T4DNA連接酶工程科技

1、 t4 dna ligase即t4 dna連接酶，可以催化粘端或平端雙鏈dna或rna的5-p末端和3-oh末端之間以磷酸二酯鍵結(jié)合，該催化反應(yīng)需atp作為輔助因子。同時(shí)t4 dna連接酶可以修補(bǔ)雙鏈dna、雙鏈rna或dna/rna雜合物上的單鏈缺刻(single-strand nicks)。    用途：t4 dna ligase常用于dna片段和載體、linker或adaptor等的連接。也可以用于缺刻修復(fù)及l(fā)igase介導(dǎo)的rna檢測(cè)。    來源：本t4 dna l

2、igase由大腸桿菌表達(dá)，表達(dá)基因的來源為t4嗜菌體。    活性定義：one unit is defined as the amount of enzyme required to give 50% ligation of hindiii fragments of lambda dna in 30 min at 16 in 20 l of the assay mixture containing 50 mm tris, ph 7.5, 10 mm mgcl2, 10 mm dtt, 1 mm atp, 25 g/ml bsa and a 5'-

3、dna termini concentration of 0.12 m(300 g/ml)。200u等于1個(gè)weiss unit，以weiss unit計(jì)，本產(chǎn)品共1000單位。    純度：不含dna內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含rna酶，滿足常規(guī)連接反應(yīng)要求。    酶儲(chǔ)存溶液：20 mm tris, ph 7.5, 50 mm kcl, 1 mm dtt, 0.1 mm edta and 50%(v/v)glycerol。    10x ligation buffer：

4、400 mm tris, ph 7.8, 100 mm mgcl2, 100 mm dtt, 5 mm atp。    失活或抑制：65孵育10分鐘可以導(dǎo)致t4 dna ligase失活；nacl或kcl濃度大于200mm時(shí)強(qiáng)烈抑制t4 dna ligase。包裝清單：產(chǎn)品編號(hào)產(chǎn)品名稱包裝d7008-1t4 dna ligase(1000u/l)200,000ud7008-2 10x ligation buffer1.5ml說明書1份保存條件：    -20保存。注意事項(xiàng)：  

5、0;  對(duì)于普通的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的操作，不必對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行純化，連接產(chǎn)物可以直接用于轉(zhuǎn)化。但用電轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)，通常宜先用dna純化試劑盒或酚氯仿抽提方法等純化dna，然后再進(jìn)行電轉(zhuǎn)。    需進(jìn)行平端連接或快速連接時(shí)，推薦使用碧云天的快速dna連接試劑盒(d7002/d7003)。t4 dna ligase可以進(jìn)行平端連接，但效率較低。    普通的連接反應(yīng)不必進(jìn)行凝膠電泳觀察。如果需要對(duì)于連接產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳觀察，推薦先在65孵育10分鐘使t4 dna ligase失活，以避免

6、t4 dna ligase和dna結(jié)合導(dǎo)致的條帶位置遷移(band shift)。    為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。 使用說明使用說明：1. pcr產(chǎn)物或酶切片段和普通載體的連接：   a. 取1-2g載體酶切過夜，或至少酶切3-5小時(shí)以上。盡量確保酶切充分，否則后續(xù)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生很多      自連的克隆。   b. 載體酶切完畢后，可以使用試劑盒進(jìn)行純化，例如碧云天的pcr純化試劑盒/dna純化試劑盒&

7、#160;     (d0033)。也可以采用常規(guī)的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法純化載體。對(duì)于酶切產(chǎn)生較大片段(大于50-      60bp)的情況推薦采用切膠回收的方式。   c. 對(duì)于pcr產(chǎn)物：pcr產(chǎn)物凝膠電泳后，切膠回收預(yù)期大小的dna片段。凝膠中dna片段的回收可以使      用試劑盒進(jìn)行操作，例如碧云天的dna凝膠回收試劑盒(d0056)。也可以采用反復(fù)凍融等方法回收 

8、60;    dna片段。   d. 對(duì)于回收的pcr產(chǎn)物或其它需酶切的質(zhì)?；騞na片段，用適當(dāng)內(nèi)切酶酶切，隨后純化酶切產(chǎn)物。      注：這一步的酶切不必酶切特別充分，通常酶切效率能達(dá)到80-90%以上即可。即本步驟的酶切      通常酶切1-2小時(shí)即可。酶切產(chǎn)物可以使用試劑盒進(jìn)行純化，例如碧云天的pcr純化試劑盒/dna純      化試劑

9、盒(d0033)。也可以采用常規(guī)的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法純化載體。   e. 取約25-100ng經(jīng)過酶切和純化的載體，加入3倍摩爾數(shù)的待插入片段。參考下表設(shè)置連接反應(yīng)體      系。      注1：很多時(shí)候由于載體量和待插入片段的量都比較少，在回收后很難定量。此時(shí)可根據(jù)回收前      電泳條帶的亮度進(jìn)行大致的估計(jì)。通常以dna分子量標(biāo)準(zhǔn)的某一條帶為參考，估計(jì)或通過灰度半定

10、0;     量您的目的條帶和該參考條帶的亮度的比例關(guān)系。然后再按照預(yù)計(jì)的純化或凝膠回收時(shí)的得率計(jì)      算出最終得到的載體量和待插入片段量的比例關(guān)系。      注2：通常每個(gè)反應(yīng)使用0.2-0.5l連接酶已經(jīng)足夠，如果希望進(jìn)一步提高連接效率，可以把連接      酶的用量提高至1l。載體約50-100ng待插入片段約載體摩爾數(shù)的3倍10x ligation b

11、uffer2l雙蒸水或milliq水至20lt4 dna ligase0.2-0.5l總體積約20l   f. 用移液器輕輕吹打混勻或輕微vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。   g. 20-25孵育連接1-2小時(shí)，或16孵育連接過夜。      注1：對(duì)于雙平端連接必須連接過夜。對(duì)于雙平端連接，直接使用t4 dna ligase連接效率較低，      推薦使用碧云天的快速dna連接試劑盒(d7002

12、/d7003)。      注2：為快速獲得預(yù)期克隆可以參考如下方法：對(duì)于20l的粘端連接反應(yīng)，在連接1-2小時(shí)后可以      取10l直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，其余10l可以16孵育連接過夜。如果第二天順利獲得克隆，即可進(jìn)      入下一步實(shí)驗(yàn)；如果第二天轉(zhuǎn)化的大腸桿菌未獲得預(yù)期的克隆，則可以取連接過夜的剩余連接產(chǎn)      物再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌。 &

13、#160; h. 隨后即可直接取連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌。2. pcr產(chǎn)物和t載體的連接：   a. pcr產(chǎn)物凝膠電泳后，切膠回收預(yù)期大小的dna片段。凝膠中dna片段的回收可以使用試劑盒進(jìn)行操      作，例如碧云天的dna凝膠回收試劑盒(d0056)。也可以采用反復(fù)凍融等方法回收dna片段。   b. 按照t載體的說明書取適量t載體，加入3倍摩爾數(shù)的待插入片段。參考下表設(shè)置連接反應(yīng)體系。      

14、;注1：很多時(shí)候由于載體量和pcr產(chǎn)物的量都比較少，在回收后很難定量。此時(shí)可根據(jù)回收前電泳      條帶的亮度進(jìn)行大致的估計(jì)。通常以dna分子量標(biāo)準(zhǔn)的某一條帶為參考，估計(jì)或通過灰度半定量您      的目的條帶和該參考條帶的亮度的比例關(guān)系。然后再按照預(yù)計(jì)的純化或凝膠回收時(shí)的得率計(jì)算出      最終得到的載體量和pcr產(chǎn)物的量的比例關(guān)系。      注2：

15、通常每個(gè)反應(yīng)使用0.2-0.5l連接酶已經(jīng)足夠，如果希望進(jìn)一步提高連接效率，可以把連接      酶的用量提高至1l。t載體適量待插入片段約載體摩爾數(shù)的3倍快速連接緩沖液(2x)2l雙蒸水或milliq水至20lrapid t4 dna ligase0.2-0.5l總體積約20l   c. 用移液器輕輕吹打混勻或輕微vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。   d. 20-25孵育連接1-2小時(shí)，或16孵育連接過夜。    &

16、#160; 注：為快速獲得預(yù)期克隆可以參考如下方法：對(duì)于20l的粘端連接反應(yīng)，在連接1-2小時(shí)后可以      取10l直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，其余10l可以16孵育連接過夜。如果第二天順利獲得克隆，即可進(jìn)      入下一步實(shí)驗(yàn)；如果第二天轉(zhuǎn)化的大腸桿菌未獲得預(yù)期的克隆，則可以取連接過夜的剩余連接產(chǎn)      物再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌。   e. 隨后即可直接取連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌

17、。3. linker或rnai片段和載體的連接：   a. 載體的酶切和純化同步驟1a和1b。   b. linker或rnai片段的退火可以選擇適當(dāng)?shù)膁na退火緩沖液，例如碧云天的annealing buffer for       dna oligos(5x)(d0251)， 進(jìn)行退火反應(yīng)。   c. 長(zhǎng)度大于8bp的linker或退火的rnai片段，可以按照5:1至10:1的比例和載體進(jìn)行連接反應(yīng)。例如      載體為0.03pmol，則插入片段可以為0.15至0.3pmol。長(zhǎng)度小于8bp的linker，比例需調(diào)整為10:1      以上。   d. 除插入片段的用量外，隨后按照步驟1e，1f，1g，和1h進(jìn)行。4. dna自身環(huán)化的連接：    參考步驟1e，待插入片段換成適量的水即可。其余步驟按照步驟1f，1g，和