桿菌 Ti質粒上。Ti質粒的載體系統(tǒng)分兩類：一元載體和雙元載體例：雙元載體

22、的構建雙元載體系統(tǒng)由兩個分別含 T-DNA和Vir區(qū)的相容質粒構成。（1 ）構建原理Ti質粒上的Vir基因可以反式激活T-DNA的轉移，T-DNA和Vir區(qū)處于不同的Ti質粒上同樣能 起到轉移T-DNA的作用。雙元載體含有廣泛寄主范圍質粒的復制起點（oriv），從而代替了在共整合載體中用以重組的同源區(qū)，它們能在任何農桿菌寄主里自發(fā)復制。所以寄主僅需一套完整的 vir質粒就可。主要的轉移區(qū)載在小重組 Ti質粒上。（2）微型 Ti 質粒（mini-Ti plasmid ）含有T-DNA邊界，缺失Vir基因的質粒；含廣譜質粒的復制位點OriV及選擇標記基因。（3）輔助Ti質粒含Vir區(qū)段的Ti質粒，

23、helper Ti,是T-DNA缺失的突變型Ti （卸甲Ti）,提供Vir基因功能，反 式激活T-DNA的轉移。LBA4404中含有pAL4404（pTiAch5的衍生質粒），野生型Ti也可做Helper Ti,有更強的毒性。五、根癌農桿菌侵染植物細胞的機理1、 根癌農桿菌的生物學特性分類農桿菌屬， 也稱土壤桿菌屬和根瘤菌屬， 是同屬于根瘤科的革蘭氏陰性菌。土壤桿菌屬有 4 個種：根癌農桿菌、放射形農桿菌、毛根農桿菌和懸鉤子農桿菌。根癌農桿菌， 根據其誘導植物細胞產生的冠癭堿種類不同可分為三種類型即章魚堿型、胭脂堿型和農桿堿型。生活習性 土壤桿菌屬都是土壤習居菌，主要生活在曾被多種植物生活過的

24、土壤中，好氧，但 也能在低氧壓的植物組織中生長，最適溫 2530 C, pH4.012.0,最適pH6.09.0。形態(tài)結構農桿菌細胞呈桿形，0.8x1.53.0卩m以14根周生鞭毛運動，不形成芽孢，菌落無色，隨菌齡增加,光滑的菌落逐漸變成有條紋,但也有許多菌株生成的菌落呈粗糙型。寄主范圍根癌農桿菌廣泛存在于雙子葉植物中, 根據不完全統(tǒng)計, 約有93屬643種雙子葉植物 對根癌農桿菌敏感。裸子植物對該菌同樣具敏感性,能誘發(fā)腫瘤,對絕大多數單子 葉植物無侵染能力。2、 根癌農桿菌侵染的誘導信號及作用機理（ 1 ）酚類化合物酚類物質 農桿菌浸染植物細胞所必需的誘導物,同時將其作為趨化物來識別。實驗證

25、明，一些植物中常見的酚類化合物的混合物都可激活Vir區(qū)基因。如：兒茶酚、沒食子酸、焦性沒食子酸、仆羥基苯甲酸、原兒茶酸、香草醛。Stachel等在煙草葉片的傷口誘出液中確認了兩種主要的Vir區(qū)基因誘導物：乙酰丁香酮AS和羥基乙酰丁香酮 OH-AS。AS效果最好，0.51.0卩moRL可誘導Vir活化。（2）中性糖和酸性糖中性糖在Vir基因誘導和致病毒力中也起重要作用。Shimoda等人，在限定AS誘導條件下，發(fā)現(xiàn)許多中性糖（L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-艾杜糖、D-半乳糖、 D-塔羅糖、2-脫氧-D-葡萄糖）都可增強一些 Vir區(qū)基因的誘導。這些中性糖是通過chvE和Vi

26、rA起作用，chvE編碼葡萄糖和半乳糖結合蛋白，識別傷口產生的糖單體，導致農桿 菌的趨化作用。酸性多糖是組成植物細胞壁中果膠質的主要成分。最近的實驗證明,酸性糖（胡蘿卜根提取物中蒸餾出來)可改變農桿菌基因的表達。蛋白質標記實驗表明，至少有 10種蛋白 質合成被其誘導，一種被阻遏。(3)pH 值5.05.5的低pH值。誘導物對pH的要求是60,在農桿菌培養(yǎng)在含有酚類化合物( AS ) 的培養(yǎng)基中時， pH5.0 5.8Vir 的誘導達到一個最高水平3、根癌農桿菌的侵染能力及其特異性(1) 常用的根癌農桿菌胭脂堿型(Nop)菌株：染色體背景為 C58，生長快，不結球，轉化中容易操作，常用 的菌株有

27、 C58、pGV3850 、A208SE 等。章魚堿型(Oct)菌株：染色體背景為 Ach5，生長慢，結球，轉化中難操作，培養(yǎng)后不 易洗掉，常用的菌株有 LBA4404,LBA1010,GV2260,GV3111SE,K61 等。農桿堿型(Agr)菌株，也稱琥珀堿型(Sue):染色體背景為A281或A136，具有胭脂堿 型菌株的特點，以A136為染色體背景的常用菌株是 EHA101，生長快，不結球，侵染能力強， 常用的菌株有 A281、EHA101、EHA105等。(2) 、根癌農桿菌的侵染能力差異根據侵染能力大小將農桿菌分為： 廣宿主菌株：大多數雙子葉、若干裸子植物、少量單子葉植物；如：pT

28、iB0542 、 pTiA6；窄宿主菌株：有限的幾種植物上誘發(fā)腫瘤，如pTiAg162,僅能在葡萄的幾個品種上誘發(fā)腫瘤。不同植物對農桿菌侵染的敏感性不同， 在轉化中， 二者的選配十分重要， 要選農桿菌與植物 之間有高侵染力的配合。如：楊樹莖，用C58優(yōu)于LBA4404 ;蘋果，6種基因型比較，葉：EHA101 ( pEHA101 )優(yōu)于 LBA4404，C58;莖：A281 優(yōu)于 C58, ACH5，A348。農桿菌的染色體背景對宿主范圍同樣有著重要作用。因為除Vir區(qū)功能外，農桿菌對植物表面識別與結合有關的功能還取決于農桿菌染色體上基因位點。農桿菌所展示出不同的生長速率、多糖產生和對植物細胞

29、的毒力都會影響轉化率和宿主范圍。六、根癌農桿菌轉化程序及操作原理1、根癌農桿菌Ti質粒轉化的基本程序(1 ) 選擇適宜的培養(yǎng)基，使創(chuàng)傷部位能產生盡可能多的再生植株。(2) 確定供體植物最適的培養(yǎng)條件。( 3) 確定最佳外植體類型、大小、部位等：再生途徑，愈傷組織起源(細胞類型、層次) 保證轉化愈傷組織和芽原基由創(chuàng)傷部位的淺層細胞發(fā)育而來。(4) 確定適宜的抗生素水平：抑菌抗生素 Cef ， Cb ，能抑制細菌生長，還能保證愈傷組 織正常生長和分化。(5) 確定選擇壓力的最低水平。( 6) 優(yōu)化農桿菌接種和共培養(yǎng)條件改進篩選條件， 促進抗性細胞恢復再生能力： 采用無毒 的生化物質。2、根癌農桿菌

30、的培養(yǎng)、純化、保存及工程菌液的制備 (1)農桿菌的培養(yǎng)? 常用的農桿菌培養(yǎng)基有LB、 YEM、 YEB、 TY、523、PA及 Mi nA等培養(yǎng)基。?這些培養(yǎng)基中，LB、YEB、YEM及523屬富集培養(yǎng)基，其營養(yǎng)成分豐富，包括有各種有 機成分。在這些培養(yǎng)基中農桿菌生長快， 分裂旺盛， 它們是常用 制備工程菌液的培養(yǎng)基。? PA和TY培養(yǎng)基是屬營養(yǎng)較好的培養(yǎng)基，氨基酸及碳源、氮源都很豐富。農桿菌在這些 培養(yǎng)基上生長也很快，是常用的農桿菌選擇培養(yǎng)時的培養(yǎng)基。? MinA 培養(yǎng)基與前幾種培養(yǎng)基有明顯差異：只提供必要的無機鹽，并用葡萄糖和（NH4）2SO4 提供碳源和氮源。? Minimal只用相應的

31、冠癭堿如 NOpaline、Octopine等取代蔗糖、氨基酸和無機氮作為農 桿菌的碳源和氮源。?農桿菌在MinA和Minimal培養(yǎng)基上生長較慢。在進行三親雜交時通常用這兩種培養(yǎng)基， 并加相應的抗生素選擇轉化的農桿菌。含重組質粒的大腸桿菌及含輔助質粒pRK20 13的HB101因不能利用冠癭堿作為碳源和氮源而不能生長，同時還存在抗生素的選擇，因 此有利于選擇轉化的農桿菌的生長。農桿菌的生長周期 農桿菌培養(yǎng)方式：分為固體平板培養(yǎng)和液體振蕩培養(yǎng)， 固體培養(yǎng)一般需23d,液體培養(yǎng)生長更快，一般需 12d。 農桿菌接種在培養(yǎng)液后，并不立即開始增殖。 一般在2530C時，需12 h細菌才開始分裂。當生

32、長開始后,細菌數目以一恒定的指數速率倍增,直至培養(yǎng)基成分改變和供氧 缺乏時才停止增殖。當細菌增長速率達到對數指數時稱之為對數生長狀態(tài)。當細菌密度達到 177 / ml時，空氣中的氧氣便難以很快地擴散到細胞內。在振蕩 或通氣條件下培養(yǎng),細菌濃度也很少超過23 X 109ml。測定農桿菌濃度的方法：最簡單的方法是光密度測定法。將菌液裝入比色杯汽在 分光光度計上選用600nm波長測定其OD值。光密度與濃度換算公式是 1OD約等于 8 X 108ml。（2）工程菌的純化純化菌種的方法主要采用常規(guī)的微生物純化方法,即劃線法。用接種針劃線,然后 用石蠟膜封口，將平皿倒置放恒溫箱內，在2528 C條件下培養(yǎng)

33、過夜，次日或即日看到分離的單菌落。挑取單菌落接種在液體培養(yǎng)基內進行液體振蕩培養(yǎng)。（3）工程菌侵染懸浮液的制備?液體振蕩培養(yǎng)的工程菌，通常培養(yǎng)1224 h后即可達到對數生長期。用離心管取一定數量的菌液進行4000r/ min離心，倒掉上清液，再加入植物外值體誘導愈傷組織或分芽的 液體培養(yǎng)基，使其光密度OD值達到0. 5,即可用作接種外植體的工程菌液。注意：因為農桿菌培養(yǎng)基中通常含有抗生素,它對外植體的生長、脫分化或分化有不良 影響,放需通過離心除去細菌培養(yǎng)基,加入植物培養(yǎng)基。也有的做法是,將農桿菌加入 植物培養(yǎng)基后再振蕩培養(yǎng) 12 h，當細菌生長達到對數生長期后再離心，倒掉上清液，用 新的植物液

34、體培養(yǎng)基稀釋至一定 OD值，再作為工程菌液使用。4）工程菌的保存菌種的保存的目的是創(chuàng)造一個適合細菌休眠的環(huán)境（低溫、干燥、缺氧） ，使其得以 長期保存。其功能在于盡量減少菌株的傳代次數；使菌種經保存后不死亡、不污染 雜菌，并保持其原有性狀，降低菌種的變異率；最終目的是的基因不能丟失。菌種保存的方法根據其保存時間長短可分為三種方法：短期保存數月）：采用斜面或平板保存法。斜面菌種置于4C可保存數月，平板用石蠟膜密封后也可在低溫 04 C下放置數月。中長期保存 （數年）：中長期保存采用穿刺法， 這是一種菌種接入柱狀培養(yǎng)基的方法。經常應用的是半固體柱狀培養(yǎng)基，用接種針沾取少量問后直接插入柱狀培養(yǎng)基中。

35、需注意的是，要從培養(yǎng)基中間插入，直插到接近管底，但不要穿透培養(yǎng)基，再慢慢按原途徑拔出接種針，切勿攪動，以免使接種線不整齊而影響 觀察，甚至會因用力攪動造成空隙太大進入空氣，而影響保存效果。穿刺培養(yǎng) 的菌種用蠟封口，在室溫下可保存數年。長期保存菌種：主要采用甘油保存法。在7二甲基亞（ DMSO ）或 15甘油中，菌種可于-70 C冰箱或液氮中長期保存。當甘油含量增加4050%時，細菌可在-20C或-70 C條件下，保存若干年而不失活。將冰凍菌種從冰柜中取出 時， 應當放在冰浴上慢慢融化， 不可直接將其放室溫下， 否則會導致菌體失活， 更不能直接接種至液體培養(yǎng)基內28 C振蕩培養(yǎng)。3、Vir基因活

36、化誘導物的使用（1）誘導物：常用誘導物是乙酰丁香酮（AS）和羥基乙酰丁香酮（OH AS）,其中效果優(yōu)是AS。 但最近又有新的發(fā)現(xiàn)，有兩種特殊化合物比AS的誘導活性高10100倍。（2）誘導物的使用方法在農桿菌液體培養(yǎng)時加 AS，加入時間般在制備工程菌浸染液使用前46 h加入。使農桿菌既處于對數生長期，又處于vir基因高度活化狀態(tài)，從而提高侵染能力。也有的在農桿菌懸浮液離心后用植物外植體培養(yǎng)基稀釋成侵染液時加入。AS加在農桿菌和外植體共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中。共培養(yǎng)的過程是Ti質粒實現(xiàn) T-DNA轉化時期。一般農桿菌附著16 h后才能進行轉化，這時需要 vir基因的高度活化。因此，許多科學家贊成這種使用

37、方法。在農桿菌液體培養(yǎng)基中及共培養(yǎng)基中都加入AS。這種方法似乎最牢靠，只不過是使用的AS誘導劑太多了。（3）誘導物使用的pH值pH值對vir區(qū)的活化有著明顯的影響，從理論上講含AS的培養(yǎng)基pH值為5. 05. 6時， Vir區(qū)基因的誘導達到最高水平。pH值改變0. 3,即對多種植物的轉化率有明顯影響。章魚堿型和農桿堿型菌系比胭脂堿型和琥珀堿型需要更低的pH值。通常農桿菌培養(yǎng)時pH值為7. 2。這種生長旺盛的菌株的 vir基因均處于不活化狀態(tài)。而組織 培養(yǎng)基中的pH值常為5. 8,有利于vir基因的活化。在vir基因活化誘導中應調整培養(yǎng)基的 pH 值。4、外植體的選擇Mayer等指出，轉化只發(fā)生

38、在細胞分裂的一個較短的時期內，可能只有處于細胞分裂周期的S期才具有外源基因的轉化能力，因為核基因組DNA正在復制時才能使外源 DNA整合。因此 細胞具有分裂能力是轉化的基本條件。（1）外植體的種類 葉片、葉柄、子葉、子葉柄、下胚軸、莖、花莖、匍匐莖、塊；莖尖分生組織、芽、根、合 子胚或體細胞胚， 以至成熟的種子等都可作為外植體轉化。 但各種外植體材料的轉化率有明 顯差異。賈士榮等（ 1992）對不同外植體轉化成功的例進行分析統(tǒng)計結果表明，葉片（葉柄）、子葉（子葉柄）、胚軸、 莖等外值體轉化成功的事例最多， 它們分別占 35、 9。 10 和 17。但是， 不同植物的最佳外植體種類不同， 要根據

39、具體植物進行選擇。（2）轉化外植體的選擇原則 以葉片、子葉、胚軸為首選外植體材料。 選擇幼年的外植體，同時要考慮其最佳感受態(tài)。 轉化外植體易于組織培養(yǎng)，并有較強的再生能力。應考慮感受態(tài)細胞在外植體的部位。一些復雜器官的外植體如胚軸、莖段、子葉、幼葉等， 其性質未定細胞的部位及數量分布是不同的， 如葉尖部分生細胞少， 葉基分生細胞多， 子葉 基部有大量的分生細胞， 胚軸的極端也有大量的分生細胞， 有的外植體的分生細胞埋藏于深 層，盡管這些細胞具有強的再生能力， 但是農桿菌難以深入到附著于這些細胞壁上實現(xiàn)轉化。5、外植體的預培養(yǎng)、接種及與農桿菌的共培養(yǎng)（1）外植體的預培養(yǎng)預培養(yǎng)的作用： （ 1）促

40、進細胞分裂，分裂狀態(tài)的細胞更容易整合外源DNA 因而提高外源基因的瞬時表達和轉化率。 （ 2）田間取材的外植體通過預培養(yǎng)起到馴化作用， 使外植體適應于試管離體培養(yǎng)條件，并保持活躍的生長代謝狀態(tài)。（ 3）減少外植體轉化過程中的雜菌污染率；如果外植體上帶污染源時，在預培養(yǎng)被篩選掉。（ 4）有利于侵染接種的外植體能與培養(yǎng)基平整接觸。因為外植體在開始培養(yǎng)過程中，由 于其迅速生長而出現(xiàn)上翹或卷曲，使農桿菌的接種切面離開培養(yǎng)基致使農桿菌不能 生長實現(xiàn)轉化。 外植體的預培養(yǎng)時間：每一種外植體均有其最佳預培養(yǎng)時間。預培養(yǎng)時間太長降低外植體的轉化率，甚至農桿菌侵染后外植體死亡。一般以2- 3 d為直，例如矮牽牛

41、、番茄、擬南芥菜葉片轉化均需 2d預培養(yǎng)。否需要預培養(yǎng)， 預培養(yǎng)多長時間， 要根據不同植物、 不同外植體而確定。（2）外植體的農桿菌接種外植體接種就是把工程菌接種到外植體的損傷切面。 方法是將切割成小塊的外植體浸泡在制備好的工程菌液中，浸泡一定時間后，尚需 用無激素植物培養(yǎng)基或無菌水漂洗，再用無菌吸水紙吸干。但目前外值體用菌液浸 泡后常不經漂洗，直接放在無菌吸水紙上吸干外植體非傷口面的菌液，即可進行共 培養(yǎng)。在接種過程中應注意以下幾點： 掌握外植體在菌液中浸泡的時間： 有助于減少后繼培養(yǎng)中可能造成的污染， 并可減輕細菌對 植物細胞的毒害作用， 一般控制在數秒鐘至數分鐘內， 以葉盤邊緣充分濕潤為

42、度。 浸泡時間 太短農桿菌尚未接種到傷口面， 在其培養(yǎng)時無農桿菌生長， 不能轉化。 如果外植體在菌液中 浸泡時間太長，常因農桿菌毒害缺氧而軟腐，一般不要超過 30mln 。菌液濃度：對不同植物的外植體而言有一定差異，一般濃度范圍是OD600=0 . 050. 7之間。對農桿菌敏感的植物，因其易產生過敏反應而導致 外植體切口處褐化，故常采用較低的OD值和較短的浸泡時間。浸泡后的外植體在濾紙上吸干要適度，如果暴露時間太長造成外植體失水萎回； 吸得太干在共培養(yǎng)時切口面無農桿菌生長。因此要明確濾紙吸干的原則是除去 過量的菌體。（3）農桿菌與外植體共培養(yǎng) 接種菌體后的外植體培養(yǎng)在誘導愈傷組織或不定芽分化

43、的固體培養(yǎng)基上，在外植體細胞分 裂、生長的同時，農桿菌在外植體切口面也增殖生長，該兩者共同培養(yǎng)過程稱之共培養(yǎng)。最佳共培養(yǎng)的時間：? 農桿菌轉化時，并不 “侵入”到植物細胞中去，而是把 TDNA 轉移到植物細胞。農 桿菌附著后不能立即轉化， 只有在創(chuàng)傷部位生存16h之后的菌株才能誘發(fā)腫瘤， 這一 段時間稱為細胞調節(jié)期”。因此，共培養(yǎng)時間必須長于16h。共培養(yǎng)時間太長，由于農桿菌的過度生長，植物細胞因受到毒害而死亡。共培養(yǎng)時間對轉化率有著很 大影響，而且不同物種、外植體種類、農桿菌菌株的最佳共培養(yǎng)時間不同。?確定最佳共培養(yǎng)時間的方法主要采用gus基因瞬時表達測定法，即共培養(yǎng)后定時測定外植體的gus

44、基因顏色反應，統(tǒng)計瞬時表達率及表達面積，以表達率高，表達面積 大為優(yōu)。同時還要考慮外植體的受損害程度，以保證外植體的旺盛生長為直。最后 還要以獲得的轉化愈傷組織頻率或轉化不定芽頻率為最終依據。農桿菌的增殖適度在共培養(yǎng)時農桿菌增殖生長不良， 外植體切口邊緣只有很少的農桿菌生長， 則轉化的機率很 小。反之，農桿菌在外值體四周過度增殖，可引起對外植體的毒害，致使其褐化死亡?？刂妻r桿菌增殖適度的原則是既要使菌株在外植體邊緣特別是切口面旺盛增殖生長，又不應過度，一般以覆蓋切口面為適度。控制農桿菌增殖的方法有以下幾種：1 ）調整工程菌液的濃度，生長太快則應降低菌液濃度。2）控制共培養(yǎng)時間，農桿菌的增殖生長

45、適度也是確定共培養(yǎng)最佳時間的指標，共培養(yǎng)時 間太長可造成農桿菌過度生長。3）使用抗生素調控農桿菌的增殖生長。一種方法是在共培養(yǎng)基中加入適量的抗生素如羧芐青霉素或頭孢霉素。另一種方法是共培養(yǎng)23d后的外植體需用含抗生素的液體共培養(yǎng) 基充分洗滌，以除去過量的農桿菌，然后轉到新鮮的共培養(yǎng)基上繼續(xù)共培養(yǎng)。共培養(yǎng)結 束時若仍存在農桿菌過度增殖，則可再用上述洗滌培養(yǎng)基充分洗滌后進行愈傷組織誘導 或不定芽分化培養(yǎng) 。共培養(yǎng)中激素的影響 共培養(yǎng)時培養(yǎng)基中是否加激素，文獻報道不一，有的不加激素，有的則認為加激素 后促進外植體細胞分裂，保持細胞活力，也有利于轉化后細胞的生長，從而提高 轉化率。女口 Mansur等

46、（1993）用A281菌株與花生葉片外植體共培養(yǎng)時，加激素比不加激素 的腫瘤誘導率提高約30。目前大多數研究者采用加激素的方法，而且共培養(yǎng)基與愈傷組織誘導或不定芽誘導培養(yǎng)基相同。（4）外植體脫菌及選擇培養(yǎng)外植體的脫菌培養(yǎng)脫菌培養(yǎng)， 即把共培養(yǎng)外植體轉移到含有抗生素的培養(yǎng)基上。 常用的脫菌抗生素有羧芐青霉 素（ Carb）、 頭孢霉素（ Cef） 等。這些抗生素不僅對農桿菌有殺傷或抑菌作用，而且對植 物細胞同樣有一定的生物效但對不同植物的不同外植體產生的影響不同。Holford 等（ 1 992 ）指出， Carb 的分解物為生長素及苯乙酸，因此 Carb 可刺激愈傷組 織的增殖。 Howe 等

47、（ 1994 ）觀察到對楊樹的愈傷組織誘導有抑制作用。在甘藍研究中發(fā) 現(xiàn)， Carb 抑制根分化， Cef 抑制芽分化，因此芽分化階段需用 Carb， 生根階段則用 Cef。抗生素的使用濃度一般為 500mg L 左右。其使用原則是在達到抑制農桿菌生長的目的后， 盡量降低其濃度。脫菌培養(yǎng)的時間：脫菌培養(yǎng)的時間，一般需56次繼代培養(yǎng)，但仍然不能把殘留的農桿菌殺 死，特別是共生在維管束和細胞間隙中的農桿菌。 如果停止使用抗生素后的外植體又有農桿 菌可再使用抗生素脫菌。也有的植物一直使用抗生素，直到試管苗形成。（5）轉化體的選擇培養(yǎng)選擇壓： 選擇抗生素如 Km ，加入選擇培養(yǎng)基后，對細胞的生長產生一

48、種選擇作用， 稱之為選擇壓。加入的抗生素濃度愈大，選擇壓也愈大。選擇培養(yǎng)基中抗生素的濃度，即選擇壓的強度，也要根據植物的特性而定，較敏感的植物要用較低的Km濃度。一般濃度范圍是 Km 50 100mgL， hpt 1020mgL， ppt 520mgL。選擇的方法：前期選擇、延遲選擇和后期選擇。前期選擇：就是外植體共培養(yǎng)后，在轉入愈傷組織或不定芽誘導的一開始就加入選 擇壓，相當于前面講到的先選擇后再生。延遲選擇：當愈傷組織和不定芽誘導培養(yǎng)時開始不加選擇壓，過一周或一定時間后 再加入選擇壓，這樣既有利于轉化細胞生長又不會產生更多的嵌合體后期選擇：即相當于前面說的先再生后選擇，有利于提高轉化率。選

49、擇培養(yǎng)過程中轉化和再生細胞的一致性 在選擇培養(yǎng)條件下再生細胞和轉化細胞是否一致， 關系到能否得到真正的轉化， 只有同時具 有再生和轉化潛力的細胞才有可能分化成轉基因植株。 因此再生部位和可被轉化的細胞部位 應該發(fā)源一致， 反之得到的可能是假轉化體。 假轉化體在繼代選擇培養(yǎng)基上生長不良而死亡， 或呈白化。七、根癌農桿菌Ti質粒轉化的方法1、整體植株接種共感染法? 該途徑是模仿農桿菌天然的感染過程，人為地在整體植株成創(chuàng)傷部位，然后把農桿菌接 種在創(chuàng)傷面上，或用針頭把農桿菌注射到植株體內，桿菌在植株體內進行侵染實現(xiàn)轉化， 獲得轉化的植物細胞，因此也稱之為體內轉化。為了獲得更高的轉化頻率，一般采用無 菌的種子實生苗或試管苗。它是最簡便的轉化法。優(yōu)點：實驗周期短；充分利用了這些無菌實生苗的生長潛力； 避免在轉化中其他細菌的污染；? 菌株接種的傷口與培養(yǎng)基分離，以免農桿菌在培養(yǎng)基上過度生長，允許在無抗生素 的培養(yǎng)基上進行；? 具有較高的轉化成功率。? 缺點：? 轉化組織中常混有較多未轉化的正常細胞，即形成嚴重的嵌合體；?