丙種球蛋白的制備

1、丙種球蛋白的電泳制備丙種球蛋白的電泳制備 預(yù)習(xí)方案預(yù)習(xí)方案組別：第二組成員：張婉月 臧贏 徐潔 嚴(yán)夢(mèng)迎 陳孝顏指導(dǎo)老師：韋平和 彭佳平丙種球蛋白概念 中文簡(jiǎn)稱(chēng)：“丙球” 英文名稱(chēng)：-globulin、gamma globulin 別名： 免疫血清球蛋白，普通免疫球蛋白，人血丙 種球蛋白，丙種球蛋白，靜脈注射用人免疫球蛋白 （ph4） 丙種球蛋白預(yù)防傳染性肝炎，預(yù)防麻疹等病毒性疾 病感染，治療先天性丙種球蛋白缺乏癥 ，與抗生素 合并使用，可提高對(duì)某些嚴(yán)重細(xì)菌性和病毒性疾病 感染的療效。 注：由于人血中的免疫球蛋白大多數(shù)為丙種球蛋白 （-球蛋白），有時(shí)丙種球蛋白也被混稱(chēng)為“免疫球 蛋白”(immu

2、noglobulin) 。（2）藥理作用 注射丙種球蛋白是一種被動(dòng)免疫療法。它是把 免疫球蛋白內(nèi)含有的大量抗體輸給受者，使之從 低或無(wú)免疫狀態(tài)很快達(dá)到暫時(shí)免疫保護(hù)狀態(tài)。由 于抗體與抗原相互作用起到直接中和毒素與殺死 細(xì)菌和病毒。因此免疫球蛋白制品對(duì)預(yù)防細(xì)菌、 病毒性感染有一定的作用。（3）適應(yīng)癥 丙種球蛋白是血液中一種蛋白質(zhì)，它通常來(lái)源于許多人獻(xiàn)的 血液，常被用來(lái)防止和治療感染，對(duì)慢性疲勞癥有顯著的改善 作用。適用于預(yù)防傳染性肝炎，麻疹等病毒性疾病感染,，治 療先生性丙種球蛋白缺乏癥，可提高對(duì)某些嚴(yán)重細(xì)菌性和病毒 性疾病感染的療效。制備丙種球蛋白的方法 丙種球蛋白的兩種分離制備的方法 層析法（

3、如：sephadexg-50） 定義:是一種利用混合物中諸組分在兩相間的分配原理 以獲得分離的方法。 電泳法（如：聚丙烯酰胺凝膠電泳) 定義：利用溶液中帶有不同量的電荷的陽(yáng)離子或陰離 子，在外加電場(chǎng)中以不同的遷移速度向電極移動(dòng)， 而達(dá)到分離目的的分析方法。 sephadexg-50 sephadex是由葡聚糖通過(guò)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)形 成的三維網(wǎng)狀凝膠顆粒。 sephadex凝膠按交聯(lián)度不同，用sephadex g 加一個(gè)數(shù)字來(lái)區(qū)別型號(hào),數(shù)字越小,表示介質(zhì)交 聯(lián)度, 分級(jí)范圍越小，反之亦然。電泳 作用：用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。 原理 聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。 它有兩種形式：非變性

4、聚丙烯酰胺凝膠及sds-聚丙烯 酰胺凝膠（sds-page）；非變性聚丙烯酰胺凝膠， 在電泳的過(guò)程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依 據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶 的電荷量而逐漸呈梯度分開(kāi)。 垂直平板： 1多個(gè)樣品在同一塊凝膠上，電泳條件一致便于利用各 種鑒定方法，直接比較各種樣品區(qū)帶，保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠 2可以進(jìn)行雙向電泳 3電泳時(shí)熱量容易消散，凝膠結(jié)果便于照相和易于制成干膠 圓盤(pán)電泳： 1、缺點(diǎn)是由于聚合效應(yīng)，凝膠的長(zhǎng)度和直徑有細(xì)微差別， 即使同一樣品在兩個(gè)凝膠柱上以同樣的條件電泳，其結(jié)果也 會(huì)不同 2、但是研究工作中還會(huì)用到圓盤(pán)電泳，例如 測(cè)定放射性標(biāo) 記的樣品測(cè)定蛋白質(zhì)的

5、生物活性；測(cè)定蛋白質(zhì)分離的最適ph， 凝膠濃度；雙向電泳中第一相的分離。 聚丙烯酰胺凝膠有下列特性： 凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好； 化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)； 對(duì)ph和溫度變化較穩(wěn)定,幾乎無(wú)吸附和電滲作用； 樣品用量少，靈敏度可達(dá)10-6g; 凝膠孔徑可調(diào)節(jié)； 分辨率高。 凝膠系統(tǒng)的分類(lèi) 1、連續(xù)性凝膠電泳 連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液ph值及凝膠濃度相同， 帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。 不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，ph，凝膠濃度 及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不 僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)。 2、不連續(xù)凝膠電泳 垂直電泳原理 陰極電泳

6、用水溶性樹(shù)脂是一種陽(yáng)離子型化合物，用 有機(jī)酸中和，在水中溶解后，以分子和離子平衡狀 態(tài)存在于直流電場(chǎng)中，兩極產(chǎn)生電位差，離子發(fā)生 定向移動(dòng)，陽(yáng)離子向陰極移動(dòng)，并在陰極表面上得 到電子沉積于陰極表面，而陰離子向陽(yáng)極移動(dòng)，在 陽(yáng)極上放出電子氧化成酸。這就是電泳涂裝的基本 原理。它是一個(gè)非常復(fù)雜的電化學(xué)反應(yīng)，其中包括： 電解、電泳、電沉積、電滲四個(gè)同時(shí)進(jìn)行的過(guò)程。實(shí)驗(yàn)步驟（1）溶液的配制 a) a貯液為49.5%t,3%c b) b貯液為49.5%t,6%c。 c) 膠緩沖液為3moltris d) 0.3g/lsds用hcl調(diào)ph值至8145 e) 陽(yáng)極緩沖液為0.2moltris f) 用hcl

7、調(diào)ph值至8.9。 g) 陰極緩沖液為0.1moltris h) 0.1moltricine i) 0.13g/lsds用hcl 調(diào)ph值至8125。 j) 樣品緩沖液為3moltris(ph8.45) k) 0.8gsds l) 0.3moldtt m) 少許溴酚藍(lán),定容至10ml。 n) 膠的制備:按文獻(xiàn)分別配制分離膠、間隙膠和濃縮膠,依次 灌膠。(2)樣品處理去除血清白蛋白后的樣品與2倍體積 u9緩沖液(9molurea,2%chaps,1%dtt) 混勻,400600r/min冰浴振蕩30min 變性。取變性后樣品與樣品緩沖液 等體積混勻,60水浴加熱5min。(3)電泳內(nèi)槽裝陰極緩沖

8、液,外槽用陽(yáng)極緩沖液恒壓 電泳,先40v約1.5h,當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠時(shí),電 壓升至60v約1.5h。(4)染色和脫色電泳結(jié)束時(shí),用雙蒸水把膠面洗凈。臵于染 色液(0.1%甲醇,0.5%三氯乙酸,0.1%考馬斯 亮藍(lán)g250)中,5060r/min,振蕩染色1h。 然后用雙蒸水洗凈膠面,轉(zhuǎn)至雙蒸水脫色,1h。 更換雙蒸水23ci直到背景清晰。盤(pán)狀電泳圓盤(pán)電泳是帶電粒子(膠體顆粒、離子等)在電場(chǎng)的 作用下在特定的介質(zhì)中向與其電荷性質(zhì)相反的電極 方向定向泳動(dòng)的現(xiàn)象.廣泛應(yīng)用于生物大分子的分離 和鑒定。 它是利用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在催化劑的作用下 聚合成大分子的凝膠物。它同時(shí)兼有分子篩和電泳 效應(yīng)。

9、當(dāng)樣品通過(guò)凝膠進(jìn)行電泳時(shí)，便可以根據(jù)其 樣品中各分子的電荷和分子量的不同而泳動(dòng)出不同 的區(qū)帶。由于聚丙烯酰胺凝膠化學(xué)性質(zhì)較瓊脂穩(wěn)定， 很少帶有側(cè)基，在電泳過(guò)程中，吸附作用與電滲作 用均小，所以該技術(shù)的分辨率均高于其它瓊脂電泳 技術(shù)。聚丙烯酰胺凝膠電泳的三種效應(yīng) 1、 濃縮效應(yīng) 每種蛋白質(zhì)分子所載有效電荷不同，因而遷移率不 同。 有效電荷多的，泳動(dòng)的快，反之則慢。 2、電荷效應(yīng) 分子量大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過(guò)一定孔徑的分 離膠時(shí)，受凝膠阻滯的程度不同，表現(xiàn)出不同的 遷移率。 3、分子篩效應(yīng) 樣品在分離之前，首先在濃縮膠得到濃縮，變成狹 窄（很?。┑臉悠穾?，使分辨率大大提高。 實(shí)驗(yàn)方法 分離膠的

10、制備 濃縮膠的制備 待分離樣品的準(zhǔn)備 加樣 電泳 染色 脫色材料與試劑 120單體母液 丙烯酰胺（aorylamide） 19.60g 雙丙烯酰胺（n，nmethylene bisaerylamide） 0.40g h2o 加至 100.00ml 2ph8.0 trisedta緩沖液 tris（三羥基甲基氨基甲烷） 6.05g edta（乙二胺四乙酸） 1.17g h2o 加至 100.00ml 3b三甲基胺基丙腈液（bdmpn） （dimethylaminopropionitrile），原液于4冰箱保存 410過(guò)硫酸銨溶液 過(guò)硫酸銨0.50g h2o 加至 5.00ml 現(xiàn)用現(xiàn)配或配后低溫保

11、存不超過(guò)一周。 50.025mol/l ph9.0 硼酸緩沖液 硼酸3.948g 硼砂 30.512g h2o 加至 1000.0ml 使用時(shí)取該液90ml加h2o至1 440ml，即為電泳液。五、操作步驟1、分離膠的制備：（1）、將清潔、無(wú)破碎干燥的小玻管一端，用膠布貼封后，朝 下垂直放入有機(jī)玻璃凝膠玻管架的孔中，并在小玻管的7.0 cm 處作一記號(hào)。 （2）用自動(dòng)取液器吸取上述配好的分離凝膠貯液沿著小玻管內(nèi) 壁小心準(zhǔn)確加入7.0 cm高。 （3）凝膠溶液加畢后，隨即吸取蒸餾水，加至管中的凝膠表面， 使其表面覆蓋一水層（水封，1.0cm 高）。在灌膠和封水的過(guò) 程中，操作要輕，以避免產(chǎn)生氣泡

12、。 （4）將加注好的凝膠管于室溫下靜置，以進(jìn)行聚合反應(yīng)，在正 常情況下大約30-60分鐘后，待界面出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象時(shí)，表明 膠已聚合完畢，即可加濃縮膠。2、濃縮膠的制備：（1）、輕輕倒掉分離膠玻管上端的液體，并用吸 水紙吸去未倒凈的液體（但不能觸及膠面）然后先 小心用濃縮膠貯液洗滌凝膠表面1-2次，再小心加 入該濃縮膠貯液1.5 cm高。 （2）、隨后同樣加1.0cm高的蒸餾水層覆蓋膠表 面。大約也在20-40分鐘后，待濃縮膠出現(xiàn)乳白色 時(shí)，表明膠已聚合完畢。 3、加樣： 取一根上次做好的凝膠小玻管用吸水紙輕輕吸去 濃縮膠表面上的水層，然后用微量注射器加10ul測(cè) 試樣品溶液。 4、裝置凝膠管

13、： 將加好樣品的凝膠管的加樣端（上端），插入上電 泳槽孔中，然后將已插滿(mǎn)凝膠管的上電泳槽放入加有 電極溶液的下電泳槽內(nèi)。此時(shí)凝膠玻管下端管口易產(chǎn) 生氣泡，可通過(guò)輕輕擺動(dòng)凝膠玻管以去除氣泡，插入 上電泳槽的玻管上端，用滴管輕輕滴滿(mǎn)電極溶液，以 免產(chǎn)生氣泡，最后將上電泳槽裝滿(mǎn)電極液。5、接通電源：接通電泳槽的兩端電極與電泳儀的電源，上槽電極接 負(fù)極，下槽電極接正極，穩(wěn)壓300v電泳開(kāi)始時(shí)，電流 應(yīng)由小逐步加大至額定值。這時(shí)的電流大約每管3.05.0 ma 電流，直至指示劑前沿到達(dá)凝膠管底部約0.5 cm處，（大約需時(shí)2小時(shí)），停止電泳。確定電泳結(jié) 束時(shí)，不應(yīng)將溴酚蘭跑出凝膠管，以防止標(biāo)準(zhǔn)分子量 中

14、的最低分子量蛋白質(zhì)也跑出凝膠管。6、練習(xí)取出玻管內(nèi)的凝膠：將一支帶有長(zhǎng)針頭的注射器吸有適量水（蒸餾水 或自來(lái)水），把針頭慢慢插入玻管內(nèi)壁和凝膠柱表 面之間，一邊開(kāi)始?jí)核?，一邊同時(shí)使針頭慢慢貼緊 管壁呈螺旋式前進(jìn)，如果一端不行，再在管的另一 端按同樣的方法剝離，這樣依靠水流的壓力和滑潤(rùn) 力，使玻管內(nèi)壁與凝膠分離，最后用洗耳球在管的 一端輕輕擠壓，另一端對(duì)著一干凈大小適宜的培養(yǎng) 皿內(nèi)，此時(shí)可以將凝膠柱壓出玻管。 7、取出玻管內(nèi)的凝膠 8、凝膠染色： 將取出的凝膠柱，放入一合適干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，然 后加入適量染色液，于搖床上進(jìn)行振搖染色30分鐘， 完畢，回收染色液，用清水洗凝膠柱2-3遍。在染色的 同時(shí)，凝膠中蛋白質(zhì)區(qū)帶亦被固定。 9、凝膠脫色： 在培養(yǎng)皿（或試管）內(nèi)加入適量脫色液于搖床上進(jìn) 行振搖（2小時(shí)/次，需3次）脫色多次直至色帶完全清 晰為止。 10、繪圖： 最后根據(jù)染色所出現(xiàn)的帶數(shù)和位置進(jìn)行繪圖， 以確定被分析樣品的組分。另一種方法是通 過(guò)密度掃描儀掃出各組分的峰形位置，這樣 不僅能確定組分，而且能比較出各組分所占 比例（如果要計(jì)算出各分離區(qū)帶的相對(duì)遷移 率，可參考教課書(shū)）。 注意事項(xiàng) 樣品的離子強(qiáng)度、ph值盡可能與濃縮膠溶液相同， 如含大量鹽類(lèi)時(shí)，應(yīng)透析除鹽。最適合的樣品蛋白 量是10g