Hela細(xì)胞傳代培養(yǎng)PPT課件

1、第1頁/共37頁培 養(yǎng) 板第2頁/共37頁 常用玻璃器皿清洗 浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時(shí)）、 流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50烘干第3頁/共37頁清潔液的配制第4頁/共37頁 HeLa 是Henrietta Lacks的簡(jiǎn)稱，Henrietta Lacks 是一位患有子宮頸癌的美國婦女的名字，在她死后，該細(xì)胞走被廣泛散發(fā)到各研究機(jī)構(gòu)，并無限次地繁殖分裂下去。第5頁/共37頁細(xì)胞培養(yǎng)的甚本概念 傳代 細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時(shí)間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。 原代培養(yǎng) 取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。 第6頁/共37頁培養(yǎng)細(xì)胞的特性 貼附生

2、長：必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實(shí)體瘤細(xì)胞。 懸浮生長： 于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞。第7頁/共37頁每代貼附生長細(xì)胞的生長過程 游離期 貼壁期 潛伏期 對(duì)數(shù)生長期 停止期（平臺(tái)期）第8頁/共37頁游離期 細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮 狀態(tài)也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。 10分鐘一4小時(shí)第9頁/共37頁 貼壁期 細(xì)胞附著于底物上，游離期 結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時(shí)貼壁。 血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。

3、進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）第10頁/共37頁第11頁/共37頁第12頁/共37頁 潛伏期 此時(shí)細(xì)胞有生長話動(dòng)，而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為624小時(shí)。第13頁/共37頁 對(duì)數(shù)生長期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。第14頁/共37頁 停止期（平臺(tái)期） 細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂 機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性第15頁/共37頁第16頁/共37頁培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件 1 細(xì)胞的營養(yǎng)需要 2 細(xì)胞的生存環(huán)境 溫度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- 滲透壓 3 無污染 4 無毒第17頁/共37頁

4、CO2培養(yǎng)箱nCO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 。n使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題： 用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90 ，14 h)。n箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。第18頁/共37頁細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長的恃點(diǎn)，傳代方法有3種 1懸浮生長細(xì)胞傳代 離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l2一23，用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。 2.懸浮生長細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞） 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但

5、貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。 3.貼壁生長細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有的胰蛋白酶液。第19頁/共37頁2 細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制D-Hanks原液試劑配方 氯化鈉 80.0g 磷酸氫二鈉（Na HPO 2H O） 0.6g 氯化鉀 4.0g 磷酸二氫鉀 0.6g 三蒸水 1000ml D-Hanks工作液試劑配方D-Hanks原液 100ml 三蒸水 896ml 0.5% 酚紅液 4ml第20頁/共37頁 D-Hanks工作液試劑配方 D-Hanks原液 100ml 三蒸水 896ml 0.5% 酚紅液 4ml 第21頁/共37頁 消化液： 胰蛋白酶作用于與

6、賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。 胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是 。用濾器過濾除菌。 胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。 用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用 第22頁/共37頁培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限。 成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。 易

7、發(fā)生支原體污染 第23頁/共37頁合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。 成本低 缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。 第24頁/共37頁 人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。 第25頁/共37頁 血清中含有：多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子 激素； 促貼附物質(zhì)，如纖粘

8、蛋白、冷析球蛋白、膠原等。各種生長因子轉(zhuǎn)移蛋白不明成分第26頁/共37頁 一般說來含5小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死但支持細(xì)胞生長一般需加 10血清 對(duì)于血清支持細(xì)因生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚 血清中不僅存在促細(xì)胞生長因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。 在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞第27頁/共37頁 無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如激素、生長因子 、結(jié)合蛋白 、貼壁和擴(kuò)展因子

9、 等。 無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。 1975年，Sato首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株，近20多年來已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系在無血清培養(yǎng)基中成功地生長和增殖。 無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡(jiǎn)化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。第28頁/共37頁 向無清培養(yǎng)液中能促進(jìn)細(xì)胞系生長的補(bǔ)加物都是獨(dú)特的。適用于某種細(xì)胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細(xì)胞株的生長。即使同源組織的不同細(xì)胞株，所需補(bǔ)加物也不同。 無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。 目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時(shí)還需添加血清 第29頁/共37頁 血清質(zhì)量好壞

10、是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。 常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。 優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。 血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30 分鐘 血清的消毒：過濾除菌第30頁/共37頁 抗菌素的使用： 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。 慶大霉素：每毫升100單位方便、廣譜、穩(wěn)定第31頁/共37頁完全培養(yǎng)基的組成 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80一95 血清 5一20（一般加10） 碳酸氫鈉 2.0 g/L 青、鏈霉

11、素 各100卑位毫升第32頁/共37頁實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 培養(yǎng)基的配置RPMI-1640培養(yǎng)粉 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素 各100單位毫升加三蒸水 至 1000ml, 過濾除菌。調(diào)節(jié)pH值至 加血清（終濃度 10）第33頁/共37頁消化液的配置 胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用Dhanks配置。 配制常用的胰蛋白酶液濃度是 。用濾器過濾除菌第34頁/共37頁實(shí)驗(yàn)步驟 1.打開超凈臺(tái)，把實(shí)驗(yàn)中所需用具放到超凈臺(tái)上。 2從冰箱中取出胰酶、DHanks、培養(yǎng)基。可以把胰酶和DHanks的瓶蓋打開或者擰松。 3.取待傳代的細(xì)胞，用尖吸管棄去舊的培養(yǎng)基，加入DHanks。輕輕搖動(dòng)后將Hanks棄掉。

12、 4.用尖吸管吸取適量胰酶加入，加入的量以覆蓋整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)面為宜，輕輕搖動(dòng)。25分鐘后迅速將消化液吸出。消化時(shí)間長短是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，寧可短消化，不能過消化。否則細(xì)胞會(huì)變死。在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞間間隙加大為消化適宜。第35頁/共37頁 5取培養(yǎng)基加入細(xì)胞，反復(fù)輕輕吹打培養(yǎng)皿壁，制備細(xì)胞細(xì)胞懸液。吹打的部位均勻，從上到小，從左到右，順序進(jìn)行吹打，保證各個(gè)部位的培養(yǎng)細(xì)胞均能吹打到，成片的細(xì)胞已經(jīng)分散成小的細(xì)胞團(tuán)或者單細(xì)胞便停止吹打。吹打時(shí)用力不要過猛，盡量不要出現(xiàn)氣泡，以免損傷細(xì)胞。 6至所有細(xì)胞從培養(yǎng)皿底部脫落下來，然后吸取至離心管中。1000 rpm離心5分鐘。（無需準(zhǔn)確計(jì)數(shù)時(shí)離心可略） 7細(xì)胞離心畢，尖吸管棄去上清，吸取培養(yǎng)