不同濃度胰島素對(duì)高糖培養(yǎng)下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖活力的影響

1、不同濃度胰島素對(duì)高糖培養(yǎng)下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖活力的影響施光明 1, 3 欒潔 2(通訊作者)(1 東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院江蘇南京 210009)(2 東南大學(xué)附屬屮大醫(yī)院眼科 210009)(3 南通大學(xué)附屬丹陽(yáng)市人民醫(yī)院眼科 212300)【摘要】目的：研究不同濃度胰島素對(duì)高糖培養(yǎng) k 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖 活力的影響。 方法： 體外培養(yǎng)人rpe(arpe-19,在高撒30mmol/l濃度卞給予 ou/l, 100u/l,101u/l, 102u/l, 103u/l, 104u/l 胰島素作用 12h、24h、48h 后用 mtt 法檢測(cè)各組視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的增生活力。結(jié)果：各濃度胰島素組

2、在不同觀察時(shí)間(12 小時(shí)、24 小時(shí)、48 小時(shí))，其吸光度值(od570)與空白對(duì) 照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05),各組吸光度值(od570)隨作用時(shí) 間的延長(zhǎng)而有增加的趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)o結(jié)論：胰島素對(duì) 高糖培養(yǎng)丁視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖活力無(wú)明顯影響?！娟P(guān)鍵詞】胰島素細(xì)胞活力視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞【中圖分類號(hào)】r458+.5【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】a【文章編號(hào)】2095-1752 (2013) 34-0076-03【abstract】 objective:to investigate the effect of different conc

3、entrations ofinsulin on the proliferation of high glucose cultured human retinal pigment epithelialcells-19 in vitro.methods: human retinal pigment epithelial cells (arpe-19) werecultured in vitro, exposed to high glucose group, treated with differentconcentrations of insulin (ou/l、 100u/l、 101u/l、

4、102u/l 103u/l、 104u/l) respectively.cell proliferation was detected by mtt assay after 12, 24 and 48 hours.results: there was no statistical significant difference among different concentrationsof insulin intervention conditions in groups of high glucose compared to controls(p> 0.05).there wa

5、s a statistically significant difference with the extension of time(p<0.05) . conclusion: insulin had no effect on the proliferation of arpe-19 cellsin the high glucose condition.引言糖尿病(diabetic mellitus，dm)是嚴(yán)重影響人們生命健康的常見(jiàn)病，其致 殘率、致死率僅次于心腦血管病以及癌癥，糖尿病患者因糖代謝障礙導(dǎo)致全身各 組織器官的微血管發(fā)生病變滿中糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic

6、retinopathy,dr)是其 最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是成年人致盲的重要原因之一1】。胰島素注射治 療糖尿病被認(rèn)為是控制血糖并減少糖尿病并發(fā)癥的較好的手段，給糖尿病患者帶 來(lái)福音，但是隨著研究的不斷深入，對(duì)于胰島素在 dr 治療上的爭(zhēng)議越來(lái)越多。 視網(wǎng)膜細(xì)胞的增殖與視網(wǎng)膜病變密切相關(guān)。我們通過(guò)研究不冋濃度胰島素對(duì)高糖 培養(yǎng)下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖活力的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：1. 材料和方法1.1 材料人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(cultured human retinal pigment epithelial cells-19,arpe-19)購(gòu)自 atcc 公司，dmem/f12 培養(yǎng)液

7、(gibco 公司)，胰島素(江蘇 萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司)，胎牛血清(fcs,杭州四季青)，0.05% trypsin-edta(gibco 公司)，二甲基亞砜(dmso, sigma 公司)，四甲基偶氮唑(mtt，sigma 公司)，酶標(biāo)儀(microplatereader)model 860 bio-rad。1.2 方法 arpe-19 懸液置于含奮 10% fcs 的 dmem/f12 培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)， 于37c,5%co2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至融合后，用 0.05% trypsin-edta消化，離心，制成單細(xì)胞懸液，按 1 : 41 : 6 傳代。將長(zhǎng)至融合狀 態(tài)

8、的細(xì)胞以 0.05%trypsin-edta 消化，離心，制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞增殖活性的測(cè)定 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的 arpe-19 細(xì)胞，采用上述傳代方法消化,制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，接 種于 96 孔板,每組設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔ii每孔的細(xì)胞數(shù)保持一致， 模型建立后加入等 量高糖(30 mmol/l)培養(yǎng)液 200μl/孔，置于 37c, 5%co2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h 后 換無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓12h；給予 0, 100, 101, 102, 103, 104u/l 胰島素作用 12h、24h、48h 后每孔加入0.5%mtt 溶液 20μl，置于 37c，5%co2 培養(yǎng)箱中

9、繼續(xù)培養(yǎng) 4h,終止培養(yǎng),小心吸棄培養(yǎng)液，每孔加入 dmso 150μl,室溫振蕩 lomin；在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔 570nm 的吸光度(od570)值繪制生長(zhǎng)曲線。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次， 測(cè)到的數(shù)據(jù)采用spss18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行anona 方差分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示， 以 p<o. 05 為存統(tǒng)計(jì)學(xué) 差異。2. 結(jié)果如表 1 所示:當(dāng)胰島素干預(yù)濃度分別為 ou/l、100u/l, 101u/l、102u/l、103u/l、104u/l 時(shí)，在不同觀察吋間(12 小時(shí)、24 小時(shí)、48 小吋

10、)，其吸光度 值(od570)與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)o表 1:高濃度葡萄糖組，不同濃度胰島素干預(yù)下 rpe 細(xì)胞吸光度值(od570)χ-±s與空白對(duì)照組相比：apagtaos，* p<0.05如表 2 所示： 當(dāng)胰島素濃度分別為 ou/l、 100、 101u/l、 102u/l、 103u 八、104u/l吋，各組吸光度值(od570)隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而有增加的趨勢(shì)，差異具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)o表 2:高濃度葡萄糖組，不同觀察吋點(diǎn) rpe 細(xì)胞吸光度值(od570)(&am

11、p;chi; ±s)與 12h 組相比：a: p<0.05, b：p>0.05；與 24h 組相比：c: p<0.053. 結(jié)論糖尿病是終生進(jìn)展性疾病，其發(fā)病機(jī)制為不冋原因所致的胰島素相對(duì)或絕對(duì) 不足，引發(fā)的糖、蛋白質(zhì)以及脂肪代謝失調(diào)及水電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合征， 其主要特征是高血糖。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們生活水平的提高以及飲食結(jié)構(gòu) 的改變，全球范圍內(nèi)糖尿病的發(fā)病率逐年增加，糖尿病患病率的驚人上升是一個(gè) 全球性的公共健康和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。糖尿病的病程、血糖、血壓、血脂、年齡和性別、 體重、妊娠、眼部手術(shù)及眼部局部情況、全身相關(guān)疾病

12、等均可能影響糖尿病視網(wǎng) 膜病變的發(fā)生和發(fā)展。b 前針對(duì)本病的治療主要有：合理控制血糖水平、藥物治 療、激光光凝治療、玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)治療、曲安奈德玻璃體腔注射、抗 vegf治療等，但還沒(méi)有確實(shí)有效的根治性方法2】。胰島素是由胰島β細(xì)胞分泌，是機(jī)體內(nèi)唯-降低血糖的激素，胰島素注射被認(rèn)為是控制血糖并減少糖尿病并發(fā)癥的較好的手段， 但隨著研究的不斷深入, 對(duì)于胰島素在 dr 治療上的爭(zhēng)議越來(lái)越多。早期研究表明，胰島素通過(guò)模擬正常 人的胰島素分泌曲線，使血糖迅速達(dá)到或接近正常水平，從而保護(hù)殘存的胰島細(xì) 胞的功能，從而延緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。胰島素具冇祌經(jīng)保護(hù)作用，在血清饑 餓條件下，

13、胰島素可通過(guò) pi3k/akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑阻止 caspase-3 的活化，抑制視 網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡3】。美國(guó) dcct(diabetes control and complications trial)小組對(duì)基 礎(chǔ)視網(wǎng)膜病的研究顯示，13%胰島素治療的患者在治療的 6 個(gè)月內(nèi)視網(wǎng)膜病變惡 化，而在傳統(tǒng)藥物治療的患者中有 7.6%惡化4。胰島素可通過(guò)破壞血-視網(wǎng)膜屏 障、改變視網(wǎng)膜血流而大量進(jìn)入視網(wǎng)膜作用于視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial, rpe)細(xì)胞、 內(nèi)皮細(xì)胞、 müller 細(xì)胞等， 刺激這些細(xì)胞分泌各種 細(xì)胞因子而促進(jìn) dr 的發(fā)

14、展 5 。胰島素刺激視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖和igf密切相關(guān)， 主 要是通過(guò)抑制igf結(jié)合蛋白導(dǎo)致igf-1生物利用度的增高和直接激活 ir 或者 igfr 兩條途徑來(lái)完成的6】。而視網(wǎng)膜細(xì)胞的增殖與視網(wǎng)膜病變密切相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶可以將水溶性的 mtt(噻唑藍(lán))還原成非水溶性的甲瓚，后者呈紫色結(jié)晶體。利用奮機(jī)溶劑將其消化后，測(cè)定溶液的吸光度值(od570),從而測(cè)定活細(xì)胞的相對(duì)含量。 我們的前期研究表明 7】 高糖可以抑制 rpe 細(xì)胞增 殖。我們通過(guò)研究不同濃度胰島素對(duì)高糖培養(yǎng)下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，增殖活力 的無(wú)明顯影響(p&gt；0.05),但是隨作用吋間的延長(zhǎng)而奮增加的趨勢(shì)，差異具

15、奮 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)o0前胰島素在外周組織中的效應(yīng)及機(jī)制已基本被闡明，但是胰島素在視網(wǎng)膜 以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后。在視網(wǎng)膜中含有大量的多不飽和脂肪酸， 并 ii它對(duì)氧的攝入和對(duì)葡萄糖氧化作用均高于其他組織，這使得視網(wǎng)膜對(duì)于氧化 應(yīng)激更加敏感，在糖尿病時(shí)易于受到氧化應(yīng)激的損傷。我們以后工作的重點(diǎn)將研 宄高濃度胰島素干預(yù)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，測(cè)定氧化損傷的指標(biāo)，以研究胰島素 強(qiáng)化治療引起視網(wǎng)膜病變惡化的機(jī)制。綜上所述，不同濃度胰島素對(duì)高糖培養(yǎng)下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，增殖活力的 無(wú)明顯影響，我們也推測(cè)糖尿病患者行胰島素強(qiáng)化治療引起 dr 的惡化時(shí)，rpe 細(xì)胞活力并未增

16、加。參考文獻(xiàn)ljmorley je.diabetes and aging:epidemiologic over viewj.ciin geriatrmed,2008,24(3):395-405.2】劉來(lái)琴.糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論壇，2008,12(5):452-4543 barber aj, nakamura m, wolpert e b, etal. insulin rescues retinal neuronsfrom apoptosis by a phosphatidylinositol 3-kinase/akt-mediated mechanism that reducesthe activation of caspase-3j. j biol chem, 2001,276(35):32814-32821.4 early worsening of diabetic retinopathy in the diabetes control andcomplications trialp.