臨床樣本的采集運輸和保存及核酸提取ppt課件

1、臨床標本的采集、處置、運送與臨床標本的采集、處置、運送與保管及保管及DNA/RNADNA/RNA提取提取 研討背景研討背景l(fā) 樣本的采集、處置樣本的采集、處置l 樣本的保管樣本的保管l 樣本的運輸樣本的運輸l DNA DNA的提取的提取l RNA RNA的提取的提取研討背景研討背景一、樣本的采集、處一、樣本的采集、處 理、保管及運輸理、保管及運輸臨床標本的正確采集、運送、保管臨床標本的正確采集、運送、保管的重要性的重要性l臨床檢驗的質量保證關鍵性環(huán)節(jié)臨床檢驗的質量保證關鍵性環(huán)節(jié)l處理涉及實驗室檢驗的醫(yī)患糾紛的方法之一處理涉及實驗室檢驗的醫(yī)患糾紛的方法之一一、樣本的采集一、樣本的采集地貧檢測樣品

2、采集：地貧檢測樣品采集： 外周血外周血: 5mL 臍帶血臍帶血: 0.51mL 羊羊 水：水：2030mL 絨絨 毛：毛：15mg 唾唾 液液 組組 織織標本采集的本卷須知標本采集的本卷須知l一切標本的采集、運送和處置應在無菌操作，防止污染的原那一切標本的采集、運送和處置應在無菌操作，防止污染的原那么下進展么下進展l已采集標本都應置于防漏、密封的無菌容器中運送已采集標本都應置于防漏、密封的無菌容器中運送l采集足夠量標本采集足夠量標本l每份標本都應標志患者姓名、送檢號碼、標本來源、詳細部位、每份標本都應標志患者姓名、送檢號碼、標本來源、詳細部位、日期、時間及相關臨床信息日期、時間及相關臨床信息全

3、全 血血l以全血作為待測標本時，必需留意抗凝劑以全血作為待測標本時，必需留意抗凝劑的選擇，普通運用的選擇，普通運用EDTA-Na2EDTA-Na2或枸椽酸鈉，或枸椽酸鈉，不可運用肝素不可運用肝素l全血樣本如用于全血樣本如用于DNADNA提取檢測，可提取檢測，可44下短下短期保管期保管, ,如用于如用于RNARNA檢測，那么應在取血后，檢測，那么應在取血后，盡快提取盡快提取RNARNA血清漿血清漿lDNADNA測定，可按照普通的血清標本處置程序，測定，可按照普通的血清標本處置程序，對測定影響不大對測定影響不大lRNARNA測定，標本的獲取和保管方式對測定結測定，標本的獲取和保管方式對測定結果，能

4、夠有決議性影響。最好是運用果，能夠有決議性影響。最好是運用EDTAEDTA抗凝抗凝( (嚴禁運用肝素嚴禁運用肝素) )全血標本，抗凝后全血標本，抗凝后6 6小小時內(nèi)分別血漿，如運用血清標本，那么需時內(nèi)分別血漿，如運用血清標本，那么需盡快盡快(2(2小時內(nèi)小時內(nèi)) )分別血清，標本的短期分別血清，標本的短期1 12 2周保管可在周保管可在-20-20下，較長期保管下，較長期保管應在應在-70-70下下 肝素的作用機理肝素的作用機理 l肝素對肝素對MLV逆轉錄酶和逆轉錄酶和TAQ DNA聚合酶均很強的抑聚合酶均很強的抑制造用，假設臨床標本為肝素抗凝，那么在核酸純化制造用，假設臨床標本為肝素抗凝，那

5、么在核酸純化過程中，標本中的肝素可結合于過程中，標本中的肝素可結合于DNA和和RNA上上l對標本進展煮沸、凝膠過濾、酸堿處置后凝膠過濾、對標本進展煮沸、凝膠過濾、酸堿處置后凝膠過濾、反復乙醇沉淀等均不能去除肝素的這種干擾作用反復乙醇沉淀等均不能去除肝素的這種干擾作用l每每g核酸標本中參與核酸標本中參與0.1U的肝素，即可的肝素，即可100%的抑制的抑制酶活性酶活性l在標本中參與肝素酶在標本中參與肝素酶I 或或13 U/g核酸在于核酸在于5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNasin 25 下作用下作用2小時可去除肝素的抑制造用小時可去除肝素的抑制造用二、樣本的

6、運送二、樣本的運送 l樣本一經(jīng)采集，那么應盡能夠快的送至檢測實驗樣本一經(jīng)采集，那么應盡能夠快的送至檢測實驗室室l樣本中如參與了適當?shù)姆€(wěn)定劑，如用于樣本中如參與了適當?shù)姆€(wěn)定劑，如用于DNADNA測定的測定的EDTAEDTA抗凝血等，那么可在室溫下運送或郵寄抗凝血等，那么可在室溫下運送或郵寄l建議：將全血標本或建議：將全血標本或DNADNA樣本用冰袋加泡沫盒快遞樣本用冰袋加泡沫盒快遞運送。如需提取運送。如需提取RNARNA的樣本需預處置后加的樣本需預處置后加lml lml TrizolTrizol在低溫運送在低溫運送三、樣本的保管三、樣本的保管l常規(guī)外周血標本，采集后做血常規(guī)，常溫常規(guī)外周血標本，

7、采集后做血常規(guī)，常溫24小時內(nèi)，小時內(nèi)，4可保管可保管1周；做血紅蛋白電泳常溫周；做血紅蛋白電泳常溫1周，電泳周，電泳4可保管可保管15天；天；DNA提取樣本常溫提取樣本常溫24小時，小時，4保管保管1個星期，個星期， 20 保管保管3個月，個月，70 保管半年保管半年3年；年；RNA提取樣本常提取樣本常溫溫6小時，小時，4保管保管12小時，小時， 70 保管保管3個月，羊水在個月，羊水在12小時內(nèi)離心可保管同上。小時內(nèi)離心可保管同上。研討背景研討背景 二、核酸的提取二、核酸的提取核酸提取的重要性核酸提取的重要性l核酸提取是臨床核酸提取是臨床PCRPCR檢驗最為關鍵的部分，檢驗最為關鍵的部分，

8、亦是手式操作的主要部分亦是手式操作的主要部分l核酸提取的成敗關系到臨床核酸提取的成敗關系到臨床PCRPCR檢驗的正確檢驗的正確與否與否l臨床臨床PCRPCR檢驗操作中最易出問題的環(huán)節(jié)檢驗操作中最易出問題的環(huán)節(jié)一、提取核酸總的原那么一、提取核酸總的原那么l保證核酸一級構造的完好性；保證核酸一級構造的完好性；l其他生物大分子如蛋白質、多糖和脂類其他生物大分子如蛋白質、多糖和脂類 分子的污染應分子的污染應降低到最低程度；降低到最低程度；l核酸樣品中不應存在對酶有抑制造用的有機溶劑和過核酸樣品中不應存在對酶有抑制造用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；高濃度的金屬離子；l其他核酸分子，如提取其他核酸分子，

9、如提取DNADNA中的中的RNARNA，也應盡量去除。，也應盡量去除。二、核酸提取的根本步驟二、核酸提取的根本步驟1、核酸的釋放： 破裂細胞 釋放核酸 機械法與非機械法 非機械法中溶胞法是應最廣泛的方法各種組織細胞破碎方法各種組織細胞破碎方法細胞破碎方法細胞破碎方法 應用應用 機械法機械法1.1.勻漿法勻漿法機體軟組織機體軟組織2.2.搗碎法搗碎法動物韌性組織動物韌性組織3.3.研磨法研磨法細菌、酵母細菌、酵母 物理法物理法1.1.超聲法超聲法細胞混懸液細胞混懸液2.2.反復凍融法反復凍融法培養(yǎng)細胞培養(yǎng)細胞3.3.冷熱交替法冷熱交替法細菌、病毒細菌、病毒4.4.低滲裂解低滲裂解紅細胞紅細胞 化

10、學法化學法1.1.有機溶劑有機溶劑細菌、酵母、血液細菌、酵母、血液2.2.去垢劑去垢劑組織、培養(yǎng)細胞、組織、培養(yǎng)細胞、血液血液3.3.酶解法酶解法細菌、酵母、血液細菌、酵母、血液2、核酸的分別與純化：、核酸的分別與純化： 將含有核酸分子復雜復合物中，將核酸與其將含有核酸分子復雜復合物中，將核酸與其 他物質分別他物質分別 非核酸的大分子污染物蛋白質、多糖和脂非核酸的大分子污染物蛋白質、多糖和脂 類分子、非需求的核酸分子、試劑和溶液類分子、非需求的核酸分子、試劑和溶液3、核酸的濃縮、沉淀與洗滌、核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀可去除部分雜質與某些鹽離子沉淀可去除部分雜質與某些鹽離子參與一定的鹽類醋酸鈉、

11、氯化鈉等后運用有參與一定的鹽類醋酸鈉、氯化鈉等后運用有機溶劑如乙醇、異丙醇等機溶劑如乙醇、異丙醇等少數(shù)鹽類可運用少數(shù)鹽類可運用70-75%的乙醇洗滌的乙醇洗滌濃度鑒定濃度鑒定DNADNA：1 1紫外分光光度法：測定紫外分光光度法：測定DNADNA在在A260nmA260nm的的光吸收值。光吸收值。 如計算如計算DNADNA濃度濃度 A260 A260稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)5050 g/ml g/ml紫外分光光度法只用于測定濃度大于紫外分光光度法只用于測定濃度大于0.25ug/ml0.25ug/ml的核酸溶液。的核酸溶液。(A值等于1時，相當于50g/ml雙鏈DNA， 40g/ml單鏈DNA或RNA，

12、20g/ml單鏈寡核苷酸RNARNA：l紫外吸光光度法紫外吸光光度法: l A260稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)40 g/mll(OD260-OD320)稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)40 g/mll 2 2熒光光度法熒光光度法 熒光染料溴化乙錠，可嵌入到堿基平面，而熒光染料溴化乙錠，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強度與核酸含量呈正比。發(fā)出熒光，且熒光強度與核酸含量呈正比。 適用于低濃度核酸溶液的定量分析適用于低濃度核酸溶液的定量分析1-5ng1-5ngEB與DNA的結合純度鑒定純度鑒定紫外分光光度法：紫外分光光度法：在在260nm和和280nm處測定處測定DAN溶液的光吸收，純?nèi)芤旱墓馕?，純的的DNA A26

13、0與與A280之比應在之比應在1.80 (1.601.80)，低于此值闡明制備物中留有蛋白質成份。高于此低于此值闡明制備物中留有蛋白質成份。高于此值闡明有值闡明有RNA的殘留量的殘留量純的純的RNA A260與與A280之比應在之比應在2.0(1.802.00), Ratio2.2 : RNA能夠能夠曾經(jīng)水解成單核苷酸曾經(jīng)水解成單核苷酸A260/A280比值是純度檢測的重要目的！比值是純度檢測的重要目的！注：測定吸光值，稀釋液應運用注：測定吸光值，稀釋液應運用完好性鑒定完好性鑒定凝膠電泳法：凝膠電泳法：基因組基因組DNA電泳，在電場中泳動慢，假設發(fā)生電泳，在電場中泳動慢，假設發(fā)生降解，可出現(xiàn)電

14、泳圖譜脫尾景象；降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾景象；總總RNA電泳，觀測各條帶的含量，提示能否存電泳，觀測各條帶的含量，提示能否存在在RNA降解；如加樣槽中存在條帶，能夠是降解；如加樣槽中存在條帶，能夠是DNA污染。污染。DNA完好性鑒定：完好性鑒定： 正常時，正常時，28S RNA的熒光強度的熒光強度約為約為18S RNA的的2倍，否那么提示倍，否那么提示RNA的降解的降解RNA完好性鑒定：完好性鑒定：5、核酸的儲存、核酸的儲存DNA保管保管 核酸的儲存核酸的儲存RNA保管：保管：lRNA可溶于0.3mol/L的醋酸鈉溶液或雙蒸水，在-70保管。lRNA可溶于70%的乙醇溶液或去離子的甲酰胺溶液中

15、，可在-20 保管。lRNA假設以DEPC焦碳酸二乙酯可以抑制RNA酶對RNA的降解三、基因組三、基因組DNA的分的分別與純化別與純化一、一、DNA樣品預備樣品預備l 常見的標本：l 血液、尿液、唾液、組織及培育細胞等l 生物組織：l 最好新穎組織，假設不能馬上提取，應儲存 l 70或液氮DNA提取前樣本采集、提取前樣本采集、預處置和保管：預處置和保管：l全血全血l 抗凝劑：抗凝劑：l EDTA-Na2l 或枸櫞酸鈉或枸櫞酸鈉l 作為抗凝劑作為抗凝劑l 不宜運用肝素不宜運用肝素 抗凝劑處理血肝素檸檬酸*EDTA*-80保存2個月，第10天收率90%4 第四天收率90%第10天提取效果差第十天收

16、率85%室溫提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差二、二、DNA提取提取酚酚抽抽提提法法提提取取步步驟：驟：DNA酚抽提法表示圖主要試劑的作用：主要試劑的作用： EDTA：1. 二價金屬螯合劑，抑制核酸酶；二價金屬螯合劑，抑制核酸酶； 2. 降低細胞膜的穩(wěn)定性降低細胞膜的穩(wěn)定性SDS的作用：的作用：1. 溶解膜蛋白和脂肪，從而使細胞膜破裂溶解膜蛋白和脂肪，從而使細胞膜破裂2. 溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸 釋放出來釋放出來3. 對對RNA、DNA酶有抑制造用酶有抑制造用4. 與蛋白質構成與蛋白質構成R-O-SO3 .R蛋白質復合物，蛋白質復合物，使蛋

17、白量變性使蛋白量變性蛋白酶蛋白酶K：水解蛋白質的作用，消化水解蛋白質的作用，消化DNA酶和細胞中的蛋白質酶和細胞中的蛋白質蛋白酶蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強的水解能與其他蛋白酶相比，它具有更強的水解能 力，而且在力，而且在SDS、EDTA存在時仍堅持較高活性，存在時仍堅持較高活性，可可 同時運用同時運用苯酚：苯酚：蛋白質強變性劑、抑制蛋白質強變性劑、抑制DNA酶活性酶活性苯酚溶于有機溶劑，微溶于水苯酚溶于有機溶劑，微溶于水提取提取DNA前苯酚用前苯酚用Tris-Hcl飽和，防止吸收過多飽和，防止吸收過多DNA，降低，降低DNA的損失率的損失率氧化苯酚會破壞氧化苯酚會破壞DNADNA的沉

18、淀：的沉淀：1無水乙醇沉淀無水乙醇沉淀沉淀前往往參與沉淀前往往參與NaCl等鹽離子，作用是中和核酸分子外表的等鹽離子，作用是中和核酸分子外表的負電荷，有助于分子之間的聚集。負電荷，有助于分子之間的聚集。無水乙醇可以吸收分子之間的水，使無水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNA沉淀析出，無水乙沉淀析出，無水乙醇運用前冰凍，可以減少醇運用前冰凍，可以減少DNA沉淀析出過程釋放熱量對沉淀析出過程釋放熱量對DNA的損傷。的損傷。2異丙醇沉淀異丙醇沉淀 除了使除了使DNA沉淀外，還可以溶解少量的小的沉淀外，還可以溶解少量的小的RNA分子分子二二 甲酰胺解聚法：甲酰胺解聚法：破碎細胞同上，然后用高濃度甲酰胺解

19、聚破碎細胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質與蛋白質與DNADNA的結合，再透析獲得的結合，再透析獲得DNADNA。高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質與高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質與DNADNA的復的復合物，可以使蛋白量變性。減少了酚多合物，可以使蛋白量變性。減少了酚多次抽提的步驟次抽提的步驟甲酰胺解聚法適用于從標本中制備高分子甲酰胺解聚法適用于從標本中制備高分子量的量的DNADNA樣品。可得樣品。可得DNA 200kbDNA 200kb左右。左右。三磁珠法：三磁珠法：磁珠在高鹽低磁珠在高鹽低pHpH值下吸附核酸，在低鹽高值下吸附核酸，在低鹽高pHpH值下與核酸分別，再經(jīng)過挪動磁珠來值下與核酸分別，再經(jīng)

20、過挪動磁珠來獲取獲取DNADNA四微柱法四微柱法 ：利用利用DNADNA在高鹽、低在高鹽、低pHpH的特定溶液環(huán)境下可的特定溶液環(huán)境下可吸附在固相介質如硅膠膜上，洗滌去吸附在固相介質如硅膠膜上，洗滌去除雜質后，再改動溶液環(huán)境使除雜質后，再改動溶液環(huán)境使DNADNA溶解到溶解到純水或純水或TETE中中三、三、DNA的濃縮的濃縮l固體聚乙二醇固體聚乙二醇PEGPEG濃縮：用透析袋濃縮：用透析袋 外敷外敷PEGPEG至適宜量至適宜量l丁醇抽提濃縮：丁醇抽提濃縮：DNADNA溶液中水可分配到正溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但丁醇或仲丁醇，但DNADNA不會。因此反復幾不會。因此反復幾次可顯著減少次可

21、顯著減少DNADNA體積體積四、四、DNA回收回收 l主要是從電泳中分別回收主要是從電泳中分別回收DNADNA片段片段l回收原那么：盡量提高回收率回收原那么：盡量提高回收率l 去除回收去除回收DNADNA樣品中的污染物樣品中的污染物lDNA降解的緣由降解的緣由l 樣本不夠新穎，采集資料過陳舊樣本不夠新穎，采集資料過陳舊l 樣本本身存在大量樣本本身存在大量DNA酶酶l提取提取DNA的生物活性差的緣由？的生物活性差的緣由？l 提取的基因組提取的基因組DNA鹽濃度過高鹽濃度過高l 基因組基因組DNA中乙醇未去除凈中乙醇未去除凈l 基因組基因組DNA中能夠存在其他抑制要素中能夠存在其他抑制要素l提取基

22、因組提取基因組DNA，有時參與蔗糖的緣由，有時參與蔗糖的緣由l 參與多糖，維護參與多糖，維護DNA長度長度影響影響DNA質量的要素質量的要素四、四、RNA的分別與純化的分別與純化一、樣本來源一、樣本來源l實際上一切有核真核細胞、細菌、病毒都實際上一切有核真核細胞、細菌、病毒都可以提取可以提取RNAl樣本選擇取決于實驗目的樣本選擇取決于實驗目的l全血是基因組提取全血是基因組提取RNA最常見的樣本最常見的樣本每個細胞的每個細胞的RNA量約為量約為10-5 g 80%-85% rRNA 10%-15% tRNA 1%-5% mRNA 其他其他RNA：hnRNA、 snRNA 、snoRNA組織材料組

23、織材料起始樣品量起始樣品量Total RNA提取量提取量blood1ml1520gleukocytes110107 7個個約約100 gLiver tissue1g約約5000 gCulture cells110107 7個個約約100gRenal tissue1g約約3000gSkeleton tissue1g約約1500gCerebral tissue1g約約1500g二、二、 RNA提取的獨特性提取的獨特性關于關于RNase酶酶l臨床標本及實驗室環(huán)境中臨床標本及實驗室環(huán)境中, ,存在大量對存在大量對RNARNA具有劇烈降解作用的具有劇烈降解作用的RNaseRNase，而，而RNaseRN

24、ase較耐較耐高溫高溫, ,不易失活不易失活l如何防止如何防止RNaseRNase對標本的污染及防止對標本的污染及防止RNaseRNase對提取的對提取的RNARNA的降解的降解, ,是保證是保證RNARNA勝利提取的勝利提取的關鍵之所在關鍵之所在RNase酶酶lRNARNA易被易被RNaseRNase水解，水解，RNaseRNase除胞內(nèi)還廣泛存在于除胞內(nèi)還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中l(wèi)RNaseRNase具有水解核糖殘基和磷酸二酯鍵具有水解核糖殘基和磷酸二酯鍵lRNaseRNase分子構造中的二硫鍵使其生物學活性非常分子構造中的二硫鍵使其生

25、物學活性非常穩(wěn)定，去除變性劑后，穩(wěn)定，去除變性劑后，RNaseRNase的活性又可恢復的活性又可恢復l去除去除RNaseRNase的污染及強有力地抑制其活性是的污染及強有力地抑制其活性是RNARNA制備勝利與否的關鍵制備勝利與否的關鍵l必需在總必需在總RNARNA提取分別的最初階段，盡能夠地提取分別的最初階段，盡能夠地滅活胞內(nèi)滅活胞內(nèi)RNaseRNase的活性的活性1. 內(nèi)源性內(nèi)源性RNA酶酶intrinsic RNase2. 外源性外源性RNA酶酶(extrinsic RNase)主要來源：主要來源： 被污染的緩沖液被污染的緩沖液 細菌或微生物污染，高壓不能去除細菌或微生物污染，高壓不能去除

26、RNA酶酶 自動移液安裝自動移液安裝3. 實驗室采取防止實驗室采取防止RNA酶污染的措施酶污染的措施設置專門設置專門RNA移液安裝移液安裝小份保管緩沖液小份保管緩沖液設置專門的設置專門的RNA電泳安裝電泳安裝預備溶液或緩沖液時，運用無預備溶液或緩沖液時，運用無RNA酶的器酶的器皿、皿、 DEPC處置水等處置水等分別分別RNA過程中運用過程中運用RNA酶抑制劑酶抑制劑4. RNA酶的去除酶的去除lDEPC焦碳酸二乙酯l高度活化的烷基化試劑，破壞RNA酶活性。用來滅活緩沖液或器皿中的RNA酶。l OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O=DEPC水制備：0.1%DEPC在37C處置1h，并高壓滅

27、菌15min。玻璃制品和塑料制品應浸泡在0.1%的DEPC水溶液中， 37C處置1h或室溫下過夜。DEPC非選擇性的修飾蛋白質和非選擇性的修飾蛋白質和RNA，且與一些緩沖液，且與一些緩沖液不相容，故在分別和純化不相容，故在分別和純化RNA的過程中不運用的過程中不運用DEPC5. RNA提取所用器皿的處置提取所用器皿的處置l經(jīng)高壓滅菌的一次性運用的塑料制品如試管經(jīng)高壓滅菌的一次性運用的塑料制品如試管, ,離心管等根離心管等根本上無本上無RNase,RNase,可以不經(jīng)預處置直接用于制備和儲存可以不經(jīng)預處置直接用于制備和儲存RNA RNA l實驗室用的普通玻璃器皿經(jīng)常有實驗室用的普通玻璃器皿經(jīng)常有

28、RNaseRNase污染污染, ,運用前必需于運用前必需于180180干烤干烤8 8小時以上小時以上, ,或用或用0.1%0.1%焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯(DEPC)(DEPC)的水的水溶液浸泡用于制備溶液浸泡用于制備RNARNA的燒杯的燒杯, ,試管和其它用品試管和其它用品lDEPCDEPC是是RNaseRNase的劇烈抑制劑。灌滿的劇烈抑制劑。灌滿DEPCDEPC的器皿于的器皿于3737下放下放置置2 2小時，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于小時，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100100干烤干烤1515分鐘，分鐘，最后高壓蒸汽下最后高壓蒸汽下1515分鐘。上述處置可除去器皿上痕量的分鐘。上述處置可

29、除去器皿上痕量的DEPC,DEPC,以防以防DEPCDEPC經(jīng)過羧甲基化作用對經(jīng)過羧甲基化作用對RNARNA的嘌呤堿基進展修的嘌呤堿基進展修飾飾6. RNA提取所用溶液的預備提取所用溶液的預備 l對于對于RNARNA提取所需溶液的配制提取所需溶液的配制, ,必需用高壓滅菌的必需用高壓滅菌的水和水和RNARNA研討公用的化學試劑配制溶液研討公用的化學試劑配制溶液, ,用干烤過用干烤過的藥匙稱取試劑的藥匙稱取試劑, ,將溶液裝入無將溶液裝入無RNaseRNase的玻璃器皿。的玻璃器皿。能夠的話能夠的話, ,溶液均運用溶液均運用0.1%DEPC0.1%DEPC于于3737至少處置至少處置1212小時

30、小時, ,然后于然后于100100加熱加熱1515分鐘或高壓蒸汽滅菌分鐘或高壓蒸汽滅菌1515分鐘分鐘l須留意的是須留意的是,DEPC,DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學反響可與胺類迅速發(fā)生化學反響, ,因因此不能用來處置含有此不能用來處置含有TrisTris一類的緩沖液一類的緩沖液, ,因此可存因此可存幾瓶新的幾瓶新的, ,未開封的未開封的TrisTris試劑以制備無試劑以制備無RNaseRNase的溶的溶液液7. RNA提取中提取中RNase 污染的控制污染的控制l實驗操作人員的手是RNase污染最主要的潛在來源。 l戰(zhàn)略是：l在預備用于RNA純化的實驗資料和溶液時,以及在涉及RNA的整個提取操

31、作過程中,都應戴一次性手套l在RNA提取實驗中，應勤換手套三、用于提取三、用于提取RNA的血樣的處置的血樣的處置l取新穎抗凝血取新穎抗凝血23ml入入15ml無菌塑料管，無菌塑料管，600g離心離心5分鐘，分鐘，棄上清。棄上清。 l參與參與6倍細胞體積的紅細胞裂解液約倍細胞體積的紅細胞裂解液約12ml，悄然吹打混，悄然吹打混勻，本步驟在室溫或勻，本步驟在室溫或4度操作均可。裂解時間至度操作均可。裂解時間至4-5分鐘，并分鐘，并且裂解過程中宜適當偶爾搖動以促進紅細胞裂解。且裂解過程中宜適當偶爾搖動以促進紅細胞裂解。l600g離心離心5分鐘，棄紅色上清。分鐘，棄紅色上清。4離心效果更佳。離心效果更

32、佳。l普通情況下，普通情況下， 裂解裂解1次紅細胞應該裂解的差不多，假設有較次紅細胞應該裂解的差不多，假設有較多紅細胞沒有裂解的話，可以再加點紅細胞裂解液約多紅細胞沒有裂解的話，可以再加點紅細胞裂解液約5ml裂裂解解1次。步驟同次。步驟同3。l向得到的細胞團中加向得到的細胞團中加Trizol 1.0ml，彈勻，將細胞團打散，彈勻，將細胞團打散，轉入轉入1.5ml無菌塑料管，封好蓋。標上號，纏上封口膜，無菌塑料管，封好蓋。標上號，纏上封口膜，20 或或70 保管。保管。四、四、RNA提取的常用方法提取的常用方法 RNA提取實驗前的預備提取實驗前的預備【運用器具】【運用器具】 盡量運用一次性塑料器皿，假設運用玻璃器皿，那么盡量運用一次性塑料器皿，假設運用玻璃器皿，那么運用運用0.1%DEPC0.1%DEPC水溶液在水溶液在3737處置處置12h12h，后，后120120高壓高壓30min30min，去除殘留，去除殘留DEPCDEPC【試劑配制】【試劑