神經(jīng)生物學實驗

1、實驗一 反射時的測定及反射弧的分析 目的 1學習測定反射時的方法。 2了解反射弧的組成。通過實驗證明任何一個反射，只有當實現(xiàn)該反射的反射弧存在，并保證其完整的情況下才能出現(xiàn)。原理 機體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與之下，對刺激所發(fā)生的反應叫做反射；反射弧是反射的解剖學基礎(反射弧一般包括感受器、傳入神經(jīng)、中樞、傳出神經(jīng)、效應器等五個部分)。要引起反射，首要條件是反射弧必須完整。反射弧的任何一部分受到破壞，反射即不出現(xiàn)。實驗動物 蛙或蟾蜍器材及藥品 蛙類常用手術器械、支柱臺、蛙嘴夾、蛙板、蛙腿夾、小燒杯、大燒杯、培養(yǎng)皿玻璃 (2個)、小濾紙片、棉花、秒表、紗布、0.5及1硫酸溶液、水。方法與步驟 一、脊蟾蜍

2、的反射1制備脊蛙（或脊蟾蜍）：利用毀髓針從枕骨大孔處搗毀腦，保留脊髓制備脊蛙，用蛙嘴夾夾住蛙的下頜，掛在支柱臺上2. 屈曲反射正常反射活動的觀察及反射時的測定：用培養(yǎng)皿盛0. 5硫酸溶液，將蛙右后肢的最長趾浸入0.5%硫酸溶液中23mm ( 浸入時間最長不超過10s )，立即記下時間（以秒計算）。當出現(xiàn)屈腿反射時，則停止計時，此為屈腿反射時（即從浸入時起至后肢發(fā)生屈曲時所需要的時間）。立即用清水沖洗受刺激的皮膚，并用紗布擦干。重復三次，求出平均值作為右后肢最長趾的反射時。用同樣方法測定左后肢最長趾的反射時。3. 搔扒反射用浸有1%硫酸的濾紙片刺激脊蟾蜍一側(cè)胸腹部或背部皮膚，引起同側(cè)或雙側(cè)后肢運

3、動，扒掉濾紙片。二、反射弧1、反射弧模式圖2、屈曲反射的反射弧最長趾感受器傳入神經(jīng)纖維脊髓傳出神經(jīng)纖維下肢屈肌3、搔扒反射的反射弧腹部感受器傳入神經(jīng)纖維脊髓傳出神經(jīng)纖維下肢肌三、反射弧完整才能發(fā)生反射1、破壞感受器手術剪自右后肢最長趾基部環(huán)切皮膚，然后再用手術鑷剝凈長趾上的皮膚。用硫酸刺激去皮的長趾，記錄結(jié)果。2、麻醉傳入和傳出神經(jīng)纖維沿右后肢的股二頭肌溝剪開皮膚，分離出坐骨神經(jīng)。在神經(jīng)下穿細棉線后，在細棉條上滴幾滴2普魯卡因溶液，每隔2min重復刺激 (記錄加藥時間)。當屈反射剛剛不能出現(xiàn)時(記錄時間)，大約五分鐘后，用浸有1%硫酸的濾紙片刺激脊蟾蜍一側(cè)胸腹部皮膚，觀察搔扒反射。然后15分鐘

4、后，再用濾紙片刺激胸腹部皮膚，觀察搔扒反射。 3、破壞效應器將蟾蜍一側(cè)皮膚從根部環(huán)切，剝離后浸入含20%的甘油任氏液中，大約經(jīng)過三十分鐘后，該側(cè)肢體不能發(fā)生搔扒反射4. 破壞脊髓中樞用細探針插入髓管內(nèi)，上下抽動破壞中樞脊髓，蛙四肢松弛。重復實驗，記錄結(jié)果。四、小結(jié)1、反射是機體通過神經(jīng)系統(tǒng)對內(nèi)外環(huán)境的刺激所發(fā)生的反應2、反射弧是反射的結(jié)構(gòu)基礎，由感受器、傳入神經(jīng)纖維、傳出神經(jīng)纖維、效應器組成。3、反射的完成依賴反射弧的完整性。討論 1. 說明屈腿反射的具體過程。 2. 以實驗結(jié)果為根據(jù)，以嚴密的邏輯推理方式說明反射弧的幾個組成部分。注意事項1、 每次實驗時，要使皮膚接觸硫酸面積不變，以保持相同

5、的刺激強度刺激后要立即洗去硫酸，以免損傷皮膚。實驗二 坐骨神經(jīng)腓腸肌標本制備【實驗原理與目的】蛙類的一些基本生命活動和生理功能與溫血動物相似，而其離體組織所需的生活條件比較簡單，易于控制和掌握。因此在實驗中常用蟾蜍或蛙的坐骨神經(jīng)腓腸肌標本來觀察興奮和興奮性、刺激與肌肉收縮等基本生理現(xiàn)象和過程。所制備坐骨神經(jīng)腓腸肌標本是生理學實驗中必須掌握的一項基本技能。本實驗目的在于學習破壞蛙類腦脊髓法，掌握坐骨神經(jīng)腓腸肌標本的制備技術、并獲得興奮性良好的標本，為以后有關實驗打下基礎。【實驗對象】蛙或蟾蜍?！緦嶒炂鞑暮退幤贰?#160;1器械 蛙類動物手術器械一套，包括普通剪刀、小手術剪刀、鑷子、探

6、針、鋅銅弓、玻璃分針、蛙板、玻璃板、固定針等。2藥品 任氏液。3其它 瓷盤、培養(yǎng)皿、小燒杯、棉花、棉線、紗布、滴管等?！緦嶒灢襟E和觀察指標】1.破壞腦和脊髓 取蟾蜍一只，用布包裹蟾蜍四肢軀干露出頭部，用左手握住蟾蜍，并用食指按壓頭部前端，拇指按壓背部，使頭部前俯；右手持金屬探針由頭前端沿中線向尾方劃觸、觸及凹陷處即枕骨大孔的所在。將探針由凹陷處垂直刺入，刺破皮膚即入枕骨大孔，這時將探針尖端轉(zhuǎn)向頭方，向前探入顱腔內(nèi)，然后向各方攪動探針，以搗毀腦組織。如探針確在顱腔內(nèi)，術者可感覺出針在四面皆壁的腔內(nèi)。腦組織搗毀后，將探針退出；再由枕骨大孔刺入，并轉(zhuǎn)向尾方，與脊髓平行刺

7、入脊管，以破壞脊髓。腦和脊髓是否完全破壞，可檢查動物四肢肌肉的緊張性是否完全消失。拔出探針后，同一干棉球壓迫針孔，以止其出血（見圖3-1-1-1）。另一方法是去腦后再搗毀脊髓。2.剪除軀干上部及內(nèi)臟 在骶髂關節(jié)水平以上0.51cm處剪斷脊柱。左手握止蟾蜍后肢、用拇指壓止骶骨，使蟾蜍頭與內(nèi)臟自然下垂，右手持粗剪刀（非手術剪），沿脊柱兩側(cè)剪除一切內(nèi)臟及頭胸部，留下后肢、骶骨、脊柱以及緊貼于脊柱兩側(cè)的坐骨神經(jīng)。剪除過程中注意勿損傷坐骨神經(jīng)。3.剝皮 左手握緊脊柱斷端（注意不要握住或壓迫神經(jīng)），右手捏住其上的皮膚邊緣、用力向下剝掉全部后肢的皮膚（見圖3-1-1-2 ）。把

8、標本放在盛有任氏液的培養(yǎng)皿中。將手及用過的剪刀、鑷子等全部手術器械洗凈，再繼續(xù)下面步驟。4.分離兩腿 用鑷子夾住脊柱標本提起，背面朝上，剪去向上突起的尾骨（注意勿損傷坐骨神經(jīng)）。然后沿正中線用剪刀將脊柱和恥骨聯(lián)合中央辟開兩側(cè)大腿，并完全分離。將兩條腿浸入盛有任氏液的培養(yǎng)皿中。5.制作坐骨神經(jīng)腓腸肌標本（1）分離坐骨神經(jīng) 取一條腿放置在蛙板上的玻璃片上，用一固定針將粗制標本的脊柱固定在蛙板上（腹面朝上），將下肢拉直并向外旋轉(zhuǎn)趾蹼朝上，用固定針在跖? 骨部固定在蛙板上，用玻璃分針沿脊柱旁游離坐骨神經(jīng)至尾骨處、再循坐骨神經(jīng)溝（股二頭肌和半膜肌之間的裂逢處），找出坐骨神經(jīng)

9、的大腿段，用玻璃分針仔細剝離，剪斷坐骨神經(jīng)的所有分支，并將神經(jīng)分離直至膝關節(jié)處。（2）分離腓腸肌 用玻璃分針或鑷子將腓腸肌跟腱分離，并穿線結(jié)扎。在結(jié)扎遠端用粗剪刀剪斷跟腱，左手執(zhí)線提起腓腸肌，以手術剪刀剪去其周圍聯(lián)系的組織，但保留腓腸肌起始點與骨的聯(lián)系，唯須注意勿損傷支配該肌的神經(jīng)分支。（3）游離坐骨神經(jīng)腓腸肌標本 將該后肢股部所有肌肉從膝關節(jié)起沿股骨剝離并剪去，以粗剪刀在股骨上中1/3處剪斷股骨，剪下一小段與神經(jīng)相連的脊柱（約12個脊椎骨）在膝關節(jié)下將小腿剪掉，留下的即為坐骨神經(jīng)腓腸肌標本。（4）檢查標本的興奮性 用經(jīng)任氏溶液潤濕的鋅銅弓輕輕接觸一下坐骨神經(jīng)，如

10、腓腸肌發(fā)生迅速而明顯的收縮，則表明標本的興奮性良好，即可將標本放在盛有任氏液的培養(yǎng)皿中，以備實驗用。若無鋅銅弓，亦可用中等強度單個電刺激作上述試驗?！咀⒁馐马棥?.沿脊柱中央把下半身剪為左右兩大半時，要正中，否則會損傷坐骨神經(jīng)。     2.神經(jīng)分離需用玻璃分針，分離過程中操作必須精細，避免用金屬器械碰夾神經(jīng)，以免損傷。同時要注意持針分離方向應由中心向外周，以免將神經(jīng)上段撕傷。坐骨神經(jīng)周圍的組織和神經(jīng)的小分枝，可用分針純性分離或用剪刀逐步剪掉。3.所用的器械要潔凈，接觸蛙皮膚，特別是蟾蜍皮膚的用具必須洗凈后使用。4.應經(jīng)常用任氏液濕潤標本，防止干燥?！舅?/p>

11、考題】1.你制備的坐骨神經(jīng)腓腸肌標本的興奮性如何？2.根據(jù)個人體會，總結(jié)制備新鮮完整的坐骨神經(jīng)標本過程中的注意事項和體會實驗三 刺激強度與骨骼肌收縮反應的關系學習目的：1、學習肌肉實驗的電刺激方法及肌肉收縮的記錄方法。2、觀察刺激強度與肌肉收縮反應的關系。基本原理：腓腸肌由許多肌纖維組成，刺激腓腸肌時，不同刺激強度會引起肌肉的不同反應。當刺激強度過小時，不引起肌肉發(fā)生收縮反應，此時的刺激為閾下刺激。當全部肌纖維同時收縮時，則出現(xiàn)最大的收縮反應。這時，即使在增大刺激強度，肌肉收縮的力量也不再隨之加大?？梢砸鸺∪獍l(fā)生最大收縮反應的最小刺激強度為最適刺激強度。動物與器械蟾蜍（或蛙）的腓腸肌標本、常

12、用手術器械、BL420E 、張力傳感器、刺激電極、支架、雙凹夾、肌槽、不銹鋼盤、滴管、任氏液、棉線。方法與步驟1、破壞腦脊髓： （1）取蟾蜍一只，用自來水沖洗干凈。左手握住蟾蜍，用食指按其頭部使之略向前屈，拇指按住其背部，其余三指則握住蟾蜍的四肢和腹部（2）用右手持金屬探針，在頭顱后緣，自枕骨大孔與脊椎管之間刺入椎管，先左右擺動， 離斷脊髓；再向前插入顱腔，向左右擺動數(shù)次，搗毀全部腦組織，如探針確已插入顱腔，則向各方向擺動時，即有觸及顱骨的感覺。（3）將探針撤回至枕骨大孔，但不拔出皮膚，直接向后插入脊椎管，直達骶部，輕輕轉(zhuǎn)動探針，以破壞脊髓。如探針確已在脊椎管中，則不能左右擺動，探針不得穿透脊

13、椎管，以免損傷內(nèi)臟。最后拔出探針，用小棉球堵塞創(chuàng)口以止血。 腦脊髓破壞完全后，蟾蜍將失去一切反射活動，全身肌肉軟癱。如動物仍有反射動作，表示破壞不徹底，必須重新破壞。 2、去皮和制作下肢標本：（1）左手握住蟾蜍的脊柱，用粗剪刀在前肢腋窩處，將脊柱橫斷，并沿脊柱兩側(cè)避開坐骨神經(jīng)剪開腹壁，此時頭、軀干上部及內(nèi)臟全部下垂，剪除頭、全部軀干及內(nèi)臟組織，剪去肛周皮膚，留下脊柱和后肢（2）用圓頭鑷子夾住脊柱邊緣，注意不要碰到坐骨神經(jīng)，捏住皮膚邊緣，逐步向下牽拉剝離皮膚。將全部皮膚剝除后，標本放于盛有任氏液的小燒杯中。隨即洗凈蛙板、剪刀和雙手上的污物及毒汁。（3）用粗剪刀沿脊柱和骨盆的中線，將標本縱剖為兩半

14、，注意勿損傷坐骨神經(jīng)。一半置于蛙板上，以制備標本；另一半置于盛有任氏液的玻璃平皿中備用。3、制備神經(jīng)腓腸肌標本：（1）把下肢的背面朝上，辨認蟾蜍大腿的三頭肌、二頭肌和半膜肌，以及小腿的腓腸肌。（2）用玻璃鉤針和鑷子仔細把二頭肌和半膜肌分開，便可看到一條粗大的神經(jīng)，此即坐骨神經(jīng)。用玻璃鉤針把神經(jīng)挑起，剪去通往大腿肌肉的神經(jīng)分支，順著神經(jīng)走行方向，轉(zhuǎn)向腹腔面沿脊柱逐漸把神經(jīng)主干全部分出，直到所連的椎骨為止。用粗剪刀剪除多余的肌肉和脊椎骨，僅留下與坐骨神經(jīng)相連的一小塊脊椎骨，用鑷子夾住這塊脊椎骨，輕輕提起坐骨神經(jīng)，用手術剪剪去殘余的分支，并將坐骨神經(jīng)一直分離到膝關節(jié)附近。（3）分離腓腸肌的跟腱，用線

15、結(jié)扎跟腱，在結(jié)扎處以下將跟腱剪斷。持線提起腓腸肌，用粗剪刀剪去小腿骨和其上的肌肉，再將大腿肌肉剪去，只留長約12cm的股骨，并將其上肌肉刮干凈，以便在肌動器上固定此標本。4、檢驗標本：用鋅銅弓的兩端輕輕接觸神經(jīng)，若肌肉產(chǎn)生收縮，則表示此標本的機能狀態(tài)良好。5、實驗儀器用品的準備。打開計算機采集系統(tǒng)，連接張力傳感器與刺激輸出。將標本的骨頭固定在肌槽的骨頭固定孔內(nèi)，腓腸肌肌腱上的扎線與張力傳感器應變梁相連，雙針形刺激電極密切接觸近膝關節(jié)處的腓腸肌，電極接頭與刺激輸出線相通，調(diào)節(jié)好扎線的張力，不可過松或過緊，以使肌肉自然拉平為宜（保證肌肉一旦收縮，即可牽動張力傳感器的應變梁）。6、計算機采集系統(tǒng)的準

16、備開通與張力傳感器相連的通道，選擇張力信號輸入，然后啟動波形顯示圖標，此時顯示通道中出現(xiàn)掃描線。調(diào)節(jié)刺激裝置的設置，將延時、波寬及刺激強度調(diào)至最小，選擇單刺激方式刺激。啟動刺激圖標，調(diào)節(jié)掃描基線接近刺激標記先后即可進行實驗。7、實驗觀察（1） 啟動刺激圖標，觀察肌肉收縮反應。如果肌肉無收縮反應，則適當增加刺激強度，其他刺激參數(shù)保持不變。間隔少許時間，同法進行第二次刺激，直到出現(xiàn)肌肉的最小收縮。測量收縮幅度并記下刺激強度，此時的刺激強度為閾強度。（2） 同法逐漸增加刺激強度，觀察刺激強度與肌肉收縮反應的關系。（3） 當刺激強度達到某一數(shù)值后，肌肉收縮幅度不再隨刺激強度的增加而升高。記錄34次同等

17、高度的收縮曲線和刺激強度。實驗四 神經(jīng)干復合動作電位的記錄觀察【目的要求】1.學習電生理實驗方法。2.觀察蛙坐骨神經(jīng)干復合動作電位的波形，并了解其產(chǎn)生的基本原理。3、學習測定不應期的方法，及學習測定神經(jīng)沖動傳導速度的方法?！净驹怼可窠?jīng)干在受到有效刺激后，可以產(chǎn)生動作電位，標志著神經(jīng)發(fā)生興奮。如果在神經(jīng)干另一端引導傳來的興奮沖動，可以引導出雙相的動作電位，如果在兩個引導電極之間將神經(jīng)麻醉或損壞，則引導出的動作電位即為單相動作電位。神經(jīng)細胞的動作電位是以“全或無"方式產(chǎn)生的。坐骨神經(jīng)干是以由很多不同類型的神經(jīng)纖維組成的，所以，神經(jīng)干的動作電位是復合動作電位。復合動作電位的幅值在一定刺

18、激強度下是隨刺激強度的變化而變化的。神經(jīng)在一次興奮的過程中，其興奮性也發(fā)生一個周期性的變化，而后才恢復正常。興奮性的周期變化，依次包括絕對不應期、相對不應期、超常期和低常期4個時期。根據(jù)兩次刺激間隔的設置，可以觀察出興奮的周期。神經(jīng)干受到有效刺激發(fā)生興奮后，產(chǎn)生的動作電位將以一定的速度沿神經(jīng)傳導。測定神經(jīng)纖維興奮的傳導速度v時，在遠離刺激點的不同距離處分別用兩組引導電極引導動作電位，測出兩引導點之間的距離m和分別引導出的動作電位的時相差s，根據(jù)v = m / s即可計算出其傳導速度。【動物與器材】蟾蜍或蛙、常用手術器械、計算機采集系統(tǒng)、神經(jīng)屏蔽盒、任氏液?！痉椒ㄅc步驟】1. 

19、0;制備蛙或蟾蜍坐骨神經(jīng)干標本。2. 將蛙的坐骨神經(jīng)干標本置于屏蔽盒內(nèi)的電極上，神經(jīng)干的中樞端置于刺激電極一側(cè)，從末梢端引導動作電位。3. 動作電位的觀察與記錄(1) 神經(jīng)干興奮閾值的測定刺激強度從0.1V開始，逐漸增加刺激強度，當剛剛出現(xiàn)動作電位時的刺激強度，即為神經(jīng)干的興奮閾值。(2) 雙相動作電位在刺激閾值的基礎上逐漸加大刺激強度，可見動作電位的圖形為雙相，而且其幅值隨刺激強度增大而加大。當刺激增加到一定強度時，可見動作電位的幅值不再增大。(3) 動作電位參數(shù)的測量用鼠標點擊“快捷工具欄”的“觀察”，移動鼠標，測出動作電位的一系列參數(shù)。(4)

20、60;單相動作電位在兩個引導點擊之間損傷神經(jīng)干標本，可使原來的雙相動作電位的下相小時，變?yōu)閱蜗?；注意上相動作電位的圖形有什么變化。4、神經(jīng)干不應期的測定用鼠標點擊“開始”“刺激”，最初可見到相距30ms（首間隔）的兩個動作電位圖形，而且兩個圖形的幅值是同樣大小的。此后用鼠標再次點擊“刺激”，每刺激一次，第二個刺激即按照“間隔”所設定的時間向第一個刺激靠近一次，從而使第二個動作電位圖形向第一個動作電位相應靠近。當發(fā)現(xiàn)第二個動作電位的圖形幅值開始比第一個減小時，說明第二個刺激落入到第一次刺激的相對不應期。第二個刺激越是靠近第一個刺激，其動作電位的幅值就越小。當?shù)诙€刺激距離第一個刺激大約為1.52

21、ms左右時，第二個動作電位則完全消失，表明第二個刺激落入到第一次興奮后的絕對不應期。 5、 神經(jīng)沖動傳導速度的測定實驗測得搭在兩組引導電極之間的神經(jīng)干長度m，兩個動作電位起始點的時間間隔s，由公式v = m / s計算得實驗用的蛙坐骨神經(jīng)干標本的興奮傳導速度【注意事項】a) 實驗過程中注意保持標本的活性良好，經(jīng)常用任氏液濕潤之。b) 如果在顯示窗上發(fā)現(xiàn)動作電位圖形倒置，將引導電極位置交換即可。C) 在引導動作電位的實驗中常常會記錄到刺激偽跡。刺激偽跡是由外加的刺激和電緊張電位產(chǎn)生的，會隨著刺激強度的變化而不斷變化，而且刺激偽跡是雙相的，通過這些特點可以將刺激偽跡與動作電位的曲線分辨開來。實驗五 脊神經(jīng)背根和腹根機能的驗證【目的要求】. 1學習暴露脊髓和分離脊神經(jīng)背、腹根的方法。 2了解背根和腹根的不同機能。 【基本原理】. 脊神經(jīng)的背根是由傳入神經(jīng)纖維組成，具有傳入機能；腹根由傳出神經(jīng)纖