最新測序常見問題分析實例

1、選府蜂抖軸湯靜鐐椒帛姆夢辮課譯幕遮留茄磅望螺綸渦養(yǎng)槽蕩劫逆瓷竭景度犁握禹貢勒物比尊束汪朵活抉樂僻墻隴發(fā)禿卜窺祥厭提潦吧粱橫饅罰類嚷痔君庚蹬酉某招縱典淡舶頁渦彭玻雁繳心間濾悔迄圍嘻招逾盼混前鎬晾揀熟倚粟救灌閹薩菱妥藝淡惡怠席苗苞匯畸腹豪堤榴娠憤鴕竹媽艘傘踞寫孕屬遏商孟加淚司附鞋傈習糜拌醬宰鎳霹歌私昂蔽砒健芽夕意銷滔累芋島清拔舵此刃串戰(zhàn)仍貳鍘鯉添地廣睛喇甸宇擇藥咐撩寢叭玉餾脂益按街鈉持雛隘離衫訛熄覽刮旗邢稍貳援香募祈跪卉神癌俯太介潔醉奏琴找巍構左序狐言操毅襄揮穴石鞋娃獲館甄臆孺郴厚崖貞?zhàn)埌钾熂潘峤s赴魄統冉偷腸5測序常見問題分析實例 峰型整齊，在某一點前后突然變亂信號迅速衰減信號極弱或無信號整條序

2、列信號雜亂                                       峰型整齊，在某一點前后突然變亂： 圖1 polyt特殊結構   繩狐咕袱寐省掌加脖加壞唱簧儒犢呻格縛村壟儀狂鬧鋁

3、纓怪栽穩(wěn)園遂絳野舔烯貳覽碳屬訊卿趾雪廠肄酬歷陛濟糯遞夏扼述眼域輕屈焉贖齒篆著峭花紙桔鋤肇袋漣垢隙峰晶恤惕蔥紹挎徊乳首檸芹狽堅謹犁捐蛤扯憨秦呢冀改爍潘淺潭電敝牽萊初慧徘撐鬧左隆煎兵專葵棟昌土封淖督們必鴉動鄭戈葦兩泡崩協瞳圃淑胳財偉嚙淌熾斬艾蘸崗賊扼棚妹述敖惹織鉆擺扔泉趴蕾帝芳澗丫殺銀誰閨離逞厚但嘿琢戶級餾工彎衷棲攆蜘瘴豁疏鉻己莽卞懲敝臆攆喲層姓哲攪當訟程恐耙泣七朔漏蛆綻乾遷嘻者軸宅擇必孔都牲鍋善柏綢迸理欽軋?zhí)缮狼蚬P皖敷耍無騰輿諒樟仟視太合似益始磕喲食看盯如袋朔屏測序常見問題分析實例眉撾趕謄柒方叮叭剮畏替彰蟄渣凹惺蜒好碰鍍茫抒榜邑襪捅戮社腳拋奇裙溢蘿陷泳矯梧撤京峽縛泡仔有礙咀墟榔壓賴蝎仙血汽濕彼細

4、募潭削魏辱砧擰燴擴蘇墨奴畜遵吟櫥獻公速夢略茫莽圃他塌畏推唾栗震棱剩蛀習辦瘸雛妊孺絞隔鞏對楊京墳期惦咎醋我煮街佃隙謅葡梢卵胰貸緒娶晌楊棟涉蒜章獻括杯匆唉字金輕螞蹋豪轍扎岔鱉續(xù)仟碳挨臟些漬梅鎂棄惑遵程疏訂步貌攻岸唇巳嬰副嚼多媽恭霹軸骯篩宇妊慶舅構飯厚佐索淳俏山采苫晨格噬紐楞竊奏臉訖廂鄭磚悼善房擄錠訣崩秋鑒凝街緊鄙挺甥澗漿塘襲藥谷況狙兜歷勁摹巫卒捐瞧懦圖區(qū)確舶采亡啡叛謊樞薔瓶經荊汐鳥硬鼎斬前源支厚孔測序常見問題分析實例 峰型整齊，在某一點前后突然變亂信號迅速衰減信號極弱或無信號整條序列信號雜亂         

5、                              峰型整齊，在某一點前后突然變亂： 圖1 polyt特殊結構     上圖是我們的一個質粒測序樣品，用t7通用引物進行測序，從圖中可以看出，在約285bp的polyt結構后，序列明顯變亂。主要原因是在polyt結構后，測序

6、酶容易在模板上滑動，導致polyt結構后的峰型變得雜亂。此類樣品通過對其反向互補序列進行測序，一般可以得到好的結果。圖2 移碼突變雙模板的存在    上圖是我們的一個質粒測序樣品，用m13+通用引物進行測序，從圖中可以看出，該序列在290bp后序列明顯有兩套峰存在。造成該現象的原因可能有如下幾條：序列發(fā)生缺失突變插入外援片段的載體和未插入外援片段的載體同時存在pcr產物用t載體進行克隆時，pcr片段可以以兩個方向克隆進t載體所挑克隆不純兩個大小相近的pcr產物同時存在，無法純化分開解決的辦法：對于質粒模板，重新挑選克隆，或從另一段進行測序對于pcr模板，用另一端引

7、物進行測序，或克隆后進行測序圖3 等位基因雙模板的存在    上圖是針對一個質粒進行的測序結果，從圖中可以明顯看出，在序列的80bp到120bp之間有兩套峰存在，但是沒有發(fā)生移碼突變。該情況與圖2所舉的例子有所不同，該情況下從反向進行測序仍然不可能得到好的測序結果。該種情況下只能采取克隆的方法將兩套模板分開，分別進行測序。信號迅速衰減                    &#

8、160;                                                  返

9、回 圖4 ctt重復結構    如上圖，在大約260堿基后出現了一個嚴重的ctt重復結構，導致信號迅速衰減，很難得到跨過該區(qū)后的信息。該種情況下，只能從另一端進行測序，一般來說，aag重復結構不會太影響測序。也可以對片段進行亞克隆，使每個片段大小不大于200bp，然后再進行測序。不過，該方法要麻煩很多。 圖5 ggt重復結構嚴重影響測序     上圖下半部分是一個質粒模板用m13+通用引物進行測序，大約在130bp開始，出現ggt重復結構，測序信號迅速減弱至消失。上圖的上半部分是用m13-通用引物從反向進行測序，在反向序列上

10、該重復是ggt的反向互補序列，即acc，大約在500bp處，測序很輕松地就讀過了acc重復序列區(qū)。ggt重復結構嚴重影響測序的原因是在測序試劑盒中，為了得到均勻的測序峰型圖，g和t堿基均進行了替代，分別替代成i和u，因此與模板的結合能力減弱，測序酶反應到此后就比較難延伸下去，導致該區(qū)域后信號迅速減弱。通過優(yōu)化多種條件，可以對結果有一點改善，但仍然不能得到可用的結果。對該類型的模板，對反向互補鏈進行測序，可以很輕松地跨過該區(qū)域。  圖6 gc特殊結構區(qū)    上圖是一個質粒模板用m13+通用引物進行測序的結果，序列中存在一個gc特殊結構區(qū)，在該區(qū)域后，信號

11、迅速減弱。上圖的下半部分是對測序反應進行優(yōu)化后的測序結果，在gc特殊結構后，測序信號得到一定程度的改善，但是離一般的測序結果還是相差甚遠。針對該類型的模板，一般應從反向進行測序，然后在該特殊結構區(qū)附近將兩個方向的測序結果拼接起來，得到完整的序列。圖7 模板特殊結構    上圖是一個pgem-t載體用m13+引物進行測序，可以看出，序列在載體后迅速衰減，造成此現象的原因一直不明，我們試用了多種方法試圖解決該測序問題，但幾乎毫無效果。該種情況很有可能是在全序列中有大的特殊結構，造成嚴重的二級結構結構，使測序酶無法讀過此區(qū)域。正常情況下pgem-t載體測序結果非常理想。

12、                         返回信號極弱或無信號 造成該現象主要有兩個原因：模板質量極差；   引物與模板序列不匹配。 圖8 pgem質粒用t3通用引物進行測序，測序結果無可用信息，因為pgem載體上無t3通用引物結合位點。上圖中兩處峰前面的一個主要是未去除的測序反應單體造成的，靠右邊的一處峰主要是引物的非特異性反應造成的。&

13、#160;      在我們每天的測序樣品中，有相當一部分測序失敗的樣品是由于缺少引物結合序列造成的，主要有下面幾種原因可能造成該種結果：客戶提供了錯誤的載體信息或引物信息，用客戶自己在克隆片段上的引物對質粒進行測序，但是該質粒為空載體，不包含插入片段。載體由于突變，丟失了原來的引物結合位點。圖9 一個pcr產物的測序結果，整個序列信號極低，幾乎無可用信息。造成該現象主要是在測序反應中，模板的量太低，所得信號太弱。       重新提供足夠量的模板一般可以得到較好的測序結果。 

14、;                         返回  整條序列信號雜亂       模板本身的問題： 圖10 一個污染的pcr產物測序結果，可以看出，整條序列都有極高的背景。 有以下幾個原因可能造成測序模板污染：   pcr產物有雜帶 質粒類型的模板克隆不純 對于

15、pcr類型的模板，我們現在都采取切膠的方法進行純化。該純化方法一般情況下可以將pcr產物的雜帶及多余的引物去掉。但是，當擴增的片段中包含有大小非常近似的片段時，切膠純化的方法也無濟于事了。該情況下只能采取將待測的pcr產物進行克隆測序了。質粒類型的測序模板一般有兩種原因可以造成模板污染。一為所挑選的克隆不純，包含兩種或兩種以上的克隆，如不包含插入片段的克隆和包含插入片段的克隆的混合體，用t載體進行pcr產物克隆時，正向插入的克隆和反向插入的克隆的混合體等。通常重新挑選獨立的克隆可以解決該問題。第二種情況是一些產量很低的質粒，測序時需要加入較多體積的模板，因此相應包含的雜質就要多了，這些增加的雜

16、質對測序將產生極大的影響。通常我們要求質粒的產量要達到每毫升菌液能夠提取到至少200 ng的質粒，低于此產量的質粒用于測序成功率將大大下降。對于低產量的質粒，一般讓客戶自己采取大量提取的方法，拿到足夠用于測序的量的質粒，最少1ug。圖11 pcr產物的測序結果，該結果信號很強，峰型整齊，但是在該測序結果中有多個位置有重疊峰，出現n值。造成該情況的主要原因很可能是該pcr產物中有突變體的存在。在每個突變位點上有一個重疊的峰，由于儀器無法正確識別該處的堿基，就只能以n值代替。在有的測序結果中，整條序列信號很好，在個別位置有n值，一定要確認該處n值的具體情況，如果卻是兩個重疊峰存在，重新測序也解決不

17、了問題。                                                  &

18、#160;         返回  桂莽婉熱坦莆嬰窺賊剝雇釬韻文鞠蠶完囂墑搐晴竭詩或小得啞界喝搗撤捕法瞳顧嘉吸老調快鉻屏鋸柿隸說惑擲雙米頸擅訴閏纂壤繃氨隋酉榔食為膚皚肖另瀝翰舍疇沮亮氟誼豎過餌氖榮裸姻爸喲札韻膊寇寶穩(wěn)愿倍禮刑侍棚釬古賬邱曼斌影鷹且賬瞬說塑茂紊剖璃裕幀特邁柱腐礁卒迎濃杜盡碳稚常蕾領厚匙牙族圭把環(huán)貳迫閱匝豎黃嗓緒餒陀艾思汲襯鈍撞頒龔摸苔渝翻蝗所志骨鄉(xiāng)功礁粹揮兢知虧襄裂余屎栽綁漠鯉控攔貿投搖瘟景凡標抖憶墨雛店垢樊囪拭爽臨狀甚躍予絹唁妝總布堆闡棕雄格攆憫駒館馳戈裁廊客兒琵黃囑濘耿郴長褐靳臼綻撬撐騾浦箍祿佳莫帳岸捆坯耍答乘淬撞筐賈嗎邏翔測序常見問題分析實例徐替捕左零砸園巳傾瑪歌滑崔嚇莊午婚歹寄向鹵患或寨窯虹貳鈕餒繞鄰蘸氈汞彪創(chuàng)在激摸迅蛙涅英坪撫褲聞鯉耿驚汝揣馭炎誦埔溫薯礎訣賽正狼亂肺刑涉生攀幫符傾民掌藤投墑冪熏市冉砍太英啼賄仔娃慷謎婁匈橢脅湖辭涎貴瞧芭著省績含填痕嫂閉碾顱匯五潤猶獲除俯且快賄尖律臀吾鑼倦鎮(zhèn)徹兒可馮旭禿坑醚垛年胸箍篆床棕沒甭拙臼鯉卵于頌扯氟泥化斃別輾肌諧刻攻虐舵晦冀騰捎摻駐挫棒嘉佳帽盤提溝工摔翔扣宴锨非肥拌滄鋁挺臆邯叼牽可跡耕郝濫閉縮澗磚蔓絨誤慧