《神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》ppt課件

1、n神經(jīng)束路追蹤技術(shù)是利用神經(jīng)元軸神經(jīng)束路追蹤技術(shù)是利用神經(jīng)元軸漿運(yùn)輸漿運(yùn)輸axoplasmic transportaxoplasmic transport景象的示追蹤法，主要用于研景象的示追蹤法，主要用于研討神經(jīng)元間廣泛的神經(jīng)纖維聯(lián)絡(luò)。討神經(jīng)元間廣泛的神經(jīng)纖維聯(lián)絡(luò)。n軸漿運(yùn)輸包括從胞體向軸突及其終軸漿運(yùn)輸包括從胞體向軸突及其終末的順行運(yùn)輸和從軸突及其終末向末的順行運(yùn)輸和從軸突及其終末向胞體的逆行運(yùn)輸。胞體的逆行運(yùn)輸。n神經(jīng)束路追蹤法主要有辣根過(guò)氧化神經(jīng)束路追蹤法主要有辣根過(guò)氧化物酶示蹤技術(shù)、熒光素示蹤技術(shù)、物酶示蹤技術(shù)、熒光素示蹤技術(shù)、同位素示蹤技術(shù)及順行示蹤技術(shù)等。同位素示蹤技術(shù)及順行示蹤技

2、術(shù)等。n目前較常運(yùn)用辣根過(guò)氧化物酶法進(jìn)目前較常運(yùn)用辣根過(guò)氧化物酶法進(jìn)展神經(jīng)束路追蹤，本章對(duì)其作重點(diǎn)展神經(jīng)束路追蹤，本章對(duì)其作重點(diǎn)引見(jiàn)。引見(jiàn)。19711971年年KristensonKristenson和和OlssonOlsson首先報(bào)道首先報(bào)道HRPHRP可被神經(jīng)末梢攝取，經(jīng)逆行軸漿運(yùn)輸可被神經(jīng)末梢攝取，經(jīng)逆行軸漿運(yùn)輸至神經(jīng)元胞體后，可用組織化學(xué)方法至神經(jīng)元胞體后，可用組織化學(xué)方法顯示胞體的位置，從而創(chuàng)建了辣根過(guò)顯示胞體的位置，從而創(chuàng)建了辣根過(guò)氧化物酶氧化物酶horseradish peroxidase, horseradish peroxidase, HRPHRP追蹤神經(jīng)元法。追蹤神經(jīng)元法。

3、與它的突觸活動(dòng)有關(guān)。與它的突觸活動(dòng)有關(guān)。nn早在早在HRPHRP被保送到被保送到胞體的前三天，由于溶酶胞體的前三天，由于溶酶體降解作用而使體降解作用而使HRPHRP含量含量顯著減少，在顯著減少，在4-84-8天大部天大部分溶酶體內(nèi)已無(wú)分溶酶體內(nèi)已無(wú)HRPHRP。n實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟： 麻醉動(dòng)物麻醉動(dòng)物 導(dǎo)入導(dǎo)入HRP 動(dòng)物存活動(dòng)物存活 灌注固定灌注固定 取材取材 切片切片 組織化學(xué)反組織化學(xué)反響響 顯微鏡察看顯微鏡察看1.1.麻醉大鼠：麻醉大鼠：2%2%戊巴比妥戊巴比妥40mg/kg)40mg/kg)腹腔注射。麻醉不宜過(guò)深，以免清腹腔注射。麻醉不宜過(guò)深，以免清醒過(guò)慢，影響醒過(guò)慢，影響HRPHR

4、P被神經(jīng)元攝取及在被神經(jīng)元攝取及在其內(nèi)的運(yùn)輸。其內(nèi)的運(yùn)輸。2.2.注入注入HRPHRP：動(dòng)物麻醉后，分別坐骨神：動(dòng)物麻醉后，分別坐骨神經(jīng)，用微量注射器將經(jīng)，用微量注射器將1%CB-HRP(1%CB-HRP(霍亂霍亂原原B B亞單位結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶亞單位結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶2.5ul2.5ul 緩慢注入坐骨神經(jīng)。注射后原位留緩慢注入坐骨神經(jīng)。注射后原位留針針10min10min，縫合切口，將大鼠置于原，縫合切口，將大鼠置于原環(huán)境中繼續(xù)存活。環(huán)境中繼續(xù)存活。3.3.存活期：指存活期：指HRPHRP注入后，動(dòng)物需存活注入后，動(dòng)物需存活一段時(shí)間，以利于一段時(shí)間，以利于HRPHRP的攝取、運(yùn)輸?shù)臄z取、運(yùn)

5、輸及積累。存活期的長(zhǎng)短依賴(lài)于運(yùn)送及積累。存活期的長(zhǎng)短依賴(lài)于運(yùn)送速度、運(yùn)送間隔及胞體內(nèi)速度、運(yùn)送間隔及胞體內(nèi)HRPHRP在溶酶在溶酶體的降解速度，普通為體的降解速度，普通為24-7224-72小時(shí)。小時(shí)。 4. 4.灌注固定：動(dòng)物麻醉同前，開(kāi)胸，經(jīng)左心灌注固定：動(dòng)物麻醉同前，開(kāi)胸，經(jīng)左心室室- -自動(dòng)脈插管，灌注溫的自動(dòng)脈插管，灌注溫的3737生理鹽生理鹽水沖洗血液至液體清亮，約水沖洗血液至液體清亮，約100 ml100 ml。 再灌再灌注冷的固定液注冷的固定液1%1%多聚甲醛和多聚甲醛和1.25%1.25%戊二醛戊二醛的的0.1mol/l0.1mol/l磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液，PH7.4P

6、H7.4， 4 4C)C)，約約500ml ,30500ml ,30分鐘。灌注后用含分鐘。灌注后用含10%10%蔗糖的蔗糖的0.1mol/l PBS100ml0.1mol/l PBS100ml沖洗。沖洗。 . .取材：取脊髓，切成小塊，放入含取材：取脊髓，切成小塊，放入含25%25%蔗糖的蔗糖的0.1mol/l PBS0.1mol/l PBS PH7.4 PH7.4于于44 冰箱過(guò)夜。冰箱過(guò)夜。. .切片：待脊髓在蔗糖液中沉底后，標(biāo)本切片：待脊髓在蔗糖液中沉底后，標(biāo)本以磷酸緩沖液略洗，冷凍切片機(jī)冠狀切以磷酸緩沖液略洗，冷凍切片機(jī)冠狀切脊髓，厚脊髓，厚15-20um15-20um，貼于多聚賴(lài)氨酸

7、載玻，貼于多聚賴(lài)氨酸載玻片上，回至室溫涼或烘干片上，回至室溫涼或烘干 。. .后固定：切片入丙酮溶液固定后固定：切片入丙酮溶液固定10min10min，蒸餾水沖洗蒸餾水沖洗2 23 3次，每次次，每次2 23min3min。. .預(yù)浸：入預(yù)浸：入2020預(yù)孵育液，在避光條件下，恒溫預(yù)孵育液，在避光條件下，恒溫孵育孵育20 min 20 min 。 預(yù)孵育液：預(yù)孵育液：500mg500mg鎢酸鈉溶解在鎢酸鈉溶解在23.5ml23.5ml 蒸餾水中，過(guò)濾，后參與蒸餾水中，過(guò)濾，后參與0.2mol/l0.2mol/l的的PBS25mlPBS25ml及及1NHCL0.75ml1NHCL0.75ml，攪

8、拌混勻，呈色反響前加，攪拌混勻，呈色反響前加 TMB TMB液液(TMB3.5mg(TMB3.5mg用用0.25ml0.25ml丙酮溶解后，加丙酮溶解后，加0.5ml0.5ml無(wú)水無(wú)水乙醇。乙醇。. .呈色反響：呈色開(kāi)場(chǎng)時(shí)，于反響液中呈色反響：呈色開(kāi)場(chǎng)時(shí)，于反響液中參與參與 0.3%H2O2 0.35ml0.3%H2O2 0.35ml，以后每，以后每 10min 10min 加加0.35ml 0.35ml 在避光條件下反響，在避光條件下反響，歷時(shí)歷時(shí)1 1小時(shí)。小時(shí)。10.10.清洗：反響終了用清洗：反響終了用0.05mol/lPB0.05mol/lPB洗洗4-64-6次，每次次，每次2-3min2-3min。11.11.復(fù)染：切片經(jīng)蘇木素短時(shí)復(fù)染。復(fù)染：切片經(jīng)蘇木素短時(shí)復(fù)染。12.12.封片：切片經(jīng)蒸餾水漂洗封片：切片經(jīng)蒸餾水漂洗30s30s，再，再用用70%70%、80%80%、95%95%酒精逐級(jí)脫水各酒精逐級(jí)脫水各1min1min，二甲苯透明兩次，共，二甲苯透明兩次，共4-10min4-10min，樹(shù)膠封片。樹(shù)膠封片。13.13.鏡檢：光鏡下察看染色結(jié)果。鏡檢：光鏡下察看染色結(jié)果。壞水解。壞水解。TH酪氨酸羥化酶酪氨酸羥化酶HRP labelling neurons in ocu