細(xì)胞生物學(xué)外泌體文獻(xiàn)匯報(bào)課件

1、細(xì)胞生物學(xué)外泌體文獻(xiàn)匯報(bào)1人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞分泌外泌體特性研究本研究旨在探討正常人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，bmmsc)分泌的外泌體(exosome)免疫調(diào)節(jié)功能及支持血管形成能力。結(jié)論：bmmsc分泌外泌體具有免疫調(diào)節(jié)功能與支持血管形成作用。細(xì)胞生物學(xué)外泌體文獻(xiàn)匯報(bào)2背景知識(shí)外泌體(exosome)為微小囊泡，直徑大約20140nm，在生理或病理情況下，由多種細(xì)胞內(nèi)膜(endosomal membrane)以出芽方式形成的多泡體，參與細(xì)胞間的信息交流，并參與到多種生理病理過程中。來源于不同的組織的外泌體不僅具有其特異性蛋白分子

2、，而且還包含其行使功能的關(guān)鍵分子。間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)，具有高度自我更新能力與多向分化潛能的多能干細(xì)胞，目前已應(yīng)用于臨床治療心肌損傷性疾病、神經(jīng)損傷性疾病等等。外泌體的主要功能是進(jìn)行信息傳遞，因外泌體的特性與其來源細(xì)胞有關(guān)，現(xiàn)有研究已證明msc分泌的外泌體在減少心肌損傷范圍、保護(hù)急性腎小管損傷、促進(jìn)神經(jīng)再生、減少肺損傷等方面有重要作用。間充質(zhì)干細(xì)胞具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能，可抑制多種免疫細(xì)胞的功能，如t細(xì)胞、b細(xì)胞、nk細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞等分泌免疫調(diào)節(jié)因子，如ifn-、pge2等。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hbmmsc)分泌的外泌體功能與其分泌細(xì)胞的功能息息相關(guān)，因此推測(cè)其在免疫調(diào)節(jié)與血管形成方面亦

3、有重要作用。細(xì)胞生物學(xué)外泌體文獻(xiàn)匯報(bào)3主要實(shí)驗(yàn)流程骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)外泌體的分離外泌體的鑒定外泌體mirna提取及rt-pcr擴(kuò)增反應(yīng)混合淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)pkh26熒光標(biāo)記外泌體觀察與huvec間相互作用huvec網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)matrigel體內(nèi)成血管實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理huvec：人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞matrigel：基底膜基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)外泌體文獻(xiàn)匯報(bào)4正常獻(xiàn)髓者骨髓約5ml無菌抽取密度梯度離心法骨髓單個(gè)核細(xì)胞df12完全培養(yǎng)液重懸分離接種于培養(yǎng)瓶中收集第4至第6代細(xì)胞df12完全培養(yǎng)液：dmem/f12、10胎牛血清、2umol/l l-谷氨酰胺、100 u/ml青霉素/鏈霉素骨髓間充質(zhì)

4、干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)外泌體文獻(xiàn)匯報(bào)5外泌體的分離外泌體的分離血清4過夜離心df12完全培養(yǎng)液(efm)不同數(shù)量的bmmsc提取外泌體pbs重懸-20保存共培養(yǎng)24 h收集上清pbs：磷酸鹽緩沖液外泌體的鑒定外泌體的鑒定分離純化外泌體10ul等體積pbs稀釋2 mm的載樣銅網(wǎng)靜置l min3(w/v)磷鎢酸鈉溶液(ph 6.8)室溫負(fù)染5 min雙蒸水輕輕洗一遍室溫晾干透射電子顯微鏡觀察并照相15ug外泌體5loadding buffer75、5 minsds-page凝膠跑膠1.5 h檢測(cè)cd9表達(dá)轉(zhuǎn)膜細(xì)胞生物學(xué)外泌體文獻(xiàn)匯報(bào)6混合淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)混合淋巴細(xì)胞實(shí)

5、驗(yàn)外周血15 ml密度梯度離心法單個(gè)核細(xì)胞rpmi 1640完全培養(yǎng)液重懸終濃度5ug/ml植物血凝素(pha)5 ng/ml重組人白介素2(rhil-2)96孔板加入bmmsc外泌體37、5co2培養(yǎng)72 h酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)檢測(cè)上清中ifn-的含量細(xì)胞生物學(xué)外泌體文獻(xiàn)匯報(bào)7實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)外泌體鑒定結(jié)果與定量外泌體鑒定結(jié)果與定量在透射電鏡下觀察到bmmsc外泌體呈圓形或橢圓形，直徑約60160 nm(107223356)，有完整胞膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)含低密度物質(zhì)。western blot證實(shí)其表達(dá)外泌體表面標(biāo)志cd9(圖1)。細(xì)胞分泌的外泌體量與接種細(xì)胞數(shù)呈線性關(guān)系(圖2)。圖1圖2細(xì)胞生

6、物學(xué)外泌體文獻(xiàn)匯報(bào)8rt-pcr結(jié)果顯示，bmmsc外泌體內(nèi)含有mir301、mir-let-7a與mir22(附表)，而這些mirna均與免疫相關(guān)。bmmsc外泌體用elisa試劑盒無法檢測(cè)出其含有ifn-(結(jié)果未列出)，而與105/孔pbmnc共培養(yǎng)72 h后，對(duì)照組ifn-分泌量為(210942332)ug，實(shí)驗(yàn)組ifn-分泌量為(10914 4-2125)ug，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p001)(圖3)。此結(jié)果表明bmmsc外泌體能抑制pbmc產(chǎn)生和分泌ifn-。 (2)外泌體免疫功能外泌體免疫功能圖3細(xì)胞生物學(xué)外泌體文獻(xiàn)匯報(bào)9在共聚焦顯微鏡觀察可見外泌體被huvec攝取并分布在細(xì)胞核

7、周圍(胞漿)(圖4)，在兩者共培養(yǎng)時(shí)bmmsc外泌體明顯促進(jìn)huvec網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成，對(duì)照組為(45790035838)，實(shí)驗(yàn)組為(91496747070)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p001)(圖5)在裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，在外泌體組可明顯見到血管生成，對(duì)照組無肉眼可見血管生成(圖6)。（3）外泌體支持血管形成）外泌體支持血管形成圖4細(xì)胞生物學(xué)外泌體文獻(xiàn)匯報(bào)10圖5圖6 在兩者共培養(yǎng)時(shí)bmmsc外泌體明顯促進(jìn)huvec網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成，對(duì)照組為(45790035838)，實(shí)驗(yàn)組為(91496747070)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p001)(圖5)。 在裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，在外泌體組可明顯見到血管生成，對(duì)照組無肉眼可

8、見血管生成(圖6)。細(xì)胞生物學(xué)外泌體文獻(xiàn)匯報(bào)11討論間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能與多向分化潛能，決定了msc在臨床應(yīng)用的主要方向。msc可通過分泌細(xì)胞因子抑制多種免疫細(xì)胞的功能而應(yīng)用于免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病及干細(xì)胞移植中。作為具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，msc亦通過分化為成體不可再生細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞)等治療相關(guān)損傷性疾病。以往研究msc作用時(shí)多集中在直接接觸或分泌細(xì)胞因子，而現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)外泌體亦參與到細(xì)胞間的信息交流。外泌體為細(xì)胞分泌的膜狀結(jié)構(gòu)，現(xiàn)已證明來源于不同的組織的外泌體不僅具有其特異性蛋白分子，而且還包含其行使功能的關(guān)鍵分子。msc可以抑制淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和分泌ifn-，我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明在培養(yǎng)pbmnc