基因工程的基本操作程序 (2)ppt課件

1、2 2、表達載體的構(gòu)建表達載體的構(gòu)建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細胞、將目的基因?qū)胧荏w細胞4 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取( (一一) )、目的基因主要是、目的基因主要是_編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因請舉出三個以上的例子請舉出三個以上的例子（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些? ?1 1、從基因文庫中獲取、從基因文庫中獲取2 2、利用、利用PCRPCR技術(shù)擴增技術(shù)擴增3 3、用化學(xué)方法人工合成、用化學(xué)方法人工合成請閱讀請閱讀P9P9第一和二兩段第一和二兩段一、目的基因的獲取一、目的基因的獲?。?/p>

2、一）從基因文庫中直接獲?。ㄒ唬幕蛭膸熘兄苯荧@取1.基因文庫：概念見基因文庫：概念見P92.基因文庫的分類基因文庫的分類:按外源按外源DNA片段的來源分類片段的來源分類種類種類基因組基因組DNA文庫：含有一種生物的全部基因文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因， 如：如：cDNA文庫文庫3.基因文庫的目的基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。4.獲取目的基因的根據(jù)：獲取目的基因的根據(jù)：見課本見課本P9提取某種生物的全部提取某種生物的全

3、部DNADNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖杏眠m當(dāng)?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉囊欢ù笮〉腄NADNA片段片段將將DNADNA片段與載體連接片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲存導(dǎo)入受體菌中儲存基因組文庫基因組文庫某種生物的單鏈某種生物的單鏈mRNAmRNA單鏈互補單鏈互補DNADNA雙鏈雙鏈cDNAcDNA片段片段導(dǎo)入受體菌中儲存導(dǎo)入受體菌中儲存與載體連接與載體連接cDNAcDNA文庫文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶（2 2）反轉(zhuǎn)錄法：）反轉(zhuǎn)錄法：cDNAcDNA的合成流程圖解的合成流程圖解 概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù)

4、 聚合酶鏈式反應(yīng)聚合酶鏈式反應(yīng)體外體外特定特定DNADNA片段片段原理：原理：DNADNA復(fù)制復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物 過程過程高溫變性（解旋為單鏈）高溫變性（解旋為單鏈）低溫退火（引物與單鏈互補結(jié)合）低溫退火（引物與單鏈互補結(jié)合）適溫延伸（在適溫延伸（在TaqTaq酶的作用下合成酶的作用下合成 與模板互補的與模板互補的DNADNA雙鏈）雙鏈）重復(fù)循環(huán)重復(fù)循環(huán) 概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù) 條件：條件：_、 _ _、_ _ 、

5、_. _.等等原理：原理：_方式：以方式：以_方式擴增，即方式擴增，即_（n n為擴增循為擴增循 環(huán)的次數(shù)）環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：結(jié)果：聚合酶鏈式反應(yīng)聚合酶鏈式反應(yīng)體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA復(fù)制復(fù)制四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對引物一對引物DNADNA聚合酶聚合酶指數(shù)指數(shù)2 2n n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增過程：過程：a a、DNADNA變性（變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、退火（、退火（復(fù)性復(fù)性55-6555-65）：系統(tǒng)溫度降低，

6、引）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與物與DNADNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成與模板互補的合成與模板互補的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈PCR技術(shù)擴增與技術(shù)擴增與DNA復(fù)制的比較復(fù)制的比較PCR技術(shù)技術(shù)DNA復(fù)制復(fù)制相相同同點點原理原理原料原料條件條件不不同同點點解旋方式解旋方式場所場所酶酶結(jié)果結(jié)果堿基互補配對堿基互補配對四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋酶催化體外復(fù)制體外復(fù)制細胞核內(nèi)細胞核內(nèi)

7、熱穩(wěn)定的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶聚合酶細胞內(nèi)的細胞內(nèi)的DNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片段形成整個形成整個DNA分子分子1、目的：、目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。基因能夠表達和發(fā)揮作用。復(fù)制原點復(fù)制原點+ +目的基因目的基因+ +啟動子啟動子+ +終止子終止子+ +標(biāo)記基因標(biāo)記基因它們各自的作用是什么它們各自的作用是什么?位于基因的首端的一段特殊的位于基因的首端的一段特殊的DNADNA片斷，它是片斷，它是RNARNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)聚合

8、酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出錄出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質(zhì)，最終獲得蛋白質(zhì)位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片斷，能終片斷，能終止止mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來因，從而將有目的基因的細胞篩選出來載體與表達載體的區(qū)別：載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DNADNA片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)動子、終止

9、子三部分結(jié)構(gòu)用到的工具酶：限制酶和用到的工具酶：限制酶和DNADNA連接酶，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵連接酶，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少目的基因不能單獨進入受體細胞，必須以表達載體的方式攜帶進去。目的基因不能單獨進入受體細胞，必須以表達載體的方式攜帶進去。（一）轉(zhuǎn)化：（一）轉(zhuǎn)化： （二）方法（二）方法將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛毎参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麆游锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法

10、顯微注射法感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞目的基因進入目的基因進入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在 受體細胞內(nèi)維持受體細胞內(nèi)維持_和和_的過程的過程受體細胞受體細胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達表達易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力原理：原理：Ti質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。上。過程：過程：優(yōu)點優(yōu)點（2）基因槍法基因槍法（3）花粉管通道法花粉管通道法2 2、將目的基因?qū)雱游锛毎⒛康幕驅(qū)雱游锛毎椒ǎ猴@微注射法方法：顯微注射法程序：程序：目的基因表達

11、載體提純目的基因表達載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀新性狀動物動物3 3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎?、將目的基因?qū)胛⑸锛毎松锾攸c：繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少方法：方法： 用用Ca2+處理細胞處理細胞 感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞 表達載體與感受態(tài)細胞混合表達載體與感受態(tài)細胞混合 感受態(tài)細胞吸收感受態(tài)細胞吸收DNA分子分子檢查是否成功檢查是否成功（一）、檢測（一）、檢測.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記片段用放射性同位素等作

12、標(biāo)記,以此做探針以此做探針.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體表明染色體已插入染色體DNA中中（1）方法方法: :DNADNA分子雜交分子雜交（2）過程）過程:歸納步驟 采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNADNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單

13、鏈。的部位，仍然是兩條游離的單鏈。 P P1515思考與探究思考與探究（二）、鑒定（個體生物學(xué)水平）（二）、鑒定（個體生物學(xué)水平）3 3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法: :分分 子子 雜雜 交交方法方法: :抗原抗體雜交抗原抗體雜交過程過程: 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交雜交,若出現(xiàn)雜交帶若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA歸納步驟(四四)目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定檢查是否成功檢查是否成功檢測檢測鑒定鑒定檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的

14、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子雜交分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）分子雜交（注意與上不同之處）抗原抗體雜交抗原抗體雜交歸納: 基因工程的基本操作程序獲取目的基因獲取目的基因u從基因文庫從基因文庫u利用利用PCRPCR技術(shù)擴增技術(shù)擴增u化學(xué)方法人工合成化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達載體構(gòu)建基因表達載體u目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)

15、記基因目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞u農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定u檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯u鑒定：鑒定：練習(xí)練習(xí)1：(2008理綜山東卷理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切

16、酶作用于圖中的分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的 處，處，DNA連接酶作用于連接酶作用于 處。（填處。（填“a”或或“b”）aa練習(xí)練習(xí)1：(2008理綜山東卷理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和分子導(dǎo)入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和 法。法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用）由導(dǎo)入目的基因的水

17、稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用 技術(shù)，該技術(shù)的核心是技術(shù)，該技術(shù)的核心是 和和 。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的 作探針進行作探針進行分子雜交檢測，又要用分子雜交檢測，又要用 方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性?；驑尫ǎɑǚ酃芡ǖ婪ǎ┗驑尫ǎɑǚ酃芡ǖ婪ǎ┲参锝M織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)脫分化和再分化脫分化和再分化耐鹽基因耐鹽基因一定濃度鹽水澆灌一定濃度鹽水澆灌1）以下說法正確的是）以下說法正確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列、所有的限制酶只能識

18、別一種特定的核苷酸序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體 C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來C C2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是）不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是 A、能復(fù)制、能復(fù)制 （ ） B、有多個限制酶切點、有多個限制酶切點 C、具有標(biāo)記基因、具有標(biāo)記基因 D、它是環(huán)狀、它是環(huán)狀DNA3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（）有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（ ） A、DNA連接酶

19、將黏性末端的堿基對連接起來連接酶將黏性末端的堿基對連接起來 B、 限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運載體導(dǎo)入受體細胞、目的基因須由運載體導(dǎo)入受體細胞 D、 人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是）有關(guān)基因工程的敘述正確的是 （ ） A、限制酶只在獲得目的基因時才用、限制酶只在獲得目的基因時才用 B、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成 C、質(zhì)粒都可作為運載體、質(zhì)粒都可作為運載體 D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料5）基因工程是在）基

20、因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是基互補配對的步驟是 （ ） A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因與運載體結(jié)合、目的基因與運載體結(jié)合 C、將目的基因?qū)胧荏w細胞、將目的基因?qū)胧荏w細胞 D、目的基因的檢測和表達、目的基因的檢測和表達非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結(jié)合位點聚合酶結(jié)合位點啟動子啟動子終止子終止子啟動子：位于基因首端一段能與啟動子：位于基因首端一段能與RNARNA聚合酶結(jié)合并

21、能起始聚合酶結(jié)合并能起始mRNAmRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。能轉(zhuǎn)錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片斷，它能阻礙片斷，它能阻礙RNARNA聚合酶的移動，并使其從聚合酶的移動，并使其從DNADNA模板鏈模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。RNARNA聚合酶聚合酶: :能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì)能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).(.(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落) )不能轉(zhuǎn)錄為信使不能轉(zhuǎn)錄為信使RNARNA，不能，不能 編碼蛋白質(zhì)。編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNARNA，能，能 編碼蛋白質(zhì)編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞原核細胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)有調(diào)控遺傳信息表達的核有調(diào)控遺傳信息表達的核 苷酸序列，在該