第10章核酸分子雜交技術(shù)

1、1第10章 核酸分子雜交技術(shù) 遺傳與分子生物學(xué)系遺傳與分子生物學(xué)系 于杰于杰 2 核酸分子雜交（核酸分子雜交（nucleic acid hybridization） 指具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條指具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基配對(duì)原則形成雙鏈的過(guò)程。件下按堿基配對(duì)原則形成雙鏈的過(guò)程。 不同來(lái)源的不同來(lái)源的dna或或rna單鏈在一定條件下單鏈在一定條件下重新組成的新的雙鏈分子重新組成的新的雙鏈分子雜交分子。雜交分子。 3第一節(jié)第一節(jié) 核酸雜交的基本理論核酸雜交的基本理論一、變性與復(fù)性一、變性與復(fù)性 4 dna的變性(denaturation)： 在某些理化因素作用下，dna

2、分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂，使規(guī)則有序的雙螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)椴灰?guī)則無(wú)序的單鏈線團(tuán)樣結(jié)構(gòu)的過(guò)程。56解鏈溫度（融解溫度，tm）(melting temperature)：使50%的dna發(fā)生變性時(shí)的環(huán)境溫度。dna的變性從開(kāi)始解鏈到完全解鏈?zhǔn)窃谝粋€(gè)相當(dāng)窄的溫度內(nèi)完成的。78增增色效應(yīng)：色效應(yīng)： dna變性后對(duì)變性后對(duì)260nm紫外光收紫外光收增加增加的現(xiàn)象。的現(xiàn)象。9dna的復(fù)性（的復(fù)性（renaturation)： 在適當(dāng)條件下，變性在適當(dāng)條件下，變性dna的兩條的兩條互補(bǔ)鏈可再恢復(fù)成天然的雙螺旋結(jié)互補(bǔ)鏈可再恢復(fù)成天然的雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程。構(gòu)的過(guò)程。熱變性的熱變性的dna經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)經(jīng)緩慢冷卻后

3、即可復(fù)性，此過(guò)程稱為性，此過(guò)程稱為退火退火(annealing)。1011減色效應(yīng)減色效應(yīng)：變性變性dna復(fù)性后復(fù)性后對(duì)對(duì)260nm紫外光紫外光吸收減少的現(xiàn)象吸收減少的現(xiàn)象。121. 常用的變性方法：常用的變性方法： 熱變性熱變性 酸堿變性酸堿變性 化學(xué)試劑變性化學(xué)試劑變性 132. 影響復(fù)性的因素影響復(fù)性的因素 序列簡(jiǎn)單的分子復(fù)性快，如序列簡(jiǎn)單的分子復(fù)性快，如poly(dt)和和poly(da)識(shí)別快識(shí)別快 dna片段愈大，擴(kuò)散速度愈低，復(fù)性慢片段愈大，擴(kuò)散速度愈低，復(fù)性慢 離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度有利于復(fù)性有利于復(fù)性 dna濃度濃度復(fù)性復(fù)性 tm值的估算值的估算 20bp tm=69.3+0.41

4、(g+c)% tm=81.5+16.6lgm+0.41（g+c）%-500/n-0.61（甲酰胺（甲酰胺%） 14核酸雜交：核酸雜交：不同來(lái)源不同來(lái)源的兩條核酸單鏈由的兩條核酸單鏈由于于具有互補(bǔ)序列具有互補(bǔ)序列，在一起復(fù)性時(shí)，互補(bǔ)，在一起復(fù)性時(shí)，互補(bǔ)序列配對(duì)，形成雜化分子。序列配對(duì)，形成雜化分子。+151617二、影響雜交的因素二、影響雜交的因素 1. 核酸分子的濃度和長(zhǎng)度核酸分子的濃度和長(zhǎng)度 2. 溫度：比溫度：比tm低低2530較適宜較適宜3. 離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度雜交反應(yīng)率雜交反應(yīng)率 18 4. 雜交液中的甲酰胺雜交液中的甲酰胺 甲酰胺能降低核酸雜交的甲酰胺能降低核酸雜交

5、的tm，含含30%50%甲酰胺的雜交溶液溫度能甲酰胺的雜交溶液溫度能降低到降低到3042。 使用甲酰胺的優(yōu)點(diǎn)：使用甲酰胺的優(yōu)點(diǎn)： 低溫下探針更穩(wěn)定；低溫下探針更穩(wěn)定； 能更好地保留非共價(jià)結(jié)合的核酸。能更好地保留非共價(jià)結(jié)合的核酸。19注意：注意：待測(cè)核酸順序與探針順序同源性高待測(cè)核酸順序與探針順序同源性高的雜交，用水溶液時(shí)取的雜交，用水溶液時(shí)取68，用，用50%甲酰胺溶液時(shí)甲酰胺溶液時(shí)取取40。 待測(cè)核酸順序與探針同源性不高時(shí)，待測(cè)核酸順序與探針同源性不高時(shí)，以以50% 甲酰胺溶液在甲酰胺溶液在3540雜交。雜交。205. 核酸分子的復(fù)雜性直接影響復(fù)性幾率。核酸分子的復(fù)雜性直接影響復(fù)性幾率。6.

6、 非特異性雜交反應(yīng)：在雜交前將非特異非特異性雜交反應(yīng)：在雜交前將非特異性位點(diǎn)進(jìn)行封閉，以減少對(duì)探針的非特異性位點(diǎn)進(jìn)行封閉，以減少對(duì)探針的非特異性吸附作用。性吸附作用。常用封閉物：常用封閉物：變性非特異變性非特異dna：鮭魚(yú)精子：鮭魚(yú)精子dna， 小牛胸腺小牛胸腺dna 高分子化合物：高分子化合物：denhardt溶液溶液 脫脂奶粉脫脂奶粉 21第二節(jié)第二節(jié) 核酸探針核酸探針 一、探針的選擇原則一、探針的選擇原則 1. 高度的特異性高度的特異性 2. 制備探針的難易性和檢測(cè)手段的靈敏法制備探針的難易性和檢測(cè)手段的靈敏法 二、探針的種類(lèi)二、探針的種類(lèi) 221. 基因組基因組dna探針探針從基因組從

7、基因組dna文庫(kù)中選取某一基因片段文庫(kù)中選取某一基因片段 與載體連接（質(zhì)粒、噬菌體）與載體連接（質(zhì)粒、噬菌體） 克隆克隆(pcr擴(kuò)增擴(kuò)增)酶切酶切優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：無(wú)性繁殖、制備方法簡(jiǎn)單；無(wú)性繁殖、制備方法簡(jiǎn)單；不易降解不易降解（與（與rna比較）；比較）；標(biāo)記方法成熟。標(biāo)記方法成熟。 232. cdna探針（探針（complementary dna） s1核酸酶切平兩端核酸酶切平兩端優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：不含內(nèi)含子及高度不含內(nèi)含子及高度重復(fù)序列但不易獲得重復(fù)序列但不易獲得 載體連接載體連接克隆克隆通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄雙鏈雙鏈cdna加接頭加接頭限制酶限制酶 粘性末端粘性末端243. rna探針：檢測(cè)探針：檢

8、測(cè)dna和和mrna 優(yōu)點(diǎn)：雜交效率高，穩(wěn)定性高，非特異性優(yōu)點(diǎn)：雜交效率高，穩(wěn)定性高，非特異性 雜交較少雜交較少,未雜交探針可用未雜交探針可用rnase 降解，減少本底的干擾。降解，減少本底的干擾。 缺點(diǎn)：易降解，標(biāo)記方法復(fù)雜缺點(diǎn)：易降解，標(biāo)記方法復(fù)雜 254. 寡核苷酸探針寡核苷酸探針 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可根據(jù)需要合成相應(yīng)序列；可根據(jù)需要合成相應(yīng)序列； 探針短探針短,序列復(fù)雜性低序列復(fù)雜性低,分子量小，分子量小，因此雜交時(shí)間短因此雜交時(shí)間短;長(zhǎng)長(zhǎng) 度只有度只有1050bp，該識(shí)別序，該識(shí)別序列內(nèi)列內(nèi)1個(gè)堿基的變化可明顯降低雜個(gè)堿基的變化可明顯降低雜交交tm值。值。 可大量合成，價(jià)格低，能夠用酶可大

9、量合成，價(jià)格低，能夠用酶學(xué)或?qū)W或 化學(xué)方法進(jìn)行非放射性標(biāo)記。化學(xué)方法進(jìn)行非放射性標(biāo)記。 26三、探針設(shè)計(jì)原則：三、探針設(shè)計(jì)原則： 長(zhǎng)度：長(zhǎng)度：1050bp 堿基成分堿基成分:g+c含量為含量為40%60% 探針?lè)肿觾?nèi)無(wú)互補(bǔ)序列。探針?lè)肿觾?nèi)無(wú)互補(bǔ)序列。 避免同一堿基重復(fù)出現(xiàn)。避免同一堿基重復(fù)出現(xiàn)。 一旦選定某一序列后，尚需與已知的各種基因一旦選定某一序列后，尚需與已知的各種基因序列進(jìn)行同源性比較，與非靶區(qū)域的同源性不應(yīng)序列進(jìn)行同源性比較，與非靶區(qū)域的同源性不應(yīng)超過(guò)超過(guò)70%或有連續(xù)或有連續(xù)8個(gè)或更多的堿基同源。個(gè)或更多的堿基同源。27四、探針標(biāo)記物的選擇四、探針標(biāo)記物的選擇 理想的標(biāo)記物：理想的

10、標(biāo)記物： 具有高度的靈敏性具有高度的靈敏性與探針結(jié)合后，不影響雜交及探針的主與探針結(jié)合后，不影響雜交及探針的主要理化特性要理化特性檢測(cè)方法高靈敏性、高特異性，假陽(yáng)性率檢測(cè)方法高靈敏性、高特異性，假陽(yáng)性率低，環(huán)境污染少，價(jià)格低廉；低，環(huán)境污染少，價(jià)格低廉；若用酶促方法標(biāo)記，應(yīng)對(duì)若用酶促方法標(biāo)記，應(yīng)對(duì)km影響不大影響不大28（一）常用的放射性標(biāo)記物（一）常用的放射性標(biāo)記物 1.常用探記探針的同位素：常用探記探針的同位素：32p、3h、35s、14c、125i、131i292. 特性：特性： 檢測(cè)特異性強(qiáng)；檢測(cè)特異性強(qiáng)；靈敏度高；靈敏度高；對(duì)酶促反應(yīng)無(wú)任何影響，也不影響堿對(duì)酶促反應(yīng)無(wú)任何影響，也不影

11、響堿基配對(duì)的特異性和穩(wěn)定性；基配對(duì)的特異性和穩(wěn)定性；易造成放射性污染；易造成放射性污染；半衰期短的同位素應(yīng)用受到限制，隨用半衰期短的同位素應(yīng)用受到限制，隨用隨標(biāo)記，立即使用，不能長(zhǎng)時(shí)間存放。隨標(biāo)記，立即使用，不能長(zhǎng)時(shí)間存放。303. 探針標(biāo)記的方法探針標(biāo)記的方法 缺口平移法（缺口平移法（nick translation）實(shí)質(zhì)：用實(shí)質(zhì)：用-32pdntp取代原來(lái)取代原來(lái)dna鏈鏈中不帶同位素的同種核苷酸，生成的兩中不帶同位素的同種核苷酸，生成的兩條鏈均被同位素標(biāo)記。條鏈均被同位素標(biāo)記。3132隨機(jī)引物法（隨機(jī)引物法（random priming）人工合成的人工合成的68個(gè)核苷酸長(zhǎng)的各種不同排列個(gè)

12、核苷酸長(zhǎng)的各種不同排列順序的混合物，它們可以隨機(jī)地互補(bǔ)到順序的混合物，它們可以隨機(jī)地互補(bǔ)到dna探針的某一處，作為引物，在探針的某一處，作為引物，在klenow片段作用下，合成與探針片段作用下，合成與探針dna互補(bǔ)的互補(bǔ)的dna鏈，當(dāng)在反應(yīng)液中加入鏈，當(dāng)在反應(yīng)液中加入-32pdatp時(shí)，即時(shí)，即可形成放射性同位素標(biāo)記的可形成放射性同位素標(biāo)記的dna探針，但探針，但探針探針dna序列是長(zhǎng)短不等的。序列是長(zhǎng)短不等的。優(yōu)點(diǎn)：比活度高，結(jié)果穩(wěn)定優(yōu)點(diǎn)：比活度高，結(jié)果穩(wěn)定3334用用t4多核苷酸激酶標(biāo)記多核苷酸激酶標(biāo)記dna5末端末端 5-pcpgpapcpg-3 堿性磷酸酶堿性磷酸酶(akp） 5-ho

13、cpgpapcpg-3 -32patpt4噬菌體多核苷酸激酶（噬菌體多核苷酸激酶（pnk） 5-32pcpgpapcpg-3 35klenow片段快速標(biāo)記dna探針末端 用枯草桿菌蛋白酶切割可得兩條多肽鏈 n c53外切酶 35外切酶 53聚合酶 小片段(36000) klenow片段（67000） 3cttaag55gaattc3ecor 5g aattc3 3cttaa g5 klenow, dntp,-32pdatp 5gaatt aattc3 3cttaa ttaag5 36（二）常用的非放射性標(biāo)記（二）常用的非放射性標(biāo)記 優(yōu)點(diǎn)：無(wú)環(huán)境污染，可較長(zhǎng)時(shí)間貯存優(yōu)點(diǎn)：無(wú)環(huán)境污染，可較長(zhǎng)時(shí)間貯

14、存方法：方法：1.酶標(biāo)記法酶標(biāo)記法 2.化學(xué)標(biāo)記法化學(xué)標(biāo)記法要求：標(biāo)記物應(yīng)具有耐熱、對(duì)組織細(xì)胞無(wú)特異要求：標(biāo)記物應(yīng)具有耐熱、對(duì)組織細(xì)胞無(wú)特異親和性、分子量小，對(duì)探針雜交無(wú)影響或影響親和性、分子量小，對(duì)探針雜交無(wú)影響或影響甚小，不影響甚小，不影響dna三維空間構(gòu)象的形成。三維空間構(gòu)象的形成。常用的標(biāo)記物：生物素（常用的標(biāo)記物：生物素（biotin）、地高辛）、地高辛（digoxigenin）、光生物素（）、光生物素（photobiotin）、）、補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂素、2-乙酰氨基芴（乙酰氨基芴（2-acetylomino fluorene）371. 生物素標(biāo)記核酸探針生物素標(biāo)記核酸探針bio-ll

15、dutp、bio-7datp、bio-11-dctp、bio-16-dutp等。等。2. 地高辛（地高辛（dig）標(biāo)記核酸探針）標(biāo)記核酸探針383940414243第三節(jié)第三節(jié) 核酸分子雜交技術(shù)核酸分子雜交技術(shù) 一、類(lèi)型：根據(jù)反應(yīng)環(huán)境分為一、類(lèi)型：根據(jù)反應(yīng)環(huán)境分為1.固相雜交：將需要雜交的一條核酸鏈先固定固相雜交：將需要雜交的一條核酸鏈先固定 在固體支持物上，另一條核酸在固體支持物上，另一條核酸 鏈游離在液體中。鏈游離在液體中。2.液相雜交：參與反應(yīng)的兩條核酸鏈都游液相雜交：參與反應(yīng)的兩條核酸鏈都游 離在液體中。離在液體中。44二、固體支持物種類(lèi)二、固體支持物種類(lèi)硝酸纖維素膜、尼龍膜、乳膠顆粒

16、、磁珠、硝酸纖維素膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠、微孔板等。微孔板等。選擇原則：選擇原則： 具有較強(qiáng)的結(jié)合核酸的能力；具有較強(qiáng)的結(jié)合核酸的能力； 與核酸的結(jié)合比較穩(wěn)定與核酸的結(jié)合比較穩(wěn)定 盡量少的非特異性吸附盡量少的非特異性吸附45三、常用固相雜交類(lèi)型三、常用固相雜交類(lèi)型southern印跡雜交、印跡雜交、northern印跡雜、印跡雜、菌落原位雜交、斑點(diǎn)雜交、狹縫雜交、菌落原位雜交、斑點(diǎn)雜交、狹縫雜交、組織原位雜交、夾心雜交等。組織原位雜交、夾心雜交等。461. southern 印跡雜交印跡雜交主要步驟：主要步驟：47純化的待測(cè)純化的待測(cè)dna樣品樣品 瓊脂糖凝膠電泳分離酶切瓊脂糖凝膠電泳分離

17、酶切dna片段片段 凝膠上凝膠上dna變性變性 中和中和 dna轉(zhuǎn)印至轉(zhuǎn)印至nc膜膜 預(yù)雜交預(yù)雜交 限制性內(nèi)切酶酶切后（限制性內(nèi)切酶酶切后（edta，65滅滅活限制酶）活限制酶） 變性液（堿變性）變性液（堿變性） tris緩沖液緩沖液 高鹽下高鹽下 烘干、固定烘干、固定 雜交雜交 放射自顯影放射自顯影 結(jié)果分析結(jié)果分析 4849southern印跡印跡載體載體凝膠凝膠吸水紙吸水紙緩沖液緩沖液濾紙濾紙固定到載體固定到載體502. northern印跡雜交 是一種將rna從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到nc膜上的方法。與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為western blotting。3. 斑點(diǎn)雜交（dot

18、 blot ）(線狀圓形)514.原位雜交原位雜交（in situ hybridization） 直接用探針與細(xì)胞或組織切片中的直接用探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸雜交。核酸雜交。應(yīng)用：應(yīng)用：1）觀察基因在組織中的表達(dá)）觀察基因在組織中的表達(dá) 2）確定基因在染色體中的定位）確定基因在染色體中的定位525. 菌落原位雜交（colony situ hybridization）將細(xì)菌從平板轉(zhuǎn)移到nc膜上 裂解細(xì)菌釋出dna 烘干 雜交 53四、核酸雜交的應(yīng)用四、核酸雜交的應(yīng)用 在醫(yī)學(xué)研究與實(shí)踐中，核酸雜交主要用在醫(yī)學(xué)研究與實(shí)踐中，核酸雜交主要用于基因診斷。于基因診斷。 1、遺傳病的診斷：例：、遺傳病的診斷：例：-地中海性貧血地中海性貧血 的檢驗(yàn)的檢驗(yàn) 2、病原體的鑒定：例：結(jié)合桿菌的快速、病原體的鑒定：例：結(jié)合桿菌的快速鑒定鑒定3、癌基因點(diǎn)突變分析、癌基因點(diǎn)突變分析4、用于骨髓移植與器官移植時(shí)的組織配型、用于骨髓移植與器官移植時(shí)的組織配型及親子鑒定及親子鑒定54一、蛋白質(zhì)的免疫印跡（一、蛋白質(zhì)的免疫印跡（western)場(chǎng)所：硝酸纖維素膜場(chǎng)所：硝酸纖維素膜待檢分子：蛋白待檢分子：蛋白探針：抗體探針：抗體雜交的方式：經(jīng)電泳分離不同的蛋白，轉(zhuǎn)雜交的方式：經(jīng)電泳分離不同的蛋白，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用特定的抗體與印到硝酸纖維素膜上，用特定的抗體與蛋白雜交，檢測(cè)特