第二章生物化學(xué)

1、 第二章第二章 沉沉 淀淀 法法 基本原理基本原理制備蛋白質(zhì)制備蛋白質(zhì)制備核酸制備核酸n根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度溶解度不同不同而達(dá)到分離的目的，通過沉淀，將目而達(dá)到分離的目的，通過沉淀，將目的生物大分子轉(zhuǎn)入固相沉淀或留在液的生物大分子轉(zhuǎn)入固相沉淀或留在液相，而與雜質(zhì)得到初步的分離。相，而與雜質(zhì)得到初步的分離。第一節(jié)第一節(jié) 基本原理基本原理 中性鹽沉淀（鹽析法）中性鹽沉淀（鹽析法）: :多用于多用于蛋白質(zhì)和酶蛋白質(zhì)和酶 有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑沉淀：多用于核酸，也用于蛋白質(zhì)多用于核酸，也用于蛋白質(zhì) 選擇性沉淀選擇性沉淀：熱變性及酸堿變性沉淀法熱變性及酸堿變性沉淀法 非離子多

2、聚物沉淀法非離子多聚物沉淀法：聚乙二醇，用于生物大分子聚乙二醇，用于生物大分子 常用的幾種沉淀方法：常用的幾種沉淀方法：第二節(jié)第二節(jié) 制備蛋白質(zhì)制備蛋白質(zhì) 鹽析法鹽析法 有機(jī)溶劑法有機(jī)溶劑法 選擇性沉淀法選擇性沉淀法 聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法 沉淀法沉淀法 一、鹽析法一、鹽析法n 概念：概念：在溶液中加入在溶液中加入大量的大量的中性鹽使生物大分子中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為沉淀析出的過程稱為“鹽析鹽析”。 n基本原理：基本原理：中性鹽奪走水分子，破壞了水膜，暴露中性鹽奪走水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域；同時又中和了電荷，破壞了親水膠體；出疏水區(qū)域；同時又中和了電荷，破壞了親水膠

3、體；n分級沉淀：分級沉淀：調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度，可以使不同的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。如：蛋白質(zhì)分別沉淀。如：制備蛋白質(zhì)制備蛋白質(zhì)血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白( (nhnh4 4) )2 2soso4 450%50%飽和度飽和度飽和飽和析出析出析出析出1、基本原理、基本原理2 2、鹽析鹽析突出的優(yōu)點(diǎn)突出的優(yōu)點(diǎn) 成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。 操作簡單、安全。操作簡單、安全。 對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。 鹽析法鹽析法3.影響鹽析的因素影響鹽析的因素n蛋白濃度：高濃度的蛋白質(zhì)，可以節(jié)約蛋白濃度：高濃度的

4、蛋白質(zhì)，可以節(jié)約鹽的用量，但蛋白質(zhì)濃度過高，會發(fā)生鹽的用量，但蛋白質(zhì)濃度過高，會發(fā)生嚴(yán)重的共沉淀作用。在低濃度的蛋白質(zhì)嚴(yán)重的共沉淀作用。在低濃度的蛋白質(zhì)溶液中鹽析，用鹽量較多，共沉淀少。溶液中鹽析，用鹽量較多，共沉淀少。一般一般2.5%-3.0%2.5%-3.0%的蛋白質(zhì)濃度較適中。的蛋白質(zhì)濃度較適中。n離子強(qiáng)度：一般，離子強(qiáng)度越大，蛋白離子強(qiáng)度：一般，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低。在分離時，一般從低質(zhì)的溶解度越低。在分離時，一般從低離子強(qiáng)度到高離子強(qiáng)度順次進(jìn)行。離子強(qiáng)度到高離子強(qiáng)度順次進(jìn)行。影響鹽析的因素影響鹽析的因素nph ph 值：為提高鹽析效率，多將溶液值：為提高鹽析效率，多將溶液

5、phph調(diào)制目調(diào)制目的蛋白的等電點(diǎn)處。的蛋白的等電點(diǎn)處。注意：蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在注意：蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在水中或稀鹽溶液中與高濃度下測的結(jié)果不同。水中或稀鹽溶液中與高濃度下測的結(jié)果不同。根據(jù)實際情況調(diào)整根據(jù)實際情況調(diào)整n溫度：在低離子強(qiáng)度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度溫度：在低離子強(qiáng)度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加。但在高濃度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加。但在高濃度下，蛋白質(zhì)、酶和多肽類物質(zhì)的溶解度隨溫度下，蛋白質(zhì)、酶和多肽類物質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降。上升而下降。 在一般情況下，蛋白質(zhì)對鹽析溫度無特殊要求，在一般情況下，蛋白質(zhì)對鹽析溫度無特殊要求，可在室溫下進(jìn)行，只有某些對溫度比較敏

6、感的可在室溫下進(jìn)行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在酶要求在0-40-4進(jìn)行。進(jìn)行。4 4、鹽的選擇、鹽的選擇n負(fù)離子帶電荷較多者，鹽析能力較強(qiáng)，負(fù)離子帶電荷較多者，鹽析能力較強(qiáng)，如硫酸鈉的鹽析能力大于氯化鈉。正離如硫酸鈉的鹽析能力大于氯化鈉。正離子帶電荷較多者，鹽折能力較低，如硫子帶電荷較多者，鹽折能力較低，如硫酸鎂的鹽析能力小于硫酸銨。酸鎂的鹽析能力小于硫酸銨。n 鹽的選用還要考慮鹽的溶解度，如果鹽的選用還要考慮鹽的溶解度，如果溶解度低，在溶液中不能達(dá)到高濃度，溶解度低，在溶液中不能達(dá)到高濃度，其應(yīng)用就會受到限制。其應(yīng)用就會受到限制。常用的中性鹽是常用的中性鹽是硫酸銨硫酸銨優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 溶

7、解度大：溶解度大：（nh4nh4）2 2so4so4在在00時仍有時仍有70.670.6的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類。它鹽類。 分離效果好：分離效果好：有的提取液加入有的提取液加入適量硫酸銨適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去鹽析，一步就可以除去7575的雜蛋白，純的雜蛋白，純度提高了四倍。度提高了四倍。 有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。 價格便宜，廢液不污染環(huán)境。價格便宜，廢液不污染環(huán)境。缺點(diǎn)：需脫鹽缺點(diǎn)：需脫鹽鹽析法鹽析法硫酸銨溶液飽和度計算硫酸銨溶液飽和度計算n固體法固體法 g= g表示在一升溶液中需加入固體硫酸銨的克數(shù)；表示在一升溶液中需加入固體硫酸

8、銨的克數(shù)；s2：表示要達(dá)到的百分飽和度，：表示要達(dá)到的百分飽和度，s1表示原溶液表示原溶液中的百分飽和度。中的百分飽和度。 硫酸銨溶液飽和度計算表（表硫酸銨溶液飽和度計算表（表2-2）p25n飽和溶液法飽和溶液法533(s1-s2)100-0.3s2（20） 鹽析曲線制作鹽析曲線制作p26若生物材料來源容易，主要考慮提高純化若生物材料來源容易，主要考慮提高純化倍數(shù)時，選擇倍數(shù)時，選擇48%-65%48%-65%鹽飽和分級范圍，鹽飽和分級范圍，則純化倍數(shù)可達(dá)則純化倍數(shù)可達(dá)3.03.0，而收得率僅為，而收得率僅為75%75%。若生物材料來源困難，主要考慮提高收得若生物材料來源困難，主要考慮提高收得

9、率時，則選擇率時，則選擇45%-75%45%-75%鹽飽和分級范圍鹽飽和分級范圍, ,則收得率可達(dá)則收得率可達(dá)80%80%，而純化倍數(shù)將小于，而純化倍數(shù)將小于2.42.4。 透析法：透析法：將半透膜制成袋狀，將生物大分子將半透膜制成袋狀，將生物大分子樣品溶液置入袋內(nèi)，將此透析袋浸入水或緩樣品溶液置入袋內(nèi)，將此透析袋浸入水或緩沖液中，樣品溶液中的大分子量的生物大分沖液中，樣品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋內(nèi)，而鹽和小分子物質(zhì)不斷擴(kuò)子被截留在袋內(nèi)，而鹽和小分子物質(zhì)不斷擴(kuò)散透析到袋外，直到袋內(nèi)外兩邊的濃度達(dá)到散透析到袋外，直到袋內(nèi)外兩邊的濃度達(dá)到平衡為止。平衡為止。 4 4、脫鹽、脫鹽鹽析法

10、鹽析法透析法透析法透析袋（半透膜）透析袋（半透膜）蛋白質(zhì)溶液蛋白質(zhì)溶液蒸餾水（透蒸餾水（透析液）析液）透析n透析袋的選擇與處理：透析袋的選擇與處理：n透析液的選擇：低離子強(qiáng)度的中性緩沖液。對透析液的選擇：低離子強(qiáng)度的中性緩沖液。對含輔基的酶透析時，在透析液中宜加入適量的含輔基的酶透析時，在透析液中宜加入適量的輔基或保護(hù)輔基的試劑。輔基或保護(hù)輔基的試劑。n透析時間：攪拌情況下，樣品液與透析體積之透析時間：攪拌情況下，樣品液與透析體積之比宜比宜1 1：1010，3 3小時可達(dá)平衡。小時可達(dá)平衡。 靜止?fàn)顟B(tài)進(jìn)行時，樣品液與透析體積之比宜靜止?fàn)顟B(tài)進(jìn)行時，樣品液與透析體積之比宜1 1：2020，過夜。，

11、過夜。脫鹽是否徹底，要經(jīng)常檢查。脫鹽是否徹底，要經(jīng)常檢查。二、有機(jī)溶劑沉淀法二、有機(jī)溶劑沉淀法n基本原理：基本原理：一方面，與鹽溶液一樣有脫水作用。一方面，與鹽溶液一樣有脫水作用。n 另一方面，能降低溶液的介電常數(shù)。另一方面，能降低溶液的介電常數(shù)。 溶劑的極性與其介電常數(shù)密切相關(guān)，極性越大，溶劑的極性與其介電常數(shù)密切相關(guān)，極性越大，介電常數(shù)越大，如介電常數(shù)越大，如2020時水的介電常數(shù)為時水的介電常數(shù)為8080，而乙，而乙醇和丙酮的介電常數(shù)分別是醇和丙酮的介電常數(shù)分別是2424和和21.421.4，因而向溶液，因而向溶液中加入有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑中加入有機(jī)溶劑能降低溶液的介電

12、常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，增加了蛋白質(zhì)分子間的相互作用，導(dǎo)致互作用力，增加了蛋白質(zhì)分子間的相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。制備蛋白質(zhì)制備蛋白質(zhì)有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法n優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：分辨能力比鹽析法高分辨能力比鹽析法高 沉淀不用脫鹽，過濾比較容易。沉淀不用脫鹽，過濾比較容易。n缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：對某些具有生物活性的大分子容對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活。易引起變性失活。 有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法n有機(jī)溶劑的選擇：有機(jī)溶劑的選擇： 首先是要首先是要能與水互溶。能與水互溶

13、。 沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。乙醇、甲醇和丙酮。 沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀劑是淀劑是乙醇。乙醇。1 1）利用表面活性劑）利用表面活性劑( (三氯乙酸三氯乙酸) )或有機(jī)溶劑引起或有機(jī)溶劑引起變性；變性；2 2）利用對熱的不穩(wěn)定性）利用對熱的不穩(wěn)定性, ,加熱破壞某些組分，而加熱破壞某些組分，而保存另一些組分；保存另一些組分；3 3）酸堿變性。）酸堿變性。例如：例如：從酵母菌細(xì)胞中純化醇脫氫酶從酵母菌細(xì)胞中純化醇脫氫酶 采用了采用了改變溫度改變溫度的選擇性沉淀法的選擇性沉淀法三、選擇性沉淀法三、選擇性沉淀法

14、制備蛋白質(zhì)制備蛋白質(zhì)4 4、聚乙二醇沉淀法、聚乙二醇沉淀法n聚乙二醇聚乙二醇(polyethylene glycol,peg) (polyethylene glycol,peg) n實驗表明沉淀作用較滿意的聚合物是分子質(zhì)量在實驗表明沉淀作用較滿意的聚合物是分子質(zhì)量在4004006000da6000da之間的聚乙二醇。之間的聚乙二醇。 n優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)： 操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。 沉淀效能高。沉淀效能高。 沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。制備蛋白質(zhì)制備蛋白質(zhì)第三節(jié)第三節(jié) 制備核酸制備核酸 制備核酸時，需要先將制備核酸時，需要先將d

15、nadna蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)（dnpdnp）或或rnarna蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)（rnprnp）復(fù)合物進(jìn)行復(fù)合物進(jìn)行解聚解聚，設(shè)，設(shè)法法除去蛋白質(zhì)和糖除去蛋白質(zhì)和糖等雜質(zhì)，然后再通過等雜質(zhì)，然后再通過沉淀沉淀法法得到核酸。得到核酸。沉淀法沉淀法 制備核酸制備核酸去污劑去污劑n加入適量的加入適量的陰離子去污劑陰離子去污劑（十二烷基硫酸鈉（十二烷基硫酸鈉sdssds），復(fù)合物解聚，釋放核酸。），復(fù)合物解聚，釋放核酸。n加入適量加入適量醋酸鉀醋酸鉀溶液，使溶液，使sds-sds-蛋白質(zhì)復(fù)合物沉蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀。淀。有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑n利利用用酚、氯仿的混合液酚、氯仿的混合液作蛋白質(zhì)的變性劑。作蛋白質(zhì)的變性劑。蛋

16、白水解酶蛋白水解酶1 1、dnp/rnpdnp/rnp復(fù)合物的解聚、除去蛋白質(zhì)復(fù)合物的解聚、除去蛋白質(zhì) 多糖多糖 采用采用選擇性沉淀劑選擇性沉淀劑如異丙醇、十六烷基三甲基溴化銨如異丙醇、十六烷基三甲基溴化銨（ctabctab） dna與與rna的分離的分離n鹽析法：鹽析法：dnadna在在1 12mol/l nacl2mol/l nacl溶液中，溶解度較大；溶液中，溶解度較大； 0.14 mol/l nacl0.14 mol/l nacl溶液中，溶解度極??；溶液中，溶解度極??； rnarna在在0.14 mol/l nacl0.14 mol/l nacl溶液中溶解。溶液中溶解。n酶水解法：酶水

17、解法：在提取在提取dnadna時，可采用時，可采用rnasernase水解水解rnarna雜質(zhì)。雜質(zhì)。反之，在提取反之，在提取rnarna時，可采用時，可采用dnasednase水解雜質(zhì)水解雜質(zhì)dnadna。制備核酸制備核酸 2 2、多糖等雜質(zhì)的消除、多糖等雜質(zhì)的消除 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑n乙醇鹽溶液乙醇鹽溶液dnadna：0.1 mol/l nacl0.1 mol/l nacl溶液和溶液和2 2倍體積冷無水乙醇倍體積冷無水乙醇 rnarna：0.1 mol/l nacl0.1 mol/l nacl溶液和溶液和2.52.5倍體積冷無水乙醇倍體積冷無水乙醇 n異丙醇異丙醇dnadna或大分子或大分子

18、rrnarrna：0.3mol/l naac0.3mol/l naac和和0.540.541 1倍體倍體積的異丙醇積的異丙醇 制備核酸制備核酸 3 3、核酸的沉淀核酸的沉淀 核酸的沉淀核酸的沉淀聚乙二醇聚乙二醇n加加聚乙二醇聚乙二醇0.5mol/l nacl0.5mol/l nacl溶液到核酸溶液溶液到核酸溶液中，可使中，可使2kb2kb的的dnadna片段沉淀出來。片段沉淀出來。n聚乙二醇的濃度與聚乙二醇的濃度與dnadna片段的分子質(zhì)量成反比。片段的分子質(zhì)量成反比。 1.65kb 1.65kb的的dnadna，用，用5 5pegpeg； 1.2kb1.2kb的的dnadna，用，用6 6pegpeg； 0.6kb0.6kb的的dnadna，用，用7 7