第11章基因工程與體外表達(dá)

1、第十一章第十一章基因工程與基因體外表達(dá)基因工程與基因體外表達(dá)重組重組dna技術(shù)定義技術(shù)定義重組重組dna技術(shù)是按照人們的意愿，在體外對技術(shù)是按照人們的意愿，在體外對dna分子進(jìn)行重組，再將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使其分子進(jìn)行重組，再將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使其在細(xì)胞中擴增、繁殖以獲得在細(xì)胞中擴增、繁殖以獲得dna分子的大量拷貝。分子的大量拷貝。 所謂克隆是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親所謂克隆是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體。由于重組代完全相同的子代群體。由于重組dna技術(shù)實驗技術(shù)實驗是對基因操作，故又稱為基因克隆或是對基因操作，故又稱為基因克隆或dna克隆，克隆，同時由于這

2、類克隆在分子水平上操作，又稱為分子同時由于這類克隆在分子水平上操作，又稱為分子克隆?？寺?。重組重組dna技術(shù)的重大意義技術(shù)的重大意義n重組dna技術(shù)填平了生物種屬間不可逾越的鴻溝；n重組dna技術(shù)縮短了進(jìn)化時間；n重組dna技術(shù)使人能對生物進(jìn)行定向改造。重組重組dnadna技術(shù)操作過程可形象歸納為技術(shù)操作過程可形象歸納為 分分分離目的基因分離目的基因 切切限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩篩選重組體篩選重組體 克隆基因的表達(dá)及檢測純化克隆基因的表達(dá)及檢測純化限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 是一類能識別和切割是一類能識別和切割d

3、nadna分子中特定堿基順分子中特定堿基順序的核酸水解酶序的核酸水解酶命名命名: :以限制性內(nèi)切酶來源的微生物學(xué)名進(jìn)行命以限制性內(nèi)切酶來源的微生物學(xué)名進(jìn)行命名。通常第一字母（大、斜）代表該酶的微生名。通常第一字母（大、斜）代表該酶的微生物物屬名屬名；第二三字母（小、斜）代表微生物的；第二三字母（小、斜）代表微生物的種名種名；第四個字母代表寄主菌的；第四個字母代表寄主菌的株或型株或型；類類：屬于復(fù)合功能酶，兼有修飾和切割dna兩 種功能，但識別、切割位點不一致；類類：有核酸內(nèi)切酶和甲基化酶功能，但在dna鏈上特異切割點在識別位點以外；類類：能識別切割雙鏈dna特異序列，產(chǎn)生特異的dna片段；限制

4、性核酸內(nèi)切酶的分類限制性核酸內(nèi)切酶的分類1、產(chǎn)生平末端、產(chǎn)生平末端：在識別順序的對稱軸上，對雙鏈dna同時切割。類內(nèi)切酶切割形成端口類型類內(nèi)切酶切割形成端口類型hindgtcgaccagctg2、產(chǎn)生產(chǎn)生5端突出的粘性末端端突出的粘性末端：在識別順序的雙側(cè)末端切割dna雙鏈，于對稱軸的5末端切割。bam hggatcccctagg53353、產(chǎn)生3端突出的粘性末端sacgagctcctcgag5335同功異源酶同功異源酶 來源不同的限制酶，識別順序相同，切割位點可以相來源不同的限制酶，識別順序相同，切割位點可以相同也可以不同，這些酶稱同也可以不同，這些酶稱同功異源酶同功異源酶。少數(shù)有特殊性質(zhì)的

5、少數(shù)有特殊性質(zhì)的型酶型酶ggatcccctaggggtaccccatgg bam hggatcccctaggggtaccccatggbstkpn asp718 有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割同，但切割dna后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為為同尾酶同尾酶。同尾酶同尾酶 ggatcc cctagg agatct tctagagcctag gatcc gatctag gatct a 這種酶識別位點與切割位點不一致，但其切割與識別位點距離是一定的，一般為10個堿基。遠(yuǎn)距離裂解酶遠(yuǎn)距離裂解酶可變酶可變酶 它們的識別序列中1個或幾個

6、核苷酸是可變的。一般識別序列大于6個堿基類限制性內(nèi)切酶操作注意事項類限制性內(nèi)切酶操作注意事項1、防止污染，限制酶的量不應(yīng)超過總量的10%。2、整個操作過程在0進(jìn)行，一般總是加完其他試劑后，最后加酶。3、酶應(yīng)分裝成小份存儲。4、當(dāng)dna需要兩種以上的酶切時，最好是使用同種緩沖液。(二二)重組重組dna技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割識別特異序列，切割dnadna連接酶連接酶催化催化dna中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使二酯鍵，使dna切口封合或使兩個切口封合或

7、使兩個dna分子或片段連接分子或片段連接dna聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cdna分子或片段連接分子或片段連接缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針dna序列分析序列分析填補填補3 末端末端klenow片段片段又名又名dna聚合酶聚合酶i大片段，具有完整大片段，具有完整dna聚合酶聚合酶i的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而無外切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cdna第二鏈合成，雙鏈第二鏈合成，雙鏈dna 3 末端標(biāo)記等末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成合成cdna替代替代dna聚合酶聚合酶i進(jìn)行填補，標(biāo)記或進(jìn)行填補，標(biāo)記或dna序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸

8、激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在在3 羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾基因克隆需要特定基因克隆需要特定dnadna載體載體 載體是攜帶靶載體是攜帶靶dna片段進(jìn)入宿主細(xì)胞，進(jìn)行擴增和表達(dá)片段進(jìn)入宿主細(xì)胞，進(jìn)行擴增和表達(dá)的工具。其本質(zhì)是的工具。其本質(zhì)是dna。用于克隆和擴增特定的。用于克隆和擴增特定的dna片段的片段的載體稱克隆載體，用于表達(dá)外源基因的稱為表達(dá)載體。載體稱克隆載體，用于表達(dá)外源基因的稱為表達(dá)載體。 載體應(yīng)具備以下特征：載體應(yīng)具備以下特征： 1. 至少有一個復(fù)制起點，因而至少可在一種生

9、物體中自主復(fù)至少有一個復(fù)制起點，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。制。 2. 至少應(yīng)有一個克隆位點，以供外源至少應(yīng)有一個克隆位點，以供外源dna插入。插入。 3. 至少應(yīng)有一個遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組至少應(yīng)有一個遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組dna分子分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞是否進(jìn)入宿主細(xì)胞1. 1. 質(zhì)粒質(zhì)粒 (plasmid)特點特點 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息, ,會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 質(zhì)粒是存在于細(xì)胞質(zhì)粒是存在于細(xì)胞染色體外的小型雙鏈染色體外的小型雙鏈dna分子分子,2-200kb之之間

10、間.本身含有復(fù)制功能本身含有復(fù)制功能的遺傳結(jié)構(gòu)的遺傳結(jié)構(gòu),能在宿主能在宿主細(xì)胞獨立自主進(jìn)行復(fù)制細(xì)胞獨立自主進(jìn)行復(fù)制,并在細(xì)胞分裂時并在細(xì)胞分裂時,保持保持恒定地傳給子代細(xì)胞恒定地傳給子代細(xì)胞.缺點缺點:該載體一般只能接受小于該載體一般只能接受小于15kb的外源的外源dna片段片段.插入插入 過大過大,會導(dǎo)致重組體擴增減慢會導(dǎo)致重組體擴增減慢,甚至插入片段先進(jìn)丟失甚至插入片段先進(jìn)丟失.質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體-pbr322 4.3kb多拷貝松弛型，內(nèi)含一個（ori)、一個抗氨芐青霉素（ampr ）和一個抗四環(huán)素（tetr ）標(biāo)記基因，在ampr 中有兩個內(nèi)切酶位點（psti、pvui)，在tetr 中有

11、三個內(nèi)切酶位點（ecorv、bamhi、sali)。目目 錄錄puc系列質(zhì)粒是由系列質(zhì)粒是由pbr322質(zhì)粒中的氨芐青抗性基因、質(zhì)粒中的氨芐青抗性基因、復(fù)制起始點與大腸桿菌復(fù)制起始點與大腸桿菌lacz基因片段改建而成的基因片段改建而成的.1）抗性標(biāo)記基因抗性標(biāo)記基因 a. 抗生素抗性基因抗生素抗性基因: apr ，tcr ，kanr， b. 重金屬抗性基因重金屬抗性基因: cur ，znr ，cd r c. 代謝抗性基因代謝抗性基因: 抗除草劑基因抗除草劑基因2）營養(yǎng)標(biāo)記基因營養(yǎng)標(biāo)記基因 主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因，成酶類的

12、基因， 這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如如trp1，ura3，leu2，his4等。等。標(biāo)記基因的種類標(biāo)記基因的種類3）生化標(biāo)記基因生化標(biāo)記基因 其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如laczlacz。 半乳糖苷酶基因有半乳糖苷酶基因有1021 aas1021 aas，基因產(chǎn)物不具，基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：兩部分：鏈和鏈和鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時，才會表半乳糖苷酶

13、活性；只有當(dāng)兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為-互補作用互補作用。這兩個部分。這兩個部分可獨立存在，可獨立存在， 分別由兩個基因編碼。為分別由兩個基因編碼。為鏈編碼的基鏈編碼的基因稱之為因稱之為laczlacz( (編碼編碼145 aas)145 aas)。這兩個基因（。這兩個基因（laczlacz和和laczlacz）均可作為標(biāo)記基因。）均可作為標(biāo)記基因。 p lacz lacz 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 翻譯翻譯 lacz基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物puc18 bamhi片段片段重組重組dnadna分子分子 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化e.colie.coli 外源外源dna dna b

14、ambamhihi片段片段 涂布在含涂布在含x-gal和和ap的平板上的平板上,白色菌落為重組白色菌落為重組子，子，蘭色菌落蘭色菌落為為原載體原載體利用利用lacz基因篩選重組子基因篩選重組子重組dnaamprtcs提取dna 電泳ampramprampramprtcrtcrtcamprtcstcs轉(zhuǎn)化 無菌落陽性菌落篩選重組子2)dna重組無dna插入有dna插入外源dna1)限制酶切篩選重組子的示意圖篩選重組子的示意圖apraprapr轉(zhuǎn)化篩選重組子 白色菌落2)dna重組無dna插入有dna插入外源dna重組dna提取dna 電泳apraprapr1)限制酶切利用菌落顏色篩選重組子利用菌

15、落顏色篩選重組子 噬菌體是一類細(xì)菌病毒噬菌體是一類細(xì)菌病毒,有雙鏈?zhǔn)删w和單鏈?zhǔn)删w兩大類有雙鏈?zhǔn)删w和單鏈?zhǔn)删w兩大類.前者為前者為噬菌體類噬菌體類,后者包括后者包括m13噬菌體和噬菌體和f1噬菌體噬菌體. 噬菌體由于能夠攜帶外源噬菌體由于能夠攜帶外源dna較大較大,而且感染能力也大于質(zhì)粒而且感染能力也大于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌的能力轉(zhuǎn)化細(xì)菌的能力,所以所以噬菌體一直被作為基因組文庫和噬菌體一直被作為基因組文庫和cdna文庫文庫的克隆載體的克隆載體. m13噬菌體曾被廣泛用于制備單鏈?zhǔn)删w曾被廣泛用于制備單鏈dna以進(jìn)行以進(jìn)行dna序列分析序列分析和體外定點突變和體外定點突變.自從自從dna測序列儀和

16、測序列儀和pcr技術(shù)出現(xiàn)技術(shù)出現(xiàn),代替代替m13噬菌噬菌體在測序和定點突變中應(yīng)用體在測序和定點突變中應(yīng)用.目前用于克隆和測序用的目前用于克隆和測序用的puc載體就載體就是利用質(zhì)粒和是利用質(zhì)粒和m13噬菌體改造成的噬菌體改造成的.2. 噬菌體噬菌體(phage) 載體載體噬菌體載體噬菌體載體 噬菌體是感染大腸桿菌的溶源性噬菌體，在感染宿主后噬菌體是感染大腸桿菌的溶源性噬菌體，在感染宿主后可進(jìn)入溶源狀態(tài)，也可進(jìn)入裂解循環(huán)。噬菌體基因組為長度可進(jìn)入溶源狀態(tài)，也可進(jìn)入裂解循環(huán)。噬菌體基因組為長度為為 48.5kb 48.5kb 的雙鏈的雙鏈 dna dna 分子，在噬菌體顆粒內(nèi)，基因組分子，在噬菌體顆

17、粒內(nèi)，基因組 dna dna 呈線性，其兩端的呈線性，其兩端的 5 5 末端帶有末端帶有 1212個堿基的互補單鏈（粘性個堿基的互補單鏈（粘性末端），末端）， 12 12 個堿基的序列為個堿基的序列為 5-gggcggcgacct-35-gggcggcgacct-3。當(dāng)噬菌。當(dāng)噬菌體體 dna dna 進(jìn)入宿主細(xì)胞后，其兩端互補單鏈通過堿基配對形成進(jìn)入宿主細(xì)胞后，其兩端互補單鏈通過堿基配對形成環(huán)狀環(huán)狀 dna dna 分子，噬菌體可選擇進(jìn)入裂解生長狀態(tài)或者進(jìn)入溶分子，噬菌體可選擇進(jìn)入裂解生長狀態(tài)或者進(jìn)入溶源狀態(tài)。源狀態(tài)。這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段稱為這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段稱為c

18、os位點位點噬菌體基因組全長噬菌體基因組全長48.5kb,48.5kb,至少可編碼至少可編碼 6060多個基因，它多個基因，它們的分布和排列與其功能有一定關(guān)系，根據(jù)執(zhí)行功能的們的分布和排列與其功能有一定關(guān)系，根據(jù)執(zhí)行功能的不同可將基因組分為三個區(qū)。不同可將基因組分為三個區(qū)。左邊區(qū)域左邊區(qū)域: :其產(chǎn)物用于噬菌體其產(chǎn)物用于噬菌體 dna dna 的包裝和噬菌體顆粒的包裝和噬菌體顆粒的形成，的形成，中間區(qū)域中間區(qū)域: :編碼基因調(diào)節(jié)、溶源狀態(tài)的發(fā)生和維持以及編碼基因調(diào)節(jié)、溶源狀態(tài)的發(fā)生和維持以及遺傳重組所需要的基因，其中許多基因?qū)α呀馍L是非遺傳重組所需要的基因，其中許多基因?qū)α呀馍L是非必須的，

19、在構(gòu)建載體時可以去掉，用外源必須的，在構(gòu)建載體時可以去掉，用外源 dna dna 片段替片段替代。中間區(qū)域占總基因組全長的代。中間區(qū)域占總基因組全長的40%.40%.右邊區(qū)域右邊區(qū)域: :包含噬菌體復(fù)制和裂解宿主菌所必須的基因。包含噬菌體復(fù)制和裂解宿主菌所必須的基因。 這樣利用噬菌體基因組中大約這樣利用噬菌體基因組中大約40%40%非必需區(qū)域，從非必需區(qū)域，從而插入外源而插入外源dnadna，成為置換型載體。插入，成為置換型載體。插入dnadna大小為大小為9-9-23kb23kb, ,只有重組的噬菌體基因組只有重組的噬菌體基因組dnadna在野生型的在野生型的75-105%75-105%之間

20、之間, ,才能被包裝成噬菌體顆粒才能被包裝成噬菌體顆粒. . 同時同時, ,如無外源如無外源dnadna取代取代, ,由于噬菌體基因組太小由于噬菌體基因組太小, ,而而不能包裝不能包裝, ,這可以做了挑選重組噬菌體的陽性標(biāo)志。這可以做了挑選重組噬菌體的陽性標(biāo)志。代表性代表性噬菌體載體噬菌體載體gt10 載體載體:可攜帶6kb的外源基因 利用該載體攜帶有c基因，其表達(dá)的阻遏蛋白，可使噬菌體以溶源狀態(tài)生活，故形成混濁噬菌斑。同時載體攜帶的基因 c 內(nèi)的 ecor 位點，可用于外源 dna 片段的插入。重組后的 gt10 變?yōu)?c-， c基因不表達(dá)，重組噬菌體可使大腸桿菌形成透明斑點。插入型載體插入

21、型載體：gt10 載體、 gt11 載體置換型載體置換型載體：embl3 和 embl4gt11 載體載體： 該載體最大的特點是在最左側(cè)可替代區(qū)置換了一段 lacz 基因，可編碼 b-半乳糖苷酶，在 iptg/x-gal 平板上形成蘭色噬菌斑。 同時lacz 基因編碼區(qū)終止密碼子之前有一個 ecor 位點，可用于外源 dna 片段的插入，篩選時，在 lac- 宿主菌中非重組噬菌斑為蘭色。當(dāng)外源 dna 片段與 lacz 的閱讀框相吻合時，可表達(dá)出融合蛋白，可用免疫學(xué)方法篩選陽性重組子。置換型載體可攜帶9-23kb外源基因這兩個載體大小為 43kb ，其左臂、右臂和填充片段的大小分別為 20kb

22、、 9kb 和 14kb 。圖 3-12 是其結(jié)構(gòu)示意圖。從提高克隆效率角度來看，它們克隆 dna 片段的大小為 9-23kb 。在填充片段中帶有 red 和 gam 基因，當(dāng)外源片段替換填充片段后，重組體將變成 red-gam- ，同時載體上含有 chic 位點，因此可用 p2 噬菌體的溶源性大腸桿菌進(jìn)行 spi 篩選重組體。 野生型 噬菌體在帶有 p2 原噬菌體的溶源性 e.coli 中 的生長會受到限制的表型，稱作 spi+ ，即對 p2 噬菌體的干擾敏感（sensitive to p2 interference）。如果 噬菌體缺少兩個參與重組的基因 red 和 gam ，同時帶有 ch

23、i 位點，并且宿主菌為 rec + ，則可以在 p2 溶源性 e.coli 中生長良好，噬菌體的這種表型稱作 spi- 。因此，通過噬菌體載體 dna 上的 red 和 / 或 gam 基因的缺失或替換，可在 p2 噬菌體溶源性細(xì)菌中鑒別重組和非重組噬菌體。spi 篩選粘性質(zhì)粒粘性質(zhì)粒 是指含有入噬菌體粘性末端的雜種質(zhì)粒。由入dna c o s區(qū)與質(zhì)粒重組建造而成.在宿主細(xì)胞中可以作為正常噬菌體進(jìn)行復(fù)制，但不表達(dá)噬菌體的任何功能。cosmid的構(gòu)造特點:(1)(1)含有抗藥標(biāo)志和自主復(fù)制起始部位含有抗藥標(biāo)志和自主復(fù)制起始部位。(2)(2)一個或多一個或多個單一酶的限制位點。個單一酶的限制位點。

24、(3)(3)帶有入噬菌體粘性末端帶有入噬菌體粘性末端。這一末端是體外包裝系統(tǒng)必不可少的成分，所以它可以像入噬菌體一樣進(jìn)行體外包裝。(4)(4)分子小，約分子小，約4 46kb6kb，可容納大至40-50kb的外源dna片段。適用于構(gòu)建真核細(xì)胞的基因文庫特。另外，由于非重組體cosmid很小，不能在體外包裝,因此非重組體的本底很低，利于重組克隆的篩選?？妓官|(zhì)粒的優(yōu)點考斯質(zhì)粒的優(yōu)點1) 能象-dna一樣體外包裝，并高效導(dǎo)入受體細(xì)胞2) 可以裝載比質(zhì)?；?dna大得多的外源dna片段，如cos區(qū)及附近順序長為1.7 kb，質(zhì)粒長為3.3kb，則該考斯質(zhì)粒最大可裝載46.5kb的外源dna。3) 由于

25、攜帶質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，便于篩選4) 由于質(zhì)粒上的多種單一酶切位點，便于克隆。m13 m13 噬菌體噬菌體m13 噬菌體的基因組為單鏈 dna ，由 6407 的堿基組成。 m13 噬菌體感染細(xì)菌后，其基因組經(jīng)過復(fù)制轉(zhuǎn)變成雙鏈，稱為復(fù)制型，復(fù)制型m13在細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)積累到100-200后，dna合成變得不對稱，只有其中一條鏈進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生大量單鏈dna，并被包裝成成熟的噬菌體顆粒，從細(xì)胞中排出。最為顯著的優(yōu)點是它能使插入的外源dna片段變成單鏈。用途：（1）用于雙脫氧末端終止測定dna順序（2）用于單鏈dna的定點誘變（3）用于合成探針m13m13噬菌體作為載體的優(yōu)點及用途噬菌體作為載體的優(yōu)點及用

26、途整合型（整合型（integratedintegrated）載體）載體：即外源基因通過這種病毒載體與宿主細(xì)胞的染色體整合，外源基因隨宿主細(xì)胞基因組的復(fù)制而擴增。這類載體的代表是 sv40psv系列和逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體plpghl、pmsv 等。游離型游離型(transient)(transient)或稱病毒顆粒型載體或稱病毒顆粒型載體，這類載體攜帶外源基因后，本質(zhì)上仍然是一種完整或缺損的病毒，能夠以病毒顆的形式在宿主內(nèi)自行復(fù)制或在輔助病毒存在下進(jìn)行復(fù)制。這類載體有痘苗病毒、腺病毒、桿狀病毒。病毒載體病毒載體表達(dá)載體表達(dá)載體 指用來在受體細(xì)胞中表達(dá)外源基因的指用來在受體細(xì)胞中表達(dá)外源基

27、因的載體稱為載體稱為表達(dá)載體表達(dá)載體。表達(dá)載體除具有克隆。表達(dá)載體除具有克隆載體所具備的性質(zhì)外，還帶有轉(zhuǎn)錄和翻譯載體所具備的性質(zhì)外，還帶有轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的所必需的dnadna序列。根據(jù)受體細(xì)胞不同，序列。根據(jù)受體細(xì)胞不同，表達(dá)載體多種多樣，如原核表達(dá)載體、真表達(dá)載體多種多樣，如原核表達(dá)載體、真核表達(dá)載體。核表達(dá)載體。原核表達(dá)載體原核表達(dá)載體在原核表達(dá)載體中除含有復(fù)制起始點、抗性基因、多克隆位點等與克隆載體一樣之處外，還必需含有啟動子、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止序列等表達(dá)元件。（一）、啟動子（一）、啟動子啟動子是dna鏈上一段能與rna聚合酶結(jié)合并起始rna合成的序列，它是基因表達(dá)不可缺少的重要

28、調(diào)控序列。開始轉(zhuǎn)錄開始轉(zhuǎn)錄t t g a c aa a c t g t-35 區(qū)區(qū)(pribnow box)t a t a a t a t a t t a-10 區(qū)區(qū)1-30-5010-10-40-205 3 3 5 原核生物保守序列原核生物保守序列rna-pol辨認(rèn)位點辨認(rèn)位點(recognition site) 5 5 rna聚合酶保護(hù)區(qū)聚合酶保護(hù)區(qū)結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因3 3 全酶全酶原核表達(dá)系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的啟動子有l(wèi)ac(乳糖啟動子)、trp(色氨酸啟動子)、tac(乳糖和色氨酸的雙啟動子) 、 pl( 噬菌體的左向啟動子)、t7噬菌體啟動子等。 1、乳糖啟動子結(jié)構(gòu)示意圖capcam

29、pipozya結(jié)構(gòu)基因區(qū)（信息區(qū)）rna pol調(diào)控區(qū)調(diào)控區(qū) i-調(diào)節(jié)基因p-啟動子o-操縱基因（op有一定的重疊）cap結(jié)合位點結(jié)構(gòu)基因z-半乳糖苷酶基因（ -galactosidase）y-半乳糖苷透酶（乳糖透酶）（ -galotoside porinerase）a-硫代半乳糖轉(zhuǎn)乙?；福╰rans acetylase） 2、色氨酸啟動子、色氨酸啟動子3、trp-lac啟動子（啟動子（tac啟動子）啟動子）tac啟動子是由trp啟動子加上lac操縱子中的操縱元件、和sd序列融合而成。整個啟動子受lac阻遏蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)，它的啟動能力比lac和trp都強。4 4、 pl啟動子：啟動子：lpl啟

30、動子受控于溫度敏感的阻遏物cits857。在低溫(30)時，cits857阻遏蛋白可阻遏pl啟動子轉(zhuǎn)錄。在高溫(42)時，cits857蛋白失活，阻遏解除，促使pl啟動子轉(zhuǎn)錄。5、t7噬菌體啟動子噬菌體啟動子它是來自t7噬菌體的啟動子，具有高度的特異性，只有t7rna聚合酶才能使其啟動，其轉(zhuǎn)錄效率非常高。但要注意用這種啟動子時宿主中必須含有t7rna聚合酶，如jm109。（二）、（二）、sdsd序列序列- -是外源基因在原核是外源基因在原核 細(xì)胞翻譯必需的細(xì)胞翻譯必需的 在在mrnamrna起始起始augaug密碼上游約密碼上游約8 8到到1313核苷酸部位核苷酸部位, ,存在一個存在一個4

31、4到到9 9個核苷酸的一致序列個核苷酸的一致序列:aggagg:aggagg我們稱我們稱s-ds-d序列序列, ,而在小亞基而在小亞基16s-rrna316s-rrna3端有一富含端有一富含uccuccuccucc序列序列, ,通過與通過與mrnamrna的的s-ds-d序列結(jié)合，使序列結(jié)合，使mrnamrna與小亞基結(jié)合與小亞基結(jié)合. .（三）、轉(zhuǎn)錄終止序列（三）、轉(zhuǎn)錄終止序列保證外源基因保證外源基因 高效表達(dá)高效表達(dá) 在原核表達(dá)載體中，如果載體中沒有轉(zhuǎn)錄終止序在原核表達(dá)載體中，如果載體中沒有轉(zhuǎn)錄終止序列，也可以表達(dá)某基因的蛋白產(chǎn)物，但并非所有外源列，也可以表達(dá)某基因的蛋白產(chǎn)物，但并非所有外

32、源蛋白質(zhì)的表達(dá)都可獲得滿意效果，所以多數(shù)表達(dá)載體蛋白質(zhì)的表達(dá)都可獲得滿意效果，所以多數(shù)表達(dá)載體中都帶有轉(zhuǎn)錄終止序列。中都帶有轉(zhuǎn)錄終止序列。真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體適合在真核細(xì)胞適合在真核細(xì)胞 中表達(dá)外源基因中表達(dá)外源基因如果將真核基因放入原核細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生蛋白質(zhì)時，原核系統(tǒng)就表現(xiàn)出許多缺陷：沒有真核轉(zhuǎn)錄后加工的功能，不能進(jìn)行mrna的剪接，所以只能表達(dá)cdna而不能表達(dá)真核的基因組基因；沒有真核翻譯后加工的功能，表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，不能進(jìn)行糖基化、磷酸化等修飾，難以形成正確的二硫鍵配對和空間構(gòu)像折疊，因而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)常沒有足夠的生物學(xué)活性；表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，會在細(xì)菌內(nèi)聚集成包涵體（inc

33、lusiion body），尤其當(dāng)表達(dá)目的蛋白量超過細(xì)菌體總蛋白量10%時，就很容易形成包涵體。 要表達(dá)真核生物的蛋白質(zhì)，采用真核表達(dá)系統(tǒng)自然應(yīng)比原核系統(tǒng)優(yōu)越，常用的酵母、昆蟲、動物和哺乳類細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)。真核表達(dá)載體至少要含兩類序列：原核質(zhì)粒的序列原核質(zhì)粒的序列，包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制起始序列、能用在細(xì)菌中篩選克隆的抗藥性基因標(biāo)志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大腸桿菌系統(tǒng)中篩選獲得目的重組dna克隆、并復(fù)制繁殖得到足夠使用的數(shù)量。在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)重組基因所需要的元件，在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)重組基因所需要的元件，包括啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止和加poly-a信號序列、mrna剪

34、接信號序列、能在宿主細(xì)胞中復(fù)制或增殖的序列，能用在宿主細(xì)胞中篩選的標(biāo)志基因、以及供外源基因插入的單一限制性內(nèi)切酶識別位點等。第三節(jié)第三節(jié) dnadna重組技術(shù)過程重組技術(shù)過程1、制備目的基因和相關(guān)載體2、將目的基因和有關(guān)載體進(jìn)行連接3、將重組本dna導(dǎo)入受體細(xì)胞4、dna重組體的篩選和鑒定5、dna重組體的擴增、表達(dá)和其他研究目的基因序列的來源和分離目的基因序列的來源和分離一、一、基因組基因組dna文庫文庫采用限制性內(nèi)切酶將基因組dna切成片段，每一片段都與一個載體分子拼接成重組體dna，將所有重組體dna分子都引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴增，得到分子克隆的混合體，這樣一個混合體稱為基因文庫。二、二、

35、cdnacdna文庫文庫將某一時間某一種類細(xì)胞中所有的cdna的混合體與載體進(jìn)行連接，使每一個cdna分子都與一個載體分子拼接成重組dna，將所有重組dna分子引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴增，得到分子克隆的混合體稱為cdna文庫。三、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（三、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr）ta克隆系統(tǒng)由invitrogen公司（san diego，ca）發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，它用于pcr產(chǎn)物的克隆和測序。其原理是利用taq酶能夠在pcr產(chǎn)物的3末端加上一個非模板依賴的a，而t載體是一種帶有3t突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把pcr產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點（mcs）中 。四、人工化

36、學(xué)合成四、人工化學(xué)合成二、載體的選擇與制備二、載體的選擇與制備 噬菌體和粘性質(zhì)粒適用于構(gòu)建基因組文庫，puc系列等質(zhì)粒適合構(gòu)建cdna文庫和克隆一些較小的dna片段，m13噬菌體則用于克隆一些待測序的dna片段。 選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點。如果構(gòu)建的目的基因是要表達(dá)的，則要選擇合適的表達(dá)載體。三、重組體的連接三、重組體的連接1、粘性末端的連接2、利用人工接頭連接3、加入同聚物尾連接4、平端連接四、將重組體四、將重組體dna分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞1、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化指將質(zhì)粒或其它外源dna導(dǎo)入感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過程。2、感染、感染

37、以噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組dna分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適當(dāng)細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴增。3、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染指真核細(xì)胞主動攝取或被動導(dǎo)入外源dna片段而獲得新的表型的過程。轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染方法：1、磷酸鈣共沉淀法2、電穿孔法3、deae-葡聚糖法4、脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染5、顯微注射法四、重組四、重組dna導(dǎo)入細(xì)胞后的篩選與鑒定導(dǎo)入細(xì)胞后的篩選與鑒定1 1、采用遺傳學(xué)方法篩選特定的重組、采用遺傳學(xué)方法篩選特定的重組dnadna(1) 抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補救標(biāo)志補救(marker rescue)( (插入失活法插入失活法) )抗藥性標(biāo)記選

38、擇抗藥性標(biāo)記選擇目目 錄錄組氨酸缺陷組氨酸缺陷型大腸桿菌型大腸桿菌無組氨酸無組氨酸的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成促進(jìn)組氨酸合成dnadna重組體重組體標(biāo)志補救標(biāo)志補救目目 錄錄若克隆基因的表達(dá)產(chǎn)物與宿主菌的營養(yǎng)缺陷互補,那么就可以利用營養(yǎng)突變菌株進(jìn)行篩選,這就是標(biāo)志補救. 互互補補的的檢檢測測目目 錄錄2、免疫學(xué)方法、免疫學(xué)方法利用特異性抗體檢測表達(dá)產(chǎn)物利用特異性抗體檢測表達(dá)產(chǎn)物3 3、核酸雜交法篩選特定、核酸雜交法篩選特定dnadna雞的雞的肌球蛋白的克隆和免疫學(xué)檢測方法肌球蛋白的克隆和免疫學(xué)檢測方法目目 錄錄原原位位雜雜交交目目 錄錄so

39、uthern印跡印跡目目 錄錄4 4、pcrpcr技術(shù)對特定技術(shù)對特定dnadna進(jìn)行直接鑒定進(jìn)行直接鑒定5 5、利用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜鑒定、利用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜鑒定dnadna hmlck重組質(zhì)粒酶切圖譜分析1未酶切質(zhì)粒 2. ecor酶切 3. hind 酶切 4ecor/hind 雙酶切 5. 250bpdna ladder1、利用tk-細(xì)胞突變株進(jìn)行篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞的抗性標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞的抗性標(biāo)記篩選tk-細(xì)胞tk+細(xì)胞hat培養(yǎng)液不能存活能存活a：氨基蝶呤是核苷酸從頭合成的抑制物，h：次黃嘌呤可以作為補救合成datp、dctp 的底物t：胸苷它必需在tk（胸苷激酶）作用下生成胸苷一

40、磷酸。2、藥物篩選：新霉素抗性基因g418是一種氨基糖苷類抗生素 ,它的結(jié)構(gòu)和新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，它干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成,對原核和真核等細(xì)胞產(chǎn)生毒素 。當(dāng)neo基因（新霉素抗性基因）被整合進(jìn)真核細(xì)胞dna后 , 獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶,使細(xì)胞獲得抗性而能在含有418的選擇性培養(yǎng)基中生長。第五節(jié)第五節(jié) 利用重組利用重組dnadna技術(shù)可對技術(shù)可對 基因進(jìn)行改造基因進(jìn)行改造基因定點誘變基因定點誘變 指將基因的某一個或某些位點進(jìn)行人工替換或刪除的過程,稱為基因定點誘變. 1、 通過基因定點誘變可以改變蛋白質(zhì)編碼序列的個別密碼子，可以改造蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功

41、能； 2、 通過改變具有調(diào)控功能的序列，可以確定dna特定的功能區(qū)域； 3、 構(gòu)建新的載體或嵌合基因。一、帶突變位點的寡核苷酸可介導(dǎo)定點誘變一、帶突變位點的寡核苷酸可介導(dǎo)定點誘變二、二、kunkelkunkel法法三、三、pcrpcr技術(shù)適合進(jìn)行基因的定點誘變技術(shù)適合進(jìn)行基因的定點誘變55335533abcd5335變性、退火5533加klenow dna聚合酶5353加入引物a、d5353353利用基因定點誘變可改變基因工程蛋白的特性利用基因定點誘變可改變基因工程蛋白的特性自然界的蛋白質(zhì)常具有一定的可塑性，當(dāng)某種蛋白質(zhì)中的一些氨基酸被改變或刪除后，其理化性質(zhì)發(fā)生了改變，但仍能保存其原有生物活

42、性同時一些蛋白質(zhì)相互融合后仍保持各自成分的活性因此，通過基因突變而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的改變是可行的、定點誘變可制備長效胰島素、定點誘變可制備長效胰島素將人胰島素鏈位的改為，將鏈羧基端氨基化和鏈位改為后，其胰島素的等電點從移至，在生理條件下結(jié)晶，從而延遲吸收其在血漿中的半衰期可延長至小時、定點誘變可制備快速吸收的胰島素、定點誘變可制備快速吸收的胰島素 胰島素在治療糖尿病時，吸收非常慢，在注射后胰島素在治療糖尿病時，吸收非常慢，在注射后1。5至至2小小時，體內(nèi)胰島素還未達(dá)到高峰，而且在時，體內(nèi)胰島素還未達(dá)到高峰，而且在3-5小時后，其水平仍繼小時后，其水平仍繼續(xù)上升。續(xù)上升。 決定胰島素在注射部位吸收速度決定于胰島素結(jié)合狀態(tài)。決定胰島素在注射部位吸收速度決定于胰島素結(jié)合狀態(tài)。胰島素在體內(nèi)吸收是以單體形式吸收的。而普通的胰島素在中性胰島素在體內(nèi)吸收是以單體形式吸收的。而普通的胰島素在中性情況下多數(shù)是與鋅結(jié)合成六聚體，單體形式非常少。情況下多數(shù)是與鋅結(jié)合成六聚體，單體形式非常少。 研究發(fā)現(xiàn)多聚體之間形成與其研究發(fā)現(xiàn)多聚體之間形