綠色熒光蛋白(GFP)基因的克隆、表達和粗提取

1、-作者xxxx-日期xxxx綠色熒光蛋白(GFP)基因的克隆、表達和粗提取【精品文檔】綠色熒光蛋白(GFP)基因的克隆、表達和粗提取南方醫(yī)科大學(xué)2011預(yù)防醫(yī)學(xué)（衛(wèi)生檢驗檢疫） 摘 要目的：研究綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大腸桿菌中的基因克隆與重組表達，以及對其進行粗提取。 方法：從E.coli DH5中用堿提取質(zhì)粒的方法提取質(zhì)粒pEGFP-N3和質(zhì)粒pET-28a。然后用質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳對已經(jīng)提取的產(chǎn)物進行電泳，確定從大腸桿菌中成功提取了質(zhì)粒。再用限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI對成功提取的質(zhì)粒進行酶切，并對酶切后的質(zhì)粒進行瓊脂糖

2、凝膠電泳，用以確定已經(jīng)提取了GFP基因。將含有GFP基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL-21中，用LB培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)化后的進行擴大培養(yǎng)。用IPTG誘導(dǎo)GFP基因表達可以看到淺綠色菌落。最后對綠色熒光蛋白進行粗提取。 結(jié)論：本實驗有助于學(xué)生掌握最基本的分子生物學(xué)實驗技術(shù)，為進一步的實驗奠定基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：綠色熒光蛋白 基因克隆 重組表達 轉(zhuǎn)化 粗提取目錄1 前言32 實驗?zāi)康?3 實驗設(shè)備44 材料及試劑55 實驗操作步驟55.1 操作流程55.2 質(zhì)粒DNA的分離與純化65.2.1 質(zhì)粒的培養(yǎng)65.2.2 質(zhì)粒的DNA的堿提取法65.2.3 質(zhì)粒DNA的鑒定與純化75.3 酶切及連接85

3、.3.1 雙酶切85.3.2 回收酶切產(chǎn)物（采用DNA回收試劑盒進行回收）85.3.3 連接9大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液體和固體培養(yǎng)基的配制（參考附錄）9感受態(tài)細(xì)胞的制備 (CaCl2法)95.4.3 轉(zhuǎn)化涂板105.5 GFP蛋白的誘導(dǎo)表達105.6 綠色熒光蛋白的粗提取11參 考 文 獻11附 錄121 LB培養(yǎng)基的配制：122. 溶液123. 溶液124. 溶液（100ml）125. DNase-free RNase A13緩沖液（）137. 20×TBE138. GeneFinder-溴酚藍(lán)上樣緩沖液139PEGFP-N3

4、質(zhì)粒全圖譜1310pET-28a質(zhì)粒全圖譜141 前言綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。當(dāng)受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時，GFP 發(fā)射綠色熒光。它產(chǎn)生熒光無需底物或輔因子發(fā)色團是其蛋白質(zhì)一級序列固有的。1962 年，下村修等分離純化了水母中發(fā)光蛋白水母素，并發(fā)現(xiàn)一種綠色的熒光蛋白。1974 年，他們分離得到了這個蛋白，當(dāng)時稱綠色蛋白，以后稱綠色熒光蛋白(GFP)1 GFP 作為一種新的報告基因，其優(yōu)點在于熒光強度高，穩(wěn)定性高；GFP 分子量小，易于融合，適用于多種轉(zhuǎn)化方式，對受體無毒害，安全可靠；不需要

5、反應(yīng)底物與其他輔助因子，受藍(lán)光激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光，尤其適用于體內(nèi)的即時檢測；GFP 不具有種屬依賴性，在多種原核和真核生物細(xì)胞中都表達；通過替換一些特殊氨基酸，可以使之產(chǎn)生不同顏色的光，從而適應(yīng)不同的研究需要。近年來廣泛用于基因的表達與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移以及相互作用、信號傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化，以及細(xì)胞的分離與純化等研究領(lǐng)域 23 。采用GFP 作為標(biāo)記基因，可直接收集轉(zhuǎn)化細(xì)胞供實驗，縮短了篩選時間、減少對細(xì)胞活性的影響并可作為活體標(biāo)記，為研究發(fā)育的基因調(diào)控和分子機制提供了一種簡潔有效的手段 4、5 。采用基因工程手段生產(chǎn)GFP標(biāo)記的方法，可建立一種簡便、快速的免疫診斷技術(shù)6 。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入大腸

6、桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細(xì)胞是分子克隆的關(guān)鍵步驟7，是基因克隆以及DNA文庫構(gòu)建等研究中一項重要的常規(guī)操作。目前，感受態(tài)細(xì)胞的制備主要采用CaCl2 法，該方法操作簡單、容易掌握、重復(fù)性好、轉(zhuǎn)化率高，可廣泛應(yīng)用于一般的實驗室。其原理是Ca2+ 破壞細(xì)胞膜上的脂質(zhì)陣列，并與膜上多聚羥基丁酸化合物、多聚無機磷酸形成復(fù)合物以利于外源DNA的滲入8。大腸桿菌是第一個用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌，它不僅具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、生長繁殖快、成本低廉、可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點9。而且其表達外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達系統(tǒng)，表達的目的蛋白量甚至能超

7、過細(xì)菌中蛋白量的30%，因此大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)10。大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前最常用的外源蛋白表達系統(tǒng),大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作,以及有大量可供選擇的克隆或表達載體,使之成為人們克隆表達外源基因的主要菌株11。 隨著科研的進展，構(gòu)建出了多種具有不同特點的表達載體和工程菌株，以滿足表達不同性質(zhì)、要求的目的基因的需要。在原核細(xì)胞中表達蛋白質(zhì)的載體常用啟動子有T7啟動子、Trp啟動子-色氨酸啟動子、Tac啟動子、T7噬菌體中基因10 的啟動子及Lac啟動子等。Lac啟動子受分解代謝系統(tǒng)活化蛋白和cAMP的正調(diào)控和阻遏物的負(fù)調(diào)控，當(dāng)加入乳糖或某些類似物IPTG可與阻遏蛋白形成

8、復(fù)合物，使阻遏蛋白構(gòu)型改變，阻遏蛋白不再能與操縱基因結(jié)合，從而使結(jié)構(gòu)基因表達。根據(jù)原核生物基因表達特點選擇載體進行目的基因克隆，然后轉(zhuǎn)入相應(yīng)的菌種中表達目的蛋白質(zhì)12。 研究綠色熒光蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的基因克隆和表達。通過質(zhì)粒重組形成所需要的重組質(zhì)粒pET-28a-GFP，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)，通過酶切及用IPTG誘導(dǎo)檢測是否在大腸桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達成功。根據(jù)電泳結(jié)果及熒光現(xiàn)象得出結(jié)論，重組質(zhì)粒在大腸桿菌體內(nèi)成功誘導(dǎo)表達。2 實驗?zāi)康膶W(xué)會綠色熒光蛋白基因表達載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達整個過程中的每一步，掌握其方法。本實驗是通過基因工程手段對目的基因EGFP進行克隆，并進行EGFP表達載

9、體的構(gòu)建，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達，獲得GFP蛋白。 學(xué)會最常用的小量制備質(zhì)粒DNA的堿裂解方法 學(xué)會常用的DNA瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)學(xué)會用限制性內(nèi)切酶切割DNA學(xué)會用瓊脂糖凝膠中回收DNA片段學(xué)會DNA片段的體外連接技術(shù)學(xué)會用CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞學(xué)會用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)受體菌的基本操作技術(shù)學(xué)會用酶切法篩選重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功的克隆菌了解外源基因在原核細(xì)胞中表達的特點和IPTG誘導(dǎo)表達的方法學(xué)習(xí)SDS-PAGE膠的基本灌制方法和用SDS-PAGE檢測表達蛋白3 實驗設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱，超凈臺，恒溫?fù)u床，制冰機，臺式離心機，核酸電泳儀，小型混合器，冰箱，藍(lán)盾可見光透射儀，移液器、電泳槽、振蕩

10、器、制冰機、凝膠成像儀，水浴鍋，高壓滅菌鍋、振蕩培養(yǎng)箱，手持式紫外燈。4 材料及試劑BamH I；NotI(10U/L)；T4 ligase；LB培養(yǎng)基；溶液；溶液；溶液；TE緩沖液；20×TBE；GeneFinder-溴酚藍(lán)上樣緩沖液。5 實驗操作步驟5.1 操作流程DH-5（pET-28）DH-5（pEGFPN3）質(zhì)粒 提取 質(zhì)粒 提取質(zhì)粒pEGFPN3質(zhì)粒pET-28酶切 回收 酶切 回收載體片段插入片段連 接重組質(zhì)粒(pET-28-GFP)轉(zhuǎn) 化BL-21(pET-28-GFP)誘 導(dǎo)綠色熒光蛋白（粗提取）圖一 流程圖5.2 質(zhì)粒DNA的分離與純化5.2.1 質(zhì)粒的培養(yǎng)1）在

11、含有pEGFPN3質(zhì)粒的DH5平板上菌落上挑取菌種，置于含有5mL LB培養(yǎng)基的試管中。搖晃過夜。 2）有pET-28a質(zhì)粒的平板上挑取單菌落于另外一個試管中，同樣搖蕩培養(yǎng)過夜。5.2.2 質(zhì)粒的DNA的堿提取法1）取1.5ml DH5培養(yǎng)液倒入1.5mL eppendorf 管（微量離心管）中, 13000rpm離心1min。2）重復(fù)1。3）棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。 4）菌體沉淀重懸浮于100L溶液中(需劇烈振蕩),室溫下放置10min。 5）加入新配制的溶液200l, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf 管5次,以混勻內(nèi)容物(千萬不要振蕩),冰浴5min。 6）

12、加入150L預(yù)冷的溶液,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩3次,使沉淀混勻,冰浴中15分鐘,13000rpm離心5min。 7）上清液移入干凈eppendorf 管中,加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1),振蕩混勻, 13000rpm離心2min。 8）將水相移入干凈eppendorf 管中,加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1)振蕩混勻, 13000rpm離心2min。 9）將水相移入干凈eppendorf 管中,加入2 倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后，置于室溫下2min，然后13000rpm離心5min。 10）棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1mL 70乙醇洗沉淀一次, 振

13、蕩混勻后，13000rpm離心5min。 11）吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,室溫干燥。 12）將沉淀溶于30L TE緩沖液，含20g/mL RNaseA)中，保存在-20冰箱中。 13）按照同樣的流程和方法將pET-28a的質(zhì)粒也提出來，保存在-20冰箱中。5.2.3 質(zhì)粒DNA的鑒定與純化1) 1%瓊脂糖凝膠的配制加20ml 1×TBE緩沖液于三角瓶中，精確稱取瓊脂糖加到三角瓶中，于微波爐中加熱至完全熔化，冷卻至60左右，2) 瓊脂糖凝膠電泳輕緩倒入封好兩端和加上梳子的電泳膠板中，靜置冷卻30分鐘以上，將膠板除去封膠帶，放入電泳緩沖液（TBE）中，使電泳緩沖液剛好沒過

14、凝膠約1mm，輕輕拔除梳子，取5l質(zhì)粒DNA及2l GeneFinder混勻上樣50-100v約電泳小時藍(lán)盾可見光透射儀觀察結(jié)果。3) 回收產(chǎn)物用干凈的刀片將需要的DNA條帶從凝膠上切下來，稱取重量。以凝膠對應(yīng)300L的體積加入PN。50水浴放置10min，期間不斷溫和上下翻動離心管至膠完全融解。將上一步得到的溶液加入到一個吸附柱中，吸附柱再放入收集管，13000rpm離心60s，棄掉廢液。加入800L漂洗液PW，13000rpm離心60s，棄掉廢液。加入500L漂洗液PW，13000rpm離心60s，棄掉廢液。將離心吸附柱放回收集管，13000rpm離心2min。取出吸附柱，放入一個干凈的離

15、心管中，在吸附膜的中間位置加入適量洗脫緩沖液EB 30L，洗脫緩沖液先在65水浴預(yù)熱，室溫放置2min，13000rpm離心1min，然后將離心的溶液重新加回離心吸附柱中，13000rpm離心1min。置于20保存。5.3 酶切及連接5.3.1 雙酶切按如下雙酶切體系（30L）混合:表1 雙酶切體系的配制反應(yīng)物（L）pEGFP-N3 pET-28a 質(zhì)粒 1818 BamH I 2 2 Not I 2 2 10×buffer K 3 3 0.1%BSA緩沖液 3 3 滅菌雙蒸水至 30ul體系1) 離心10s，混勻。2) 37水浴酶切3-4h。3) 配制1.0%（M/V）普通瓊脂糖凝

16、膠30ml。4) 適當(dāng)放置冷卻，45左右倒于電泳膠板上，插好梳子。5) 待凝膠凝固好以后，撥下梳子。6) 酶切樣品中加入5µl溴酚藍(lán)-GeneFinder混合液混勻，上樣。7) 1×TBE Buffer，80V(3-4V/cm)下電泳30min。8) 熒光激發(fā)器觀察質(zhì)粒DNA條帶的酶切情況，并照像。5.3.2 回收酶切產(chǎn)物（采用DNA回收試劑盒進行回收） 1) 配30mL 1進口瓊脂糖凝膠，盡量長一些（用粗梳子），對酶切產(chǎn)物進行電泳分離； 2) 將酶切產(chǎn)物全部加入加樣孔中 3) 跑膠，觀察結(jié)果，并且拍照。 4) 用干凈的刀片將需要的DNA條帶從凝膠上切下來，稱取重量。 5)

17、 以凝膠對應(yīng)300L的體積加入PN。 6) 50水浴放置10min，期間不斷溫和上下翻動離心管至膠完全融解。 7) 將上一步得到的溶液加入到一個吸附柱中，吸附柱再放入收集管，13000rpm離心60s，棄掉廢液。8) 加入800L漂洗液PW，13000rpm離心60s，棄掉廢液。9) 加入500L漂洗液PW，13000rpm離心60s，棄掉廢液。 10) 將離心吸附柱放回收集管，13000rpm離心2min。 11) 取出吸附柱，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間位置加入適量洗脫緩沖液EB 30L，洗脫緩沖液先在65水浴預(yù)熱，室溫放置2min，13000rpm離心1min，然后將離心的溶液

18、重新加回離心吸附柱中，13000rpm離心1min。 12) 置于20保存。 5.3.3 連接按照連接體系進行，16連接過夜。表2 連接體系反應(yīng)物 體積/L 回收純化的pET-28a質(zhì)粒 5gfp基因片段 12 T4連接酶 1 緩沖液（10×） 2 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化5.4.1 LB（Luria-Bertain）液體和固體培養(yǎng)基的配制（參考附錄）氨芐青霉素和卡那霉素等抗生素不抗熱，如果培養(yǎng)基溫度過高，容易導(dǎo)致抗生素失效，應(yīng)使培養(yǎng)基降溫至60左右后，再加入抗生素。但也不應(yīng)使培養(yǎng)基的溫度過低，否則容易出現(xiàn)氣泡。75mm直徑的培養(yǎng)皿約需15ml培養(yǎng)基。感受態(tài)細(xì)胞的制備 (CaC

19、l2法) 1) 挑一大腸桿菌單菌落放入3ml LB液體培養(yǎng)基（含Kan+），37培養(yǎng)過夜。2) 活化大腸桿菌：取3ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基加入50-150l的過夜菌，培養(yǎng)2-3個小時。3) 將昨夜搖出來的DH5或BL21培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10min,然后于4下4000rpm離心5min。 4) 棄去上清,用預(yù)冷的的CaCl2溶液600L輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置20min, 4下4000rpm離心5min。 5) 棄去上清,加入300L預(yù)冷的的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置5min,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液，可-80長期保存。5.4.3 轉(zhuǎn)化涂板 1) 取2個無菌離心管，分別加入10

20、0L BL21感受態(tài)細(xì)胞懸液，第1管加5l無菌水，第2管加入質(zhì)粒DNA溶液5l,輕輕搖勻,冰上放置30min。2) 42水浴中熱激90s,熱激后迅速置于冰上冷卻5min。 3) 分別向管中加入100L LB液體培養(yǎng)基,混勻后在37振蕩培養(yǎng)30min。 4) 從管1中取50L涂布于含抗生素和不含抗生素的平板上,從管2中取50L和100L涂布于含抗生素的平板上。正面向上放置約10分鐘,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37培養(yǎng)20小時。Kan-Kan+Kan+Kan+管1 管1 管2 管250L 50L 50L 100L圖2 轉(zhuǎn)化涂板模式圖5.5 GFP蛋白的誘導(dǎo)表達1) 取陽性克隆質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)

21、化BL21；2) 在含有Kan的固體培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)20h；3) 挑取單菌落，37振蕩培養(yǎng)過夜；4) 取4支無菌帶蓋試管，加入新鮮LB液體培養(yǎng)基（含有Kan）5ml，按1：20稀釋比例加入過夜菌，37培養(yǎng)至生長期,約2-3小時。5) 加入IPTG（1：1000）至終濃度1mmol/L，分別誘導(dǎo)0h，1h，2h，4h。 6) 分別取，10000rpm離心5min，去除上清，收集沉淀，再重復(fù)一次收集沉淀。7) 分別取IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)液20l涂布在含Kan的固體培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)20小時。8) 觀察蛋白表達：用紫外線照射菌體沉淀及培養(yǎng)平板，可以看到綠色熒光。分別對均勻涂布的平板以及表達蛋白的樣品管

22、照相，保存照片。5.6 綠色熒光蛋白的粗提取1) 挑取上述鑒定正確的單菌落接入5 mL 液體LB 培養(yǎng)基( 含50 g/mL 卡那霉素) , 37 振蕩培養(yǎng)過夜, 2) 將過夜培養(yǎng)菌以1: 500 體積比接種入新的LB 液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng), 37 培養(yǎng)1 h 后, 加入0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達3 h。3) 將上述誘導(dǎo)表達菌液4 、5 000×g 離心10 min 收集菌體, 4) 用提取緩沖液(2 mmol/L Tris, pH 8.0, 0.5 mmol/L PMSF,0.2 mmol/L NaN3)洗滌菌體一遍, 5) 將菌體超聲破碎( 50 %功率, 超聲20

23、s, 共20 次, 兩次超聲間隔40 s) 后, 10 000 ×g離心20 min。6) 取離心后的上清，即為粗提取綠色熒光蛋白。參 考 文 獻1 Shimomura O,Johnson FH,Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, abioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea J. J Cell Como Physiok, 1962, 59: 223-239.2 Kain SR,AdamsM, Kondepudi

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