菌種的復(fù)壯與保藏

1、第二章第二章 菌種的退化、復(fù)壯與保藏菌種的退化、復(fù)壯與保藏第一節(jié) 菌種的退化和復(fù)壯一、菌種的退化（一）原因（一）原因v菌種保藏不妥菌種保藏不妥v菌種生長的條件要求沒有得到滿足菌種生長的條件要求沒有得到滿足v自身突變和自發(fā)突變自身突變和自發(fā)突變 （二）菌種退化的表現(xiàn) 生產(chǎn)性狀劣化，遺傳標(biāo)記丟失，原有的典型性生產(chǎn)性狀劣化，遺傳標(biāo)記丟失，原有的典型性狀變得不典型。狀變得不典型。v菌落及細(xì)胞形態(tài)的改變；菌落及細(xì)胞形態(tài)的改變；v生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越??；生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越??；v代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降；代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降；v抗不良環(huán)境條件（抗噬菌體，抗低溫）能力減抗不良環(huán)境條件（抗噬菌體，抗低

2、溫）能力減弱弱 總之，退化是發(fā)生在群體細(xì)胞中的一個(gè)從總之，退化是發(fā)生在群體細(xì)胞中的一個(gè)從量變到質(zhì)變的逐步演變過程，由于個(gè)別突量變到質(zhì)變的逐步演變過程，由于個(gè)別突變細(xì)胞表現(xiàn)生長優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致在群體中最后變細(xì)胞表現(xiàn)生長優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致在群體中最后數(shù)量占優(yōu)勢(shì)。數(shù)量占優(yōu)勢(shì)。（三）菌種退化的防治從菌種選育方面考慮從菌種選育方面考慮 1)盡量使用孢子或單核菌株 2)誘變處理后的菌株應(yīng)充分的分離純化，保證獲得菌株的純度。 控制傳代次數(shù)控制傳代次數(shù) 盡量避免不必要的移種和傳代，以減少細(xì)胞分裂過程中所產(chǎn)生的自發(fā)突變幾率。創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件 1)結(jié)構(gòu)類似物抗性菌株在保藏培養(yǎng)基中應(yīng)添加相應(yīng)藥物，及時(shí)淘汰回復(fù)

3、突變細(xì)胞。 2)基因工程菌添加抗生素于培養(yǎng)基中防止質(zhì)粒的丟失采用有效的菌種保藏方法采用有效的菌種保藏方法從菌種管理的措施上考慮從菌種管理的措施上考慮 菌種復(fù)壯菌種復(fù)壯 二、菌種的復(fù)壯二、菌種的復(fù)壯俠義的復(fù)壯俠義的復(fù)壯：菌種已經(jīng)發(fā)生衰退后，再通過純種分離和性能的測(cè)定等方法，從衰退的群體中找出尚未衰退的少數(shù)個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)該菌種原有典型性狀的一種措施。廣義的復(fù)壯廣義的復(fù)壯：一種積極的措施，即在菌種的生產(chǎn)性能尚未衰退前經(jīng)常有意識(shí)地進(jìn)行純種分離和生產(chǎn)性能的測(cè)定工作，使菌種地生產(chǎn)性能逐步提高。 對(duì)已衰退菌種配合一定培養(yǎng)條件進(jìn)行單細(xì)胞對(duì)已衰退菌種配合一定培養(yǎng)條件進(jìn)行單細(xì)胞分離純化分離純化 淘汰衰退的個(gè)體淘

4、汰衰退的個(gè)體 通過寄主體內(nèi)進(jìn)行復(fù)壯通過寄主體內(nèi)進(jìn)行復(fù)壯 改變培養(yǎng)條件改變培養(yǎng)條件 誘變劑處理誘變劑處理復(fù)壯措施方法復(fù)壯措施方法第二節(jié) 菌種的保藏一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件1 經(jīng)長期保藏后菌種存活健在；2 保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力。3 菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空。 世界上國際知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織承認(rèn)的法定保藏機(jī)構(gòu)有28家。ex：美國的標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏所（atcc） 美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)部（ars） 英國國立標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏所（nctc）我國：1 普通微生物菌種保藏管理中心（ccgmc） 2 農(nóng)業(yè)微

5、生物菌種保藏管理中心（accc） 3 工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（cicc） 4 醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（cmcc） 5 抗生素菌種保藏管理中心（cacc） 6 獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心 （cvcc）二、微生物菌種保藏技術(shù)二、微生物菌種保藏技術(shù)原理：根據(jù)微生物的生理生化特性，人為地創(chuàng)造原理：根據(jù)微生物的生理生化特性，人為地創(chuàng)造條件，使孢子或菌體處于代謝不活潑，生長繁殖條件，使孢子或菌體處于代謝不活潑，生長繁殖受到抑制的休眠狀態(tài)，以減少菌種的變異。一般受到抑制的休眠狀態(tài)，以減少菌種的變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平，缺氧狀可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平，缺氧狀態(tài)，干燥和低溫

6、等。態(tài)，干燥和低溫等。斜面保藏法穿刺保藏法沙土管干燥保藏法真空冷凍保藏法液氮保藏法懸滴保藏法低溫保藏法斜面保藏法 接種適宜斜面培養(yǎng)基 培養(yǎng)4保藏 適用：各大類 保藏期：36個(gè)月 缺點(diǎn)：保存期短，傳代多，易退化 點(diǎn)接：把菌種點(diǎn)接在斜面中部偏下方處。適用于擴(kuò)散型生長及絨毛狀氣生菌絲類霉菌（如毛霉、根霉等）。中央劃線：從斜面中央自下而上劃一直線。適用于細(xì)菌和酵母菌等。密波狀蜿蜒劃線法:從斜面底部自下而上劃密“之”字形線。能充分利用斜面獲得大量菌體細(xì)胞，適用于細(xì)菌和酵母菌等。挖塊接種法:挖取菌絲體連同少量培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔(dān)子菌類真菌。斜面接種法斜面接種法培養(yǎng)：培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)基

7、放入培養(yǎng)箱中，在適宜的條件下培養(yǎng)至細(xì)胞穩(wěn)定期或得到成熟孢子。細(xì)菌培養(yǎng)溫度一般為3037，真菌培養(yǎng)溫度一般為2528。保藏：保藏：培養(yǎng)好的菌種于46保存，根據(jù)要求每36個(gè)月移植一次。某些菌種，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，須13個(gè)月移植一次。保藏濕度用相對(duì)濕度表示，通常為50%70%。斜面菌種應(yīng)保藏相繼三代培養(yǎng)物以便對(duì)照，防止因意外和污染造成損失。 半固體穿刺保藏法 穿刺接種適宜半固體培養(yǎng)4保藏 適用：好氣性細(xì)菌，酵母等 保藏期：612個(gè)月 用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌體，從柱狀培養(yǎng)基中心自上而下刺入，至培養(yǎng)基的1/2處，待微生物生長良好后覆蓋23mm無菌液體石蠟.石蠟可防止培養(yǎng)基失

8、水又隔絕氧氣,降低代謝.但不適用于可以石蠟為碳源的微生物.如固氮菌、分枝桿菌等。 砂土管干燥保藏法 措施：無營養(yǎng)，缺氧，干燥 方法：孢子或芽孢懸液 加入無菌砂土管中 干燥 封口 5保藏 適用：產(chǎn)孢子的絲狀真菌、放線菌；有芽孢的細(xì)菌 保藏期：210年或更長河沙河沙60目篩目篩棄去大顆粒及雜質(zhì)棄去大顆粒及雜質(zhì)80目篩目篩去掉細(xì)沙去掉細(xì)沙吸鐵石吸鐵石吸去鐵質(zhì)吸去鐵質(zhì)1020的的 鹽酸浸泡鹽酸浸泡24h去除有機(jī)物去除有機(jī)物水洗至中性水洗至中性烘干或曬干烘干或曬干土：土：取地面下取地面下404060cm60cm非耕作層貧瘠且粘性較小的土，研碎，非耕作層貧瘠且粘性較小的土，研碎，100100目過篩目過篩,

9、 ,水洗至中性，烘干。水洗至中性，烘干。 將處理后的沙、土按質(zhì)量比將處理后的沙、土按質(zhì)量比2121混合。混勻的沙土分裝入安混合?；靹虻纳惩练盅b入安瓿管或小試管中，高度為瓿管或小試管中，高度為1cm1cm左右，塞好棉塞，左右，塞好棉塞，121121高壓間歇高壓間歇滅菌滅菌2323次，烘干備用。次，烘干備用。沙土管制作沙：沙： 向培養(yǎng)好的斜面培養(yǎng)物中注入35ml無菌水，洗下細(xì)胞或孢子制成菌懸液。用無菌吸管吸取菌懸液，均勻滴入沙土管中，每管0.20.5ml。放線菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。 真空抽去沙土管中水分。 將沙土管用火焰熔封后存放于低溫(46)干燥處保藏，每隔半年檢查一次菌種存活性及

10、純度。或?qū)⑸惩凉苤苯佑门Ｆぜ埢蛩芰霞埌?，置干燥器?nèi)保存。 保藏時(shí)間210年。無菌條件下打開沙土管，取部分沙土粒于適宜的斜面培養(yǎng)基上，長出菌落后再轉(zhuǎn)接一次?；蛉∩惩亮Ｓ谶m宜的液體培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)后再轉(zhuǎn)接斜面。沙土管恢復(fù)培養(yǎng)沙土管恢復(fù)培養(yǎng)真空冷凍干燥保藏法： 措施：低溫、干燥，缺氧，保護(hù)劑 方法：菌種培養(yǎng) 用保護(hù)劑懸浮 加入安醅管中低溫凍結(jié)（-25-40）抽真空 真空封口 4-5保藏適用：各大類保藏期：510年或更長基本程序 1安瓿管的處理 直徑直徑810mm，長度不小于，長度不小于100mm，洗凈高壓備用。，洗凈高壓備用。 2 保護(hù)劑 低分子和高分子化合物，如氨基酸、糖類、低分子和高分子化合

11、物，如氨基酸、糖類、蛋白質(zhì)等。常用的是脫脂奶和血清。蛋白質(zhì)等。常用的是脫脂奶和血清。 3 菌懸液制備 最適培養(yǎng)條件、最適培養(yǎng)條件、生長后期生長后期。產(chǎn)孢子的。產(chǎn)孢子的微生物須適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間以獲得成熟的孢子。一般細(xì)菌微生物須適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間以獲得成熟的孢子。一般細(xì)菌2448h2448h，酵母，酵母72h72h，放線菌和絲狀真菌，放線菌和絲狀真菌710d710d。 4 冷凍干燥 5 安瓿管的保藏 4-54-5保藏保藏復(fù)蘇方法： 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部， 將安瓿管頂部燒熱， 用無菌棉簽沾冷水，在頂部擦一圈，頂部出現(xiàn)裂紋，用挫刀或鑷子頸部輕叩一下，敲下已開裂的安瓿管的頂端， 用無菌水或培養(yǎng)液

12、溶解菌塊，使用無菌吸管移入新鮮培養(yǎng)基上，進(jìn)行適溫培養(yǎng)。安培瓶?jī)龈蓹C(jī) 液氮超低溫保藏法 措施：低溫、加保護(hù)劑（10%甘油、5%dmso） 方法：菌懸液 加入保護(hù)劑 分裝至安醅管中（0.2-1cm菌懸液）逐步降溫至-25液氮罐保藏 適用：范圍廣泛 保藏期： 一般23年，長則9年。菌種的準(zhǔn)備可采用下列幾種方法： 刮取培養(yǎng)物斜面上的孢子或菌體，與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi)； 接種液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)后取菌懸液與保護(hù)劑混合分裝于凍存管內(nèi)； 將培養(yǎng)物在平皿培養(yǎng)，形成菌落后，用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊（直徑約5-10毫米），真菌最好取菌落邊緣的菌塊，與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi)； 在小安瓿管中裝

13、1.2-2毫升的瓊脂培養(yǎng)基，接種菌種，培養(yǎng)2-10天后，加入保護(hù)劑，待保藏。復(fù)蘇方法：從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管，應(yīng)立即放置在38-40水浴中快速復(fù)蘇并適當(dāng)搖動(dòng)。直到內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止，一般約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內(nèi)容物移至適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。菌種凍存管懸滴保藏法措施：無營養(yǎng)，懸浮，溶液方法：寡營養(yǎng)保藏，放置10或室溫適用：絲狀真菌、酵母、腸道細(xì)菌保藏期：1年或更長常用的有蒸餾水、常用的有蒸餾水、0.25mpbs0.25mpbs或生理鹽水，關(guān)或生理鹽水，關(guān)鍵是試管應(yīng)密封好，以防水分蒸發(fā)。鍵是試管應(yīng)密封好，以防水分蒸發(fā)。低溫保藏法方法：-20適用：無芽孢厭氣菌，放線菌等保藏期：1年或更長注意：融化后的菌種不能再用低溫保存，要注意：融化后的菌種不能再用低溫保存，要重新移種后在冷