GB-T18936-2020高致病性禽流感診斷技術(shù)

?ICS11.220B41

中華人民共和

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/T18936—2020

代替GB/T189362003

高致病性禽流感診斷技術(shù)

Diagnostictechniquesforhighlypathogenicavianinfluenza

2020-12-14發(fā)布 2020-12-14實(shí)施

I轟裏霞審暮霱雲(yún)養(yǎng)唇

GB/T18936—2020

目次

I1細(xì) 1

2規(guī)范性引用文件 1

3術(shù)語(yǔ)和定義 1

4臨床診斷 2

5樣品采集、保存與運(yùn)輸 2

6病毒分離與鑒定 3

7血凝和血凝抑制試驗(yàn) 3

8禽流感病毒RT-PCR試驗(yàn) 4

9禽流感病莓實(shí)時(shí)熒光KT-PCR試驗(yàn) 5

10綜合判定 6

附錄A（規(guī)范性附錄）試驗(yàn)所用溶液和1%雞紅細(xì)胞的配制 7

附錄B（資料性附錄）髙致病性禽流感病毒IVPI測(cè)定試驗(yàn) 8

附錄C（資料性附錄）血清非特異性凝集和非特異性抑制因子的處理方法 10

附錄D（資料性附錄）禽流感病毒RT-PCR試驗(yàn)用引物 12

附錄E（資料性附錄）RT-PCR反應(yīng)液配制 13

附錄F（資料性附錄）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR引物探針序列及反應(yīng)液配方 14

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T18936-2003＜髙致病性禽流感診斷技術(shù)》.與GB/T18936-2003相比.主要技術(shù)變化如下：

——增加了禽流感病毒RT-PCR試驗(yàn)（見(jiàn)第8章〉＞

增加丫禽流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試驗(yàn)（見(jiàn)第9章）；

—?jiǎng)h除f瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散（AGID）試驗(yàn)（見(jiàn)2003年版的第4章）,

刪除了間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）（見(jiàn)2003年版的第5章）。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專(zhuān)利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC181）歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱苒醫(yī)研究所、中華人民共和國(guó)北京海關(guān)、中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:王秀榮、田國(guó)彬、劉環(huán)、鄧國(guó)華、蔣文明、施建忠、曾顯營(yíng)、李雁冰、谷強(qiáng)、孫曉東、陳化蘭，

本標(biāo)準(zhǔn)所代將標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：

——GB./T18936-2003。

GB/T18936—2020

高致病性禽流感診斷技術(shù)

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了髙致病性禽流感臨床診斷，樣品采集.保存與運(yùn)輸.病毒分離與鑒定.血凝和血凝抑制試驗(yàn).禽流感病毒RT-PCR試驗(yàn)和禽流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試驗(yàn)的技術(shù)要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于髙致病性禽流感的診斷、檢疫、檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)査等。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件.僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新，坂本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

NY/T765髙致痃性禽流感樣品采集、保存及運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件，

3.1

商致病性禽流感highlypathogenicavianinfluenza?HPAl

由正黏病毒科流感病毒屬A型流感病賚引起的以禽類(lèi)為主的急性傳染病。

3.2

血凝hemagglutinin;HA

流感病毒顆粒表面的血凝索蛋白，具有識(shí)別紅細(xì)胞表面受體并使紅細(xì)胞凝集的特性。

3.3

血凝抑制hema朗lutinininhibition；HI

抗體特異性地附著在HA分子的抗原位點(diǎn)上，干擾流感病毒HA與紅細(xì)胞受體之間的結(jié)合.抑制了流感病毒HA凝集紅細(xì)胞的能力。

3.4

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)reversetranscription-polymerasechainreaction；RT-PCR

一種用于放大擴(kuò)增特定的RNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。先用RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的過(guò)程。

3.5

實(shí)時(shí)熒光RT-PCRreal-timeRT-PCR

利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程的一種擴(kuò)增核酸方法。

Ct值cyclethreshold

毎個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光倌號(hào)量達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)。

4臨床診斷4.1易感動(dòng)物

雞、火雞、鴨、鵝、鶴鶉、雉雞、鵝鴣、蛇鳥(niǎo)、孔雀等多種禽類(lèi)易感.多種野烏也可感染發(fā)病。4.2臨床癥狀

4.2.1

4.2.2

4.2.3

4.2.4

精神沉郁.嗜睡，頭翅下垂.呆立I食欲不振；呼吸困難，有呼吸道癥狀。

雞冠發(fā)鉗、發(fā)紫;眼結(jié)膜發(fā)紅;排 未完全消化的飼料;腳鱗或有出血。

產(chǎn)蛋下降.軟殼蛋、畸形

鴨、鵝等水禽可貝

略物.甚至失明。

4.3剖檢變化

神大出*:直

出血。

4.4結(jié)

］為髙

出

3中的

鹽似病

一步開(kāi)

:診斷。

.2

5樣品

集.

存與運(yùn)轍

5.1總則

免交叉污染。死禽或其他動(dòng)物采集氣贊、肺和腦等

5.2拭子樣品

歪脖于等神經(jīng)癥狀。

和腹

.出血?有少黏液；肺部有炎性癥狀r

，卵泡充血、出

胎肪出血：腺胃乳頭司

5.2.1采集咽喉拭子時(shí)將拭

頭及上W

轉(zhuǎn).取分泌液。

便。

遮腔拭子I小珍禽用拭子取樣易造成損傷，可

4.3.1氣管彌

4.3.2腹腔

血、萎縮、

4.3.3心置及

njf梅黃性腹祺炎”：興腺邊絕有出血、：K死.

樣品采

禽進(jìn)行，采樣i

禽樣品應(yīng)包括咽

期、遵樣具寥典型臨床癥狀的［樣＜，進(jìn)行分別處理;活

5.2.2采集泄殖腔拭子時(shí)將拭子深人 i取少量糞便。

5.2.3將采樣后的拭子分別放人盛有1.2mL樣品稀釋液（配制方法見(jiàn)附錄A中的A.1）的2mL采樣管中.編號(hào)并填寫(xiě)相應(yīng)采樣單。

5.3組織樣品

發(fā)病禽鳥(niǎo)町無(wú)歯采集氣管、肺、腦、腸（包括內(nèi)容物）、肝、脾、腎、心等組織臟器.裝入15mL或

50mL帶螺口的有機(jī)材料保存管中.編號(hào)并填寫(xiě)相應(yīng)采樣單。

5.4血清樣品采集

無(wú)菌采集禽類(lèi)的血液，毎只約2mL,編號(hào)并填寫(xiě)相應(yīng)采樣單。待血液凝固.血清析出后.收集血清用于HI檢測(cè)。

5.5樣品保存和運(yùn)輸

樣品采集后置保溫箱中，加入預(yù)冷的冰袋.密封.宜24h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室。樣品應(yīng)盡快處理.沒(méi)有條件的可在4r存放不超過(guò)d.也可在低溫條件下保存（一70’C貯存為宜）。

6病毒分離與鑒定

6.1適用范圍

病毒分離與鑒定方法適用于對(duì)HPAI的病原學(xué)診斷，應(yīng)在有資質(zhì)的髙等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室操作.按照GB19489的規(guī)定執(zhí)行。

6.2樣品處理

將棉拭子充分捻動(dòng)、擠十后棄去拭子；糞便、研碎的組織加樣品稀釋液充分研磨.按照1g組織加10mLPBS的比例配成懸液。樣品液經(jīng)3000r/min離心10min.取上清作為接種或者核酸檢測(cè)材料。

6.3樣品接種及收獲

取處理好的樣品，以0.2mL/胚的i經(jīng)尿囊腔途徑接種9d?11d無(wú)特定病原體雞胚.毎個(gè)樣品接種3?5枚雞胚.在37‘C孵化箱內(nèi)孵育.毎天上午和下午定點(diǎn)觀察雞胚死亡情況。無(wú)菌收取死胚及96h仍存活璁胚的雞胚尿囊液.測(cè)HA活性。

6.4病番鑒定

若無(wú)HA活性.則收取尿囊液進(jìn)行肓傳.至少育傳1代，若仍陰性，則認(rèn)為病毒分離陰性I若有HA活性說(shuō)明可能有正黏病灌科的流感病哿.可進(jìn)一步采用血凝和血凝抑制試驗(yàn)（見(jiàn)第7章）、高致病性禽流感病毐IVPI（靜脈內(nèi)接種致病指數(shù)）測(cè)定試驗(yàn)（參見(jiàn)附錄B）、禽流感病毒RT-PCR試驗(yàn)（見(jiàn)第8章）、禽流感病堆實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試驗(yàn)（見(jiàn)第9章〉等方法進(jìn)行驗(yàn)證。

7血凝和血凝抑制試驗(yàn)

7.1適用范圍

血凝和血凝抑制試驗(yàn)適用于血凝素亞型的診斷和抗體效價(jià)擁定。

7.2試劑

7.2.1阿氏（Alsevers）液，配方參見(jiàn)A.2。

7.2.21%雞紅細(xì)胞懸液.配方參見(jiàn)A.3.

7.2.3pH7.2、0.01mol/LPBS，配方參見(jiàn)A.4。

7.2.4禽流感病毒血凝素分型標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰性血清。

7.3HA試驗(yàn)（微量法）試驗(yàn)步驟

7.3.1在96孔V型微B反應(yīng)板中，每孔加0.025mLPBS。

7.3.2第1孔加0.025mL抗原或病莓液.反復(fù)吹吸3次?5次混勻。

7.3.3從第1孔吸取0.025mL抗原或病毒液加人第2孔.混勻后吸取0.025mL加人第3孔.進(jìn)行2倍系列稀釋至第11孔.從第11孔吸取0.025mL棄去。第12孔為PBS對(duì)照孔。

5

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7.3.4毎孔加0.025mL?BS。

7.3.5每孔加人0.025ml1%（體積分?jǐn)?shù)）鴉紅細(xì)胞懸液。

7.3.6結(jié)果判定。輕扣反應(yīng)板混合反應(yīng)物.室溫（約20’C）靜置40min，環(huán)境溫度過(guò)髙時(shí)可在4t條件下靜置60min,^對(duì)照孔的紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時(shí)判定結(jié)果。判定時(shí)，將反應(yīng)板傾斜60觀察紅細(xì)胞有無(wú)淚珠狀流淌.完全無(wú)淚珠樣流淌（100%凝集）的最髙稀釋倍數(shù)判為血凝效價(jià)。

7.4HI試驗(yàn)（微量法）試撿步驟

7.4.1根據(jù)HA試驗(yàn)測(cè)定的效價(jià)配制4個(gè)血凝單位（即4HAU）的病毒抗原。4HAU抗原應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果調(diào)整準(zhǔn)確。

示例：如果血凝的終點(diǎn)滴變?yōu)? =64（EP1:64）;取PBS6.3mL,加抗原

0.1mL.即通過(guò)1:64稀釋獲得#.將配制的4HAU抗原進(jìn)行系列稀釋?zhuān)Q終稀釋度為1!2J|^1' 和1:7。取，加人PBS0.025mL,再加人

min，如果配制的抗原液為集終點(diǎn)；如果高于4HAU,可能1|5或1:6為_(kāi)<如于4HAU,可能1:2或

log:

1%雞紅細(xì)胞懸液凝板在室溫（約20’C）條件下靜置41

4HAU，則1>4

1，3為終點(diǎn)?/ /

7.4.2第1 孔加人0.025mLPBS.第12孔加人0.05mLPBS作為炎白

7.4.3第l/加A"0.025mL血清（鴨、的jfa濟(jì)車(chē)

PBS充分者勻漆取0.】|驗(yàn)抒2孔，依次2

11孔作5

7.4.43

60mino

7.4.5?

4?C60!

7.4.6名

2log2），

4HAU抗J

效價(jià)不髙于

吋建i義進(jìn)行頂處埋,_見(jiàn)_

釋至第W孔.從第10孔吸觀.

f第1孔血清與

6mL棄去。第

充原曩照。

某亞型禽流感q

價(jià)不髙于118U

其他病毒檢測(cè)方法

第112加入1IHA'

\0.025 分?jǐn)?shù)〉雞

對(duì)照孔~孔、呈盧扣狀吋解定

氣抗原對(duì)照孔（第ii孔）寵全凝彙.且與性對(duì)照血清抗體紋&血清抗_玫價(jià)與a知效

種釋倍數(shù)判為該盧清的hi抗體效價(jià)，用丁檢測(cè)擾體.

t體抑制.HI效價(jià)不低于1|16（24或4log2）時(shí)^^為陰性，對(duì)于疑似H5亞型等抗原性

8禽流感病毒RT-PCR試驗(yàn)

8.1適用范圍

抗原.在章街（約20r）下

胞鉍液蕩混

<約20?<

3i

i爺?shù)巫儠r(shí).試齄方我

抗體效價(jià).用T檢

適用于檢測(cè)禽組織、分泌物、排泄物、雞胚培養(yǎng)物等物質(zhì)中禽流感病毒核酸。

min或4"C

IS40min或

iSF1:4（2、或蜷以完全抑制淸時(shí)，HI抗體I測(cè)抗原.能夠被

用

陽(yáng)性；HI抗體效

f差別的病毒，應(yīng)結(jié)合

8.2儀器設(shè)備

8.2.1PCR擴(kuò)增儀及配套反應(yīng)管。

8.2.2髙速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（離心速度不低于12000r/min）。

8.2.3n級(jí)生物安全柜。

8.2.4微童移液器（5gL、10pL、100ML、1000gL）及配套吸頭與1.5mL離心管。

8.2.5電泳儀。

8.2.6電泳槽。

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8.2.7紫外凝膠成像儀。

8.3試劑

8.3.1推薦的禽流感病埠RT-PCR引物序列.參見(jiàn)附錄D。

8.3.2RT-PCR反應(yīng)液.配方參見(jiàn)附錄E的E.1。

8.3.3無(wú)核酸酶水，配方參見(jiàn)E.2。

8.3.4無(wú)水乙醇。

8.3.5陰性對(duì)照為SPF雞胚尿囊液。

8.3.6陽(yáng)性對(duì)照為滅活的相應(yīng)亞型禽流感病毒胚培養(yǎng)物。

8.4RNA提取

可選市售商品化RNA提取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

8.5RT-PCR操作

取2.5（約250ng）提取的RNA加人RT-PCR反應(yīng)液中，置于PCR儀中.循環(huán)參數(shù)為：45’C逆轉(zhuǎn)錄45min；94'C預(yù)變?生2min;94.C30s、52-C45s、68‘C45s，35個(gè)循環(huán)；最后68'C延伸8min。

8.6電泳

PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

8.7結(jié)果判定

在陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)相,3擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照無(wú)此擴(kuò)增帶時(shí)判定結(jié)果。出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)増片段時(shí).判定為核酸檢測(cè)陽(yáng)性，否則判定為陰性。

9禽流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試驗(yàn)

9.1適用范圍

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR適用于檢測(cè)禽組織、分泌物、排泄物、雞胚尿囊液等物質(zhì)中禽流感病毒核酸。9.2儀器設(shè)備

9.2.1熒光PCR儀。

9.2.2其余器材同8.2.2?8.2.4。

9.3試劑及引物探針序列

推薦的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR引物探針序列參見(jiàn)附錄F的F.1。

9.4樣本核酸的提取

可選市售商品化RNA提取試劑盒.按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

9.5實(shí)時(shí)熒光RT-PCR操作

9.5.1實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)増?jiān)噭┑臏?zhǔn)備與配飼

宜在專(zhuān)門(mén)的反應(yīng)混合物配制區(qū)配制實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增試劑。根據(jù)需要檢測(cè)的樣品數(shù).按推薦

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的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)液配方（參見(jiàn)F.2）配制反應(yīng)液.充分混勻后分裝，毎個(gè)反應(yīng)管15mL。轉(zhuǎn)移反應(yīng)管至樣本制備區(qū)。

9.5.2加樣

宜在專(zhuān)門(mén)的樣本制備區(qū)進(jìn)行。在9.5.1配好的反應(yīng)管中分別加入9.4中制備的RNA溶液5mL（約500ng）.使每管總體積達(dá)到20ML，記錄反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的樣品編號(hào)。蓋緊管蓋后，500r/min離心30s。

9.5.3實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)設(shè)定

宜在專(zhuān)門(mén)的檢測(cè)區(qū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)。將9.5.2中加樣后的反應(yīng)管放人實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)儀內(nèi)，編輯樣品表后，選定與探針標(biāo)記熒光基團(tuán)相符合的檢測(cè)通道讀取熒光信號(hào)值，淬滅基團(tuán)選擇none。推薦的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)定參見(jiàn)F.3。

9.6結(jié)果判定

9.6.1結(jié)果分析條件設(shè)定

綜合分析儀器讀取的各項(xiàng)數(shù)據(jù)及擴(kuò)增曲線，設(shè)定合理的閾值（threshold）和基線（baseline）,使儀器顯示正確的結(jié)果。

9.6.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照檢測(cè)通道讀取數(shù)據(jù)無(wú)Ct值或Ct值＞35并且無(wú)特征性擴(kuò)增曲線。

陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)通道讀取數(shù)據(jù)出現(xiàn)特征性擴(kuò)增曲線，且Ct值應(yīng)＜30。

如陰性和陽(yáng)性對(duì)照不滿足以上條件.此次試驗(yàn)視為無(wú)效。

9.6.3結(jié)果描述及判定

若測(cè)定樣品Ct值＜30,判為所用引物探針禽流感病毒特定型或亞型核酸陽(yáng)性。

若測(cè)定樣品30＜Ct值＜35.判為可疑。重復(fù)測(cè)定后仍在可疑區(qū)間的樣本判為陽(yáng)性。若測(cè)定樣品無(wú)Ct值或Ct值＞35,判為陰性。

10綜合判定

10.1疑似

出現(xiàn)4.23.3中的情況，初步判為商致病性禽流感臨床疑似病例，若其H5或H7亞型的RT-PCR或?qū)崟r(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性.可判為髙致病性禽流感疑似病例。

10.2確診

病毒分離物經(jīng)HA和HI試驗(yàn)確定為流感病毒.且分離物的IVPI值大于1.2,判定為高致病性禽流感病毒；如果IVPI值小于1.2的H5或H7亞型禽流感病毒.在HA裂解位點(diǎn)處具有與HPAI病毒相似的氨基酸序列?亦判定為髙致病性禽流感病毐。分離到髙致病性禽流感病毐的病例判定為卨致病性禽流感確診病例。

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附錄A

（規(guī)范性附錄）

試驗(yàn)所用溶液和1%雞紅細(xì)胞的配制

A.1樣品稀釋液

樣品稀釋液的配制方法如下：

a） A液：0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液。NaH2PO4?H2O27.6g.溶于蒸餾水中.最后定容至1000mL。

b） B液,0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液.N&HPCX.7H,053.6g，或Na2HPO4.12H:O71.6g或Na2HPO4?2H,035.6g，加蒸餾水溶解.最后定容至1000mL.

c） 0.01mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）（含抗生索和穩(wěn)定劑）的配制。取A液14mL.B液36mL,加NaCl8.5g,用蒸餾水定容至1000mL。經(jīng)121?（：士2rjSmin髙壓滅菌.冷卻后.無(wú)菌條件下分別加入青霉索2000U/mL、鏈?zhǔn)Y索（2mg/mL）、慶大霉素（50Mg/mL）、霉菌抑制索（1000U/mL）和牛血清白蛋白（5mg/mL）。

上述抗生素濃度宜用于組織和咽喉拭子.如果用作糞便和泄殖腔拭子的緩沖液.抗生索濃度可提髙5儕。

A.2阿氏(Alsevers)液配制

稱(chēng)取葡萄糖2.05g,擰橡酸鈉0.8g、擰檬酸0.055g、氣化納0.420g,加蒸餾水至100mL,散熱溶解后調(diào)pH值至6.1.69kPa15min髙壓滅蘭，4‘C保存?zhèn)溆谩?/p>

A.3 1%雞紅細(xì)胞懸液

采集至少三只SPF雞或無(wú)禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合.用pH7.2的0.01mol/LPBS洗滌3次.每次均以1000r/min離心10min.洗滌后用PBS配成1%（體積分?jǐn)?shù)）紅細(xì)胞懸液.4T保存?zhèn)溆谩?/p>

A.4pH1mol/LPBS的配制

pH7.2,0.01mol/LPBS的配制方法如下：

a） 配制25XPB,稱(chēng)量2.74g磷酸氫二鈉和0.79g磷酸二氫鈉加蒸餾水至100mL。

b） 配制1XPBS:量取40mL25XPB,加人8.5g孰化鈉，加蒸餾水至1000mL。

c） 用氫氧化衲或鹽酸調(diào)pH至7.2。

d） 滅菌或過(guò)濾。

e） PBS-經(jīng)使用，于4’C保存不超過(guò)3周。

附錄B

(資料性附錄)

高致病性禽流感病毒IVPI測(cè)定試驗(yàn)

B.1試驗(yàn)雞

6周齡SPF雞，10只。

B.2接種材料

感染雞胚的尿囊液，血凝價(jià)在1:16(24或4log2)以上.未混有任何細(xì)菌、霉菌、支原體或其他病毒。

B.3接種方法

將感染雞胚尿囊液用PBS1：10稀釋?zhuān)?.1mL/羽的劑量翅靜脈接種。每日觀察每只雞的發(fā)病及死亡情況，連續(xù)觀察10d。

B.4記錄方法

根據(jù)每只雞的癥狀用數(shù)字方法毎天進(jìn)行記錄：正常雞記為0,病雞記為1，重病雞記為2,死雞記為3。病雞和重病雞的判斷主要依據(jù)臨床癥狀表現(xiàn).一般而言，“病雞”表現(xiàn)有下述一種癥狀.而“重病雞”則表現(xiàn)下述多個(gè)癥狀.如呼吸癥狀、沉郁、腹瀉、雞冠和/或肉髯發(fā)紺、臉和/或頭部腫脹、神經(jīng)癥狀。列舉1個(gè)假設(shè)試驗(yàn)來(lái)說(shuō)明IVPI的計(jì)算方法,參見(jiàn)表B.1和公式(B.1)。

表B.1假設(shè)髙致病性禽流感病毒致病性試驗(yàn)記錄結(jié)果

臨床癥狀

第1天

第2天

第3天

第4天

第5天第6天

第7天

第8天

第9天

第10天

分類(lèi)總計(jì)

得分

正常(a=0)

10

5

3

3

2

1

0

0

0

0

24

0

病雞(6=1)

0

0

0

0

C

0

0

0

0

0

0

0

重病雞(c=2)

0

5

2

0

1

1

1

0

0

0

10

20

死亡(rf=3)

0

0

5

1

7

8

9

10

10

10

66

198

總計(jì)

一

—

—

—

—

100

218

注1:當(dāng)IVPI值大于1.2時(shí)，判定分離株為髙致病性禽流感病毒(HPAIV)。

注2:本試驗(yàn)中IVPI=(0+0+20+198)/100=2.18>1.2,因此，本試驗(yàn)中的分離株為HPAIV.

B.5IVPI值計(jì)算

IVPI值計(jì)算參見(jiàn)公式(B.1):

#

GB/T18936—2020

SaX0+S6Xl+xX2+2rfX3*VA1 —〒

式中：

2,-10d累計(jì)正常雞數(shù)；

——10d累計(jì)病雞數(shù)；

——10d累計(jì)重病雞數(shù)；

L——10d累計(jì)死雞數(shù)；

T—10d累計(jì)記錄10只雞的總次數(shù).即100。

B.6判定標(biāo)準(zhǔn)

為髙致病性禽流1

B.6.1當(dāng)IVPI值大于為髙致病性禽流病

的序列分析，如果氨毒。

B.6.2氣IVPI值小H7亞型的禽流感病毒應(yīng)進(jìn)行

基酸序列同其他髙^毒相似.被檢測(cè)的分離物應(yīng)被視為髙致

GB/T18936—2020

附錄C

（資料性附錄）

血清非特異性凝集和非特異性抑制因子的處理方法

C.1非特異性凝集因子的處理

有些禽類(lèi)血清（如水餺、鴿）可能對(duì)雞紅細(xì)胞產(chǎn)生非特異性凝集，可先用待檢血清做HA試驗(yàn).如果待檢血清出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象.則說(shuō)明有非特異凝集因子存在.宜用雞紅細(xì)胞對(duì)待檢血清進(jìn)行吸附.具體方法為：毎0.5mL血消中加人0.025mL50%雞紅細(xì)胞，輕搖后靜置至少30min.800g離心2min~

5min,收集上清液（處理后的血清）。用上清液進(jìn)行HI試驗(yàn)時(shí).需設(shè)處理陽(yáng)性血清對(duì)照?；蛘呖捎门c待檢血清宿主來(lái)源相同的1%紅細(xì)胞懸液進(jìn)行HA和HI試驗(yàn)。

C.2非特異性抑制因子的處理

C.2.1胰酶一加熱一離碘酸鹽法

利用胰酶一加熱一髙碘酸鹽法處理非特異性抑制因子的操作如下：

a） 取0.3mL血淸.加0.15mL狹海溶液（8mg/mL：200mg的P-250胰酶溶解于25mL的0.01mol/L,pH值7.0?7.2的PBS中，混勻，過(guò)濾除歯.分裝并在一15C以下保存.保存期6個(gè)月）.混勻后，在56’C水浴滅活30min后冷卻至室溫。

b） 再加人0.9mL髙碘酸鉀（將230mgKIO4用0.01mol/L.pH值7.0-7.2的PBS定容至

100mL，過(guò)濾除謝后避光室溫保存.保存期1周），混合，室溫孵育15min。

c） 再加人0.9mL的丙三醇鹽溶液（1mL丙三醇加人99mL的0.01mol/L,pH值7.0-7.2的PBS中.混勻.過(guò)濾除菌.室溫保存），混合，室溫孵育15min。

d） 最后加人0.75mL生理鹽水.混勻.WC保存?zhèn)溆?處理后的血清最終為10倍稀釋的血清。

C.2.2受體破壞?（KDE:處理法

利用RDE處理法處理非特異性抑制因子的操作如下：

a） 取1體積血清（50ML），加4體積RDE（200mL），37_C水浴18h（過(guò)夜〉。

b） 再加人5體積（250ML）的1.5%濃度的擰檬酸鈉.混勻.置56’C水浴30min（以破壞殘余的RDE活性）。

c） 將1體積的50%的紅細(xì)胞加人到10體積RDE處理的血清中（50ML紅細(xì)胞+500ML血清），振蕩混勻后4_C放置1h,期間可輕輕搖勻懸浮紅細(xì)胞數(shù)次。

d） 1000g離心10min,小心吸取上層上清，用于檢測(cè)。處理后的血清最終為10倍稀釋的血清。

C.2.3處理非特異性抑制因子后血清HI試驗(yàn)方法

處理后血清HI試驗(yàn)方法如下：

a） 第2孔?第11孔加人0.025mLPBS.第12孔加人0.05mLPBS作為空內(nèi)對(duì)照。

b） 第1孔、第2孔加人處理后的血清0.025mL.第2孔血清與PBS充分混勻后吸0.025mL于第3孔.依次2倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025mL棄去。第11孔為抗原對(duì)照。

c） 第1孔?第11孔均加人0.025mL4HAU抗原，在室溫（約20?（：）下靜S40min或4C

11

GB/T18936—2020

60mino

d） 毎孔加人0.025mLl%（體積分?jǐn)?shù)〉雞紅細(xì)胞懸液.震蕩混勻，在室溫（約20’C）下靜置40min或4-C60min,對(duì)照孔紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時(shí)判定結(jié)果。

e） 結(jié)果判定。氣陰性對(duì)照血清抗體效價(jià)不髙于1:10,陽(yáng)性對(duì)照血清抗體效價(jià)與巳知效價(jià)誤差不超過(guò)1個(gè)滴度時(shí).試驗(yàn)方可成立。以完全抑制4HAU抗原的最商血清稀釋倍數(shù)判為該血清的HI抗體效價(jià)。被檢血清HI抗體效價(jià)低于1|10判為陰性.不低于1:10判為陽(yáng)性。

附錄D

（資料性附錄＞

禽流感病番RT-PCR試驗(yàn)用引物

采用普通RT-PCR方法開(kāi)展禽流感檢測(cè).可根據(jù)檢測(cè)目的基因不同選擇引物（參見(jiàn)表D.1〉。表D.1禽流感病毒RT-PCR試驗(yàn)可選擇的引物

引物名稱(chēng)

引物序列

5'-~3'

長(zhǎng)度

bp

擴(kuò)増目的基因

M-229U

TTCTAACCGAGGTCGAAAC

229

M

M-229L

AAGCGTCTACGCTGCAGTCC

H5-372U

GGAATATGGTAACTGCAACACCA

372

H5

H5-372L

AACTGAGTGTTCATTTTGTCAATG

H7-501U

AATGCACARGGAGGAGGAACT

501

H7

H7-501L

TGAYGCCCCGAAGCTAAACCA

H9-273U

TGTGTCTTACGATGGGACAAGCA

273

H9

H9-273L

TTGACAAGAGGCCTTGGTCCTAT

N1-358U

ATTRAAATACAAYGGYATAATAAC

358

N1

N1-358L

GTCWCCGAAAACYCCACTGCA

N2-377U

GTGTGYATAGCATGGTCCAGCTCAAG

377

N2

N2-377L

GAGCCYTTCCARTTGTCTCTGCA

N9-203U

ATAATGAAACAAACATCACCAA

203

N9

N9-2O3L

AGCATAGAACCTCCATTCATCT

注：W=(AT)，Y=(CT);R=(AG)。

GB/T18936—2020

附錄E

（資料性附錄）

RT-PCR反應(yīng)液配制

E.1RT-PCR反應(yīng)體系

毎個(gè)RT-PCR反應(yīng)體系包括的組分參見(jiàn)表E.l?

表E.1RT-PCR反應(yīng)液配方

組分

1個(gè)檢測(cè)體系的加入最

5X反S緩沖液

5.0

10mmol/LdNTP

0.5

15mmo/L氯化鎊

1.0

20pmo!上游引物

0.5

20pmo下游引物

0.5

AMV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/ML)

0.5

TaqDNA聚合酶(5U/ML)

0.5

無(wú)核酶滅菌水

14.0

E.2無(wú)核酸曲水

將DEPC加入去離子水中至終濃度為0.1%,充分混合均勻后作用12h，分裝，（121士2VC髙壓滅菌30min,冷卻后冷藏備用。

附錄F

（資料性附錄）

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR引物探針序列及反應(yīng)液配方

F.1引物和探針

采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法開(kāi)展禽流感檢測(cè).可根據(jù)檢測(cè)目的基因參見(jiàn)表F.1提供的序列合成引物和探針，純度為HPLC級(jí).用RNase-Free滅菌水溶解并稀釋至終濃度10Mmol/L,—20"C保存?zhèn)溆谩１鞦.1禽流感病番實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試驗(yàn)可選擇的引物和探針

引物和探針名稱(chēng)

序列

(5'-3')

M上游引物

GACCRATCCTGTCACCTCTGAC

M下游引物

AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA

M探針

TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG

H5上游引物

AGGGAGGATGGCAGGGAATG

H5下游引物

TCTTTGTCTGCAGCGTACCCACT

H5探針

ATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATG

H7上游引物

CTAATTGATGGTTGGTATGGTTTCA

H7下游引物

AATTGCC：GATTGAGTGCTTTT

H7探針

CAGAATGCACAGGGAGAGGGAACTGCT

N6上游引物

TGCAGGATGTTTGCTCTGAGTC

N6下游引物

CGAAATGGGCTCCTATCATGTAT

N6探針

ACA