實驗1植物組織中幾種重要碳水化合物

1、實驗1 植物組織中幾種重要碳水化合物 的分組分離及其測定 一、植物組織中幾種重要碳水化合物的分組分離植物體內的碳水化合物按照化學性質，可分為單糖、寡糖和多糖三大類，每一類中又可分為若干種，其生理作用各不相同。測定時按照測定目的不同可分類提取，分別測定。常用的分離提取方法是根據各種碳水化合物在乙醇和水中的溶解度不同，以及水解的難易加以區(qū)別。這種方法在一般的營養(yǎng)狀況研究中經常采用。當需要對每一種糖進行分離鑒定時，則必須利用更加精密的分離方法，如紙層析分離法或直接在紙譜上顯色，利用光密度計鑒定?，F代的高效液相色譜分析更是進行碳水化合物分離鑒定的有效手段。本實驗只介紹常規(guī)的分離方法。原理碳水化合物中的

2、單糖及寡糖易溶于水及乙醇，而糊精、果聚糖等多糖可溶于水但不溶于乙醇；淀粉不溶于冷水，但經加熱糊化后亦可部分溶于水中，半纖維素不溶于熱水，但可用稀酸水解，纖維素則只可用濃硫酸方可水解，故可用不同方法提取植物樣品以測定不同類型的碳水化合物?？扇苄蕴牵▎翁恰⒐烟牵┮话阌?2%乙醇提取，其殘渣經4050熱水提取，可測定其中的糊精、果聚糖（葡糖）等水溶性多糖。剩余部分有淀粉、半纖維及纖維素，其中淀粉可用淀粉酶水解，也可用過氯酸提取，殘渣用2%的鹽酸加熱水解，以測定半纖維素，而纖維素則用80%的濃硫酸溶解，分別測定各級提取液及水解液，即可求出各種類型碳水化合物的含量。方法（一）樣品的預處理測定碳水化合物的

3、含量可用新鮮樣品或烘干樣品。其原則是，從取樣至樣品完全殺死以前，盡量減少植物體內碳水化合物的含量及種類的變化。當用于樣品分析時，應迅速將樣品放在105烘箱中20分鐘左右，將細胞殺死，然后在80下烘干。幼嫩材料含單糖多的，烘干溫度過高糖易焦化，最好在60下，用真空干燥箱烘干。樣品烘干后，用粉碎機粉碎，全部通過60目篩，即可作為分析樣品。如用鮮樣品直接分析，應取剪碎的新鮮材料二份，準確稱重，一份放入105烘箱中，烘至恒重，測其含水量，以求得供試材料的干重，另一份立即投入幾乎沸騰的95%乙醇中，以停止酶的活動，乙醇的用量應使加入植物材料后，其濃度不低于80%，如此固定的材料也可長期保存。（二）碳水化

4、合物的系統分離較細致的分離方法可將碳水化合物分為以下五組：1可溶性糖類（包括單糖、寡糖），可按下列步驟進行：（1）浸提：精確稱取干樣品二份，第一份重5克，于105下烘至恒重，測定含水量。另一份重1克，供分析用。將樣品投入100ml三角瓶或大試管中，加82%的中性乙醇20-30ml（乙醇用量依材料中含糖量而定，含糖量高的應適當多加），瓶口塞以帶長玻管的塞子，作回流冷凝用。將三角瓶固定在支架上，在7075恒溫水浴中抽提30分鐘，如材料含酸過多，應加少量飽和Na2CO3溶液中和，以防提取過程中蔗糖的水解。浸提完畢，待澄清后，將上清液過濾入蒸餾瓶中（過濾時盡量避免將殘渣傾倒在濾紙上），另換乙醇浸提，反

5、復3-4次（后幾次浸提時間可減至1015分鐘），最后把全部乙醇提取液連同殘渣過濾入蒸餾瓶中（如為新鮮材料，應將固定時所用乙醇一并傾入蒸餾瓶中），用少量乙醇沖洗容器及漏斗中殘渣，不使糖分有損失。殘渣保留，供分析第二組碳水化合物用。（2）蒸去乙醇：將上述乙醇提取液在4045水浴上進行減壓蒸餾，當濃縮成漿狀物以后，再加蒸餾水10ml，繼續(xù)蒸餾，以去盡殘留的乙醇，最后再在粘漿狀物中加少量溫暖的蒸餾水，以溶出可溶性糖，轉入另一錐形瓶中，用少量蒸餾水洗滌蒸餾瓶，洗后的水也倒入同一錐形瓶中，使總體積不超過40ml，蒸餾瓶壁上若有不溶物，可不必管它。亦可將提取液洗入蒸發(fā)皿中，放在4045水浴上蒸發(fā)，至乙醇完全

6、蒸發(fā)為止，冷卻后，用水約20ml溶出可溶性糖，無損地轉入錐形瓶中。（3）沉淀蛋白質：向浸提液中滴入10%中性醋酸鉛，以沉淀蛋白質，直至不再產生沉淀為止。再滴入10%硫酸鈉或草酸鈉溶液以除去多余的鉛，以免妨礙以后的分析，直至不再產生沉淀為止。過濾入50ml容量瓶中，用少量蒸餾水沖洗容器及殘渣數次，洗滌液一并加入容量瓶中，最后加水定容，即可供測定用。有些提取液中蛋白質等雜質少，沉淀蛋白質一步可省去，提取液立即測定，以免微生物滋生，如須保存一定時間，應放入冰箱中，或加12滴氯仿防腐。（4）還原糖的測定：把提取液配制成適當濃度（如提取液濃度過高，應按一定倍數稀釋后測定，記下稀釋倍數），然后測定還原糖濃

7、度A（mg/ml），再以下式求出組織中的還原糖（包括單糖及1/2麥芽糖）： 還原糖（%）=(還原糖濃度A×提取液總量×稀釋倍數)/組織干重×100 （5）蔗糖的測定：吸取提取液4ml加入大試管中，加入10%HCl 1ml，使溶液中HCl濃度為2%，若溶液含糖量高，可適當減少提取液用量，同時適當調整HCl用量，仍使溶液中HCl濃度保持2%，在70水浴上加熱5分鐘，以水解蔗糖。然后用Na2CO3飽和溶液中和，用適當方法測得還原糖濃度B（mg/ml）。其中包括單糖、1/2麥芽糖和蔗糖。從B值減A值再乘以0.95，既為蔗糖濃度，依下式求組織中蔗糖百分率： 蔗糖（%）=（6

8、）可溶性糖總量的測定：利用2%的HCl在70下水解5分鐘只能水解蔗糖，其它可溶性糖類如麥芽糖及其它三糖、四糖等，須在沸水浴中3小時方可完全水解。因此，為了測定可溶性糖總量，可以按照蔗糖測定法吸取一定量的提取液，加HCl，使成1%濃度，在沸水浴中水解3小時，取出中和，其它步驟同蔗糖。測得總糖量為C（mg/ml），其中包括單糖、蔗糖、麥芽糖和少量其它寡糖類，如果提取液中的雙糖以蔗糖和麥芽糖為主，則可按下列公式計算麥芽糖的近似值： 麥芽糖（%）=按照以上三個測定數字，亦可大至計算出單糖含量： 單糖=由于提取液中總會含有少量其它寡糖類，故對于麥芽糖和單糖的計算都是近似的。若要精確的定量分析各種糖類，則

9、應先進行色層分離，然后逐一進行定性與定量分析。2水溶性多糖類（包括糊精、菊糖和低分子果聚糖、粘多糖和一部分果膠類物質），其步驟如下：（1）將提取可溶性糖后的全部殘余物風干或在50下烘干，以除去乙醇。然后加4050溫水浸提，每克干物質用水2030ml，浸提34次，每次提取液均用玻璃過濾器過濾。如果在提取可溶性糖后立即提取水溶性多糖，亦可免去烘干步驟，而將濾紙上的沉淀全部洗入小燒瓶（或錐形瓶）中，如果要在第二天進行分析，則應在溶液中加12滴氯仿，并用塞子塞住瓶口。（2）合并濾液，在沸水浴上適當濃縮。（3）向濃縮液中加入適當的1020%HCl，使總的HCl濃度為2%，在沸水浴上水解3小時，用Na2C

10、O3中和后加入醋酸鉛及硫酸鈉除去蛋白質如前。過濾入容量瓶中配成適當濃度的溶液，測定還原糖，還原糖量乘以0.9，即為水溶性多糖。依下式求出組織中水溶性多糖的%：水溶性多糖（%）=(還原糖濃度×0.9×提取液總量×稀釋倍數)/組織干重×100注：組織干重系指提取可溶性糖之前樣品的干重，下同。（4）由于此法中約有25%的果糖分解，因此，對含菊糖較多的材料，應從上述濃溶液中分出一小部分（應準確計算占溶液總量的%，在測定結果中補入這一部分）測定菊糖。測定方法可用0.10.15%的HCl在沸水浴上水解30分鐘，或用2%HCl在6770水浴上水解5分鐘，然后測定還原糖

11、。把測出的還原糖量×0.25×0.9作為校正值，加入前一測定值中。3淀粉將提取水溶性多糖后的殘余物，洗入燒瓶中，加入適量的水（每1g材料共用1015ml）在沸水浴中糊化30分鐘，如果材料含果膠很多，則只能在60水浴中加熱30分鐘，因為溫度過高，果膠易溶于水中。糊化完畢，待溫度降至50左右時，加入適量的淀粉酶液和幾滴甲苯，塞好塞子，置于4045的恒溫箱中24h，取出少量殘渣用I-KI檢查淀粉是否完全水解。待完全水解后，用玻璃過濾器過濾，洗滌瓶壁和殘渣，此時濾液中含有淀粉的水解產物糊精和麥芽糖。將濾液濃縮，加HCl使成2%濃度，在沸水浴中水解3h，中和后測定還原糖量，測定值乘以

12、0.9即為淀粉含量。計算公式同水溶性多糖。如有必要，亦可如前法沉淀蛋白質。4半纖維素與果膠類物質將測定淀粉后的殘渣，全部洗入燒瓶中，加鹽酸使成2%的濃度，在沸水浴上水解3h，中和后用玻璃濾器過濾。把過濾液配成適當濃度的定量溶液，然后測定還原糖濃度。還原糖量乘以0.9即為第四組碳水化合物總量。計算公式同水溶性多糖。5纖維素把測定半纖維素之后的殘渣洗出，在50下烘干，移入燒瓶，加10倍重量的80%硫酸，置室溫下2.5h，其間搖動幾次，玻璃濾器上粘附的少量纖維素也加入少量硫酸溶解。浸泡2.5h后，小心地向酸中加入15倍體積的水，置沸水浴上水解5h，中和后，加水至一定量，或再稀釋成一定倍數，然后測定還

13、原糖量。測定值乘以0.9，即為纖維素量，計算公式同水溶性多糖。（三）碳水化合物的簡易分組分離法按照上述分離方法將碳水化合物分為五組，分別測定，雖能測出各類化合物的含量，但手續(xù)繁雜，費工費時，對于許多測定來說，并非必需，故實際應用中，常采用一些變通辦法，將某些組分合并測定，至于具體的合并方法，則根據測定目的及測定材料所含的碳水化合物種類而定。一般來說，可以按碳水化合物在植物體內的作用分成三大類。第一類：可稱為“代謝性碳水化合物”，這類碳水化合物多屬代謝中間產物，如光合碳循環(huán)和呼吸作用的五碳糖循環(huán)中的糖類，作為呼吸底物的葡萄糖和果糖，以及它們的磷酸酯等等，這類碳水化合物往往是一邊生成，一邊轉化，很

14、少在體內積累，所以含量常常很低，而且比較穩(wěn)定。第二類是貯藏性碳水化合物，它們常常在某些貯藏器官（種子、塊根、塊莖、鱗莖等）或暫存性器官（莖、葉鞘等）中大量積累，以供應下一個生活周期或下一個生育階段的需要，尤其是暫存器官中貯存的碳水化合物，對于判斷植物的營養(yǎng)狀況至關重要。這類碳水化合物的種類，因植物和器官而異，種子、某些塊根、塊莖中以淀粉為主，蔥、蒜類的鱗莖、甘蔗、高粱、玉米莖桿中以蔗糖為主，某些菊科植物的塊莖（如菊芋）以菊糖為主，小麥莖桿中以蔗糖為主，水稻莖桿中則存有大量淀粉。第三類是結構性碳水化合物，構成植物細胞壁，其主要成分是纖維素、半纖維素和果膠類，在某些情況下，半纖維素可以分解成小分子

15、碳水化合物而被重新利用，如某些豆科種子發(fā)芽時，子葉細胞壁的半纖維素可以水解。水稻、小麥莖桿細胞壁的半纖維素在灌漿期也可以水解一部分運往籽粒，所以半纖維素兼有結構性碳水化合物和貯藏性碳水化合物兩種性質。根據碳水化合物的以上功能，有時可采用一些簡化的分析方法，常用的有以下幾種：1對于以淀粉為主要貯存形式的器官，可以分為水溶性碳水化合物（以冷水或40溫水浸提）和淀粉兩部分。2對于以蔗糖為主要貯存形式的器官，可以用溫水提取植物材料，測定其中的還原糖和蔗糖兩部分。3對于含果聚糖較多而淀粉極少的小麥莖桿，可以先用82%乙醇提取第一組碳水化合物，然后用熱水浸提出果聚糖類，所剩殘渣進行結構性碳水化合物測定。4

16、可利用碳水化合物測定：利用酶解法將淀粉水解，測定其中全部水溶性碳水化合物，作為植物可以利用的碳水化合物總量（包括淀粉、果聚糖、糊精以及全部單糖和寡糖），在某些情況下也可代表植物碳素營養(yǎng)狀況。考慮到小麥、水稻莖桿在生育后期，有一部分半纖維素分解利用，所以也可用2%HCI在沸水浴中水解3h，測定其中水溶性碳水化合物作為可利用的碳水化合物。酸解法應比酶解法的測定值為高。5水溶性碳水化合物總量：對于小麥莖、鞘，還可用沸水提取法（置沸水浴中用水提取2030min），提取其中果聚糖、糊精等及分子量更小的多種水溶性糖類，一并測定其總量，作為可利用碳水化合物，此法對于基本不含淀粉的材料來說，應與酶解法測定值相

17、似，但手續(xù)都大大簡化，具體方法如下：取新鮮樣品，剪碎（成1mm），混勻，用稱量瓶稱取2份，一份重5g左右，立即放在105烘箱中烘至恒重，求出含水量。另一份重1g左右，放入2.5×20cm的大試管中，加水10ml，置沸水浴上浸提20min，靜置，將上清液濾入100ml錐形瓶中，試管中殘渣再加水10ml，繼續(xù)提取，如此提取三次，將殘渣傾倒在漏斗的濾紙上，用清水沖洗試管及殘渣，使總液量不超過40ml，向浸提液中加入10%中性醋酸銅以沉淀蛋白質，直到不再產生沉淀為止，再滴入10%硫酸鈉以除去多余的鉛，將提取液過濾入50ml容量瓶中，用少量蒸餾水沖洗容器及沉淀數次，洗液一并濾入容量瓶，最后定容

18、至刻度，搖勻、待測，如須保存一段時間，可加12滴氯仿，將待測液保存在冰箱中。如須測定干材料，可精確稱取通過60目篩的樣品0.20.3g，提取方法如前。6水溶性碳水化合物速測法：為了進行作物營養(yǎng)診斷，須要快速測定，則可進一步簡化手續(xù)。稱取1克剪碎的新鮮樣品，置于20ml刻度試管中，加水5ml，在沸水浴中提取20min，冷卻后加入1滴氯仿，加水定容至10ml，搖勻，靜止澄清后即可吸取上清液進行含糖量測定，但一般材料中含糖量較高，必須將提取液稀釋50100倍，方可進行測定。如果只需測定水溶性碳水化合物總量，則可用蒽酮或苯酚法，免去酸水解的步驟。二、水溶性碳水化合物的測定（一）蒽酮法糖在濃硫酸的作用下

19、，可經脫水反應生成糠醛或羥甲基糠醛，如：生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應生成蘭綠色糠醛衍生物，在一定范圍內，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定量。該法的特點是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊糖與己糖，而且可以測定所有寡糖類和多糖類，其中包括淀粉、纖維素等（因為反應液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發(fā)生反應），所以用蒽酮法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在沒有必要細致劃分各種碳水化合物的情況下，用蒽酮法可以一次測出總量，省去許多麻煩，因此，有特殊的應用價值。但在測定水溶性碳水化合物時，則應注意切勿將樣品的未溶解殘渣，加入反應液中，不然會因為細胞

20、壁中的纖維素、半纖維素等與蒽酮試劑發(fā)生反應而增加了測定誤差。此外，不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺，故測定糖的混合物時，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測定單一糖類時，則可避免此種誤差。糖類與蒽酮反應生成的有色物質，在可見光區(qū)的吸收峰為630nm，故在此波長下進行比色。儀器與用具 分光光度計；水浴鍋及水浴試管架；電爐；大試管（2.5×20cm），大試管架；刻度吸管5ml、1ml；記號筆；吸水紙適量。試劑 1蒽酮乙酸乙酯試劑：取分析純蒽酮1g，溶于50ml乙酸乙酯中，貯于棕色瓶中。在黑暗中可保存數星期，如有結晶析出，可微

21、熱溶解。2濃硫酸（比重1.84）31%蔗糖標準液：將分析蔗糖在80下烘至恒重，精確稱取1.000克，加少量水溶解，移入100ml容量瓶中，加入0.5ml濃硫酸，用蒸餾水定容至刻度。4100mg/L蔗糖標準液：精確吸取1%蔗糖標準液1ml加入100ml容量瓶中，加水至刻度。方法1標準曲線的制作 取大試管11支，從010分別編號，按表1-1加入100mg/L蔗糖溶液和水，配成從1015mg/L的系列標準液，除空白外，各濃度均重復二次。加完溶液后，按順序向試管內加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯試劑和5ml濃硫酸。濃硫酸要沿管壁緩緩加入，然后將試管輕搖一下，待醋酸乙酯水解后，再充分搖動試管數次（注意勿將硫酸

22、淺出），使液體混勻，立即放入沸水浴中準確保溫1min，取出后自然冷卻至室溫，以空白作參比，在630nm波長下測其光密度，以糖含量為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標準曲線。并求出標準曲線的直線的方程。表1-1各試管加入試劑量管 號01-23-45-67-89-10100mg/L蔗糖（ml）00.20.40.60.81.0水（ml）2.01.81.61.41.21.0蔗糖加入量（g）0204060801002樣品測定：準確吸取樣品提取液或水解液2ml于大試管中，2ml樣品液中總含糖量應在20-100g之間，若超出此值，則應稀釋樣品液（或減少樣品液用量，然后加水使液體總量達到2ml），以下步驟與標準曲

23、線測定相同。根據所測光密度查標準曲線，即可得出每ml樣品液中碳水化合物總量。（二）苯酚法原理 苯酚法的測定原理與蒽酮法相同。糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糖醛，能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物。在10-100g范圍內顏色的深淺與糖的含量成正比，且在485nm波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測定。與苯酚法相比，蒽酮比色法有許多缺點，蒽酮試劑較貴，而且蒽酮在硫酸中不穩(wěn)定，也不能用于甲基化的糖和戊糖的測定。而苯酚比色法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的比色測定，方法簡單，試劑便宜，靈敏度高，實驗時基本不受蛋白質存在的影響，因而簡化了糖的提取程序，而且苯酚法產生的顏色穩(wěn)定，可以穩(wěn)定在1

24、60分鐘以上。試劑190%苯酚溶液 稱取90g苯酚，加蒸餾水10ml溶解，在室溫下可保存數月。29%苯酚溶液 取3ml 90%苯酚溶液，加蒸餾水至30ml，現用現配。3濃硫酸其它試劑見蒽酮法。方法1標準曲線的制作 取大試管11支，從010分別編號，用100g/ml的蔗糖溶液，按表1-2配制一系列濃度的蔗糖溶液，每一濃度設兩個重復。然后按順序向試管內加入1ml 9%苯酚溶液，搖勻，再從管液正面在520秒時間內加入5ml濃硫酸，搖勻比色液總體積為8ml。在室溫下放置30min顯色，然后以空白為參比，在485nm波長下比色，測定光密度，以糖含量為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標準曲線，求出標準線性方程

25、。表1-2各試管加入試劑量管 號01-23-45-67-89-10100ug/ml蔗糖液（ml）00.20.40.60.81.0蒸餾水（ml）2.01.81.61.41.21.0蔗糖加入量（g）0204060801002樣品的測定 取2ml樣品提取液，加入20ml大試管中，同制作標準曲線的步驟，按順序分別加入苯酚、濃硫酸溶液，顯色并測定光密度。由標準線性方程求出糖的含量，計算可溶性糖的酚含量。水溶性碳水化合物的測定程序：1配制試劑及標準蔗糖溶液。2制作標準曲線或建立直線回歸方程。3植物樣品中碳水化合物的提取與測定步驟： 稱取磨碎烘干的小麥莖鞘材料200mg，2份 分別放入兩支大試管中，加蒸餾水

26、1020ml于沸水中提取30分鐘（提取2次） 提取液分別過濾入100ml容量瓶中，反復漂洗試管及殘渣，定容至刻度 吸取5ml樣品液加入50ml容量瓶中定容 全部殘渣用2%HCl洗回原大試管中總體積20ml 吸取樣品液2ml于大試管中（重復4次） 沸水中分解3h 兩重復為一組，分別用苯酚法與蒽酮法 過濾于100ml容量瓶中，用蒸餾水漂 測定還原糖 洗殘渣數次，于容量瓶中定容至刻度 計算單位糖含量（水溶性糖） 吸取5ml提取液加入50ml容量瓶中，定容 每份樣品取2ml于大試管中（4次重復）， 每兩重復為一組，分別用苯酚法及蒽酮法 測定還原糖 計算單位糖的含量（稀酸溶性糖） 三、還原糖的測定砷鉬酸比色法 原理 硫酸銅在堿性條件下被還原糖還原成亞銅，加入砷鉬酸溶液，亞銅將鉬還原成低價氧化物鉬蘭，其確切成分尚未完全確定，而亞銅則被重新氧化。砷酸鹽可使蘭色加深，蘭色深淺與還原糖的含量成正比，故可用分光光度計法測得還原糖含量。儀器與用具 分光光度計1臺；100ml容量瓶2個；20ml刻度試管20支；水浴鍋1個；電爐1個；水浴試管架1個；刻度吸管1ml 4支，2ml 1支。試劑1葡萄糖標準溶液 取分析純葡萄糖于稱量瓶中，在80下烘至恒重，放入干燥器中，冷卻后稱取0.1000g，先用少量蒸餾水溶解，轉入100ml容量瓶