人NK細胞體外高效擴增實驗探究

1、人nk細胞體外高效擴增實驗探究作者：黃慶生，李琦，黃勇，商澎，張明杰【摘要】 目的：建立人nk細胞體外大量擴增的方法。 方法：采用基因工程方法，在k562細胞上同時表達il 15、 il 18、4 1bbl 3種基因，構(gòu)建特定的k562工程細胞作 為刺激細胞。il 15、 il 18基因分別與一段特殊的跨膜 蛋白基因融合，4 1bbl直接跨膜表達，使這3種蛋白在 k562細胞中表達后錨定于細胞膜表面。其次，以照射致死的 該k562工程細胞作為刺激細胞，以人外周血單個核細胞 (pbmc)為擴增培養(yǎng)對象，通過與il 2的共刺激作用，使 nk細胞在體外培養(yǎng)條件下得到大量的擴增。結(jié)果：經(jīng)過21 d 的

2、刺激培養(yǎng)后，cd56+cd3-細胞數(shù)量擴增了 (520±75)倍。 cd56+cd3-細胞的純度從培養(yǎng)前占pbmc的7%±4%到擴增后占 總細胞比例的93%±3%o pbmc中的t細胞基本上沒有得到擴 增，擴增后的細胞中cd3+細胞只占2%±1.2%。擴增的細胞 具備了 nk細胞的基本特征和生物學特性，除了 cd56+cd3- 外，還對擴增的nk細胞上nkg2d、nkp46、nkp44、nkp30、 cd94、cd158b、cd158a. nkb1、nkat2 等標記進行了驗 證。細胞毒實驗表明，在效應細胞：靶細胞為5 ： 1時，擴 增的nk細胞的殺傷率

3、達到了 95%±4%o結(jié)論：建立的nk細 胞體外擴增方法，達到了較高的擴增水平，且擴增的細胞 活性較好。本方法以pbmc為原始材料，能夠?qū)崿F(xiàn)nk細胞體 外的大規(guī)模制備，這將為抗病毒與抗腫瘤的nk細胞免疫治 療奠定基礎?！娟P(guān)鍵詞】擴增；自然殺傷細胞；白細胞介素15；白細 胞介素18； 4 1bb配體nk細胞(natural ldller cell)的過繼治療在抗病 毒、抗腫瘤的治療中有著廣泛的應用前景，在造血干細胞 移植后減少移植物抗宿主反應中的作用也倍受關(guān)注1, 2o 由于nk細胞在外周血中所占的比例很少，建立一種有效的 nk細胞體外擴增系統(tǒng)是深入研究nk細胞功能與探討nk細胞 免疫

4、治療的基礎。體外獲取人nk細胞主要有兩種途徑：一 是采用抗nk細胞特異性抗體與磁珠交聯(lián)的方法，從pbmc中 分離人nk細胞；二是采用刺激擴增培養(yǎng)的方法，從pbmc中 擴增培養(yǎng)人nk細胞。前者可以快速獲得nk細胞，但只適用 于小規(guī)模的nk制備用于研究分析。后者則是以pbmc (或以 磁珠分離的nk細胞)為原始材料，通過特定細胞因子的刺 激，使nk細胞在體外得到特異的擴增3, 4,這種方法 是目前被認為比較有應用前景的方法，通過體外的刺激培 養(yǎng)可進行相對大規(guī)模的nk細胞制備，使臨床應用成為可能。 但是迄今為止多數(shù)的體外刺激擴增培養(yǎng)也只能使nk細胞在 體外擴增數(shù)十到百倍，且純度也不理想。在刺激nk細

5、胞生 長上，已知il 2、 il 15、 il 18和il 12等細胞因 子在對nk細胞的生長與擴增是非常重要的，其中il 15的 作用尤為重要。除了細胞因子對nk細胞的生長具有促進作 用外，研究人員還注意到k562、hfwt等腫瘤細胞也能夠刺 激nk細胞的擴增。研究表明，il 15處于細胞膜上比其可 溶狀態(tài)能更有力刺激nk細胞的生長5, 6o imai等7 研究證明，如果單純將k562細胞與可溶形式的il 15混合 后刺激nk細胞，結(jié)果與以往的單純細胞因子刺激或者腫瘤 細胞刺激相比沒有太大的差別，只能使nk細胞擴增數(shù)十倍。 但是，如果將il 15表達在k562細胞的表面（非可溶形式 的il

6、15）,使il 15基因及4 1bbl基因與跨膜蛋白基 因融合，共同表達在k562細胞的膜表面。這樣，通過v射 線照射致死的該刺激細胞與pbmc的共同孵育（刺激細胞與 nk細胞間的接觸刺激），經(jīng)過3周時間的培養(yǎng)，nk細胞得 到大量的擴增，明顯高于目前報道的各種擴增方法。我們在 上述方法的基礎上進行改進，在k562細胞膜表面表達 il 15與4 1bbl的同時，將il 18也同時表達在k562細 胞的表面，以該細胞為刺激細胞，對其在nk細胞擴增中的 作用進行了實驗研究。1材料和方法1. 1材料pbmc分別來自8個健康獻血者（男女各4 人），其中年齡最大45歲，最小22歲，平均38歲。k562 細

7、胞、含cd8a信號肽和穿膜區(qū)基因的真核表達載體本室 已構(gòu)建；il 15、il 18、4 1bbl cdna分別從正常人淋 巴細胞中擴增；抗人 cd56、cd3、cd94、nkg2d、nkp46、 nkp30、nkp44、cd158b、cd158a. nkb1. nkat2 特異性 抗體購自美國bd biosciences公司及coulter公司；nk殺 傷活性檢測采用日本同仁化學研究所（dojindo）的cell counting kit 8 試劑盒。rpmi1640 為 gibco brl 公司產(chǎn)品。1.2方法1.2. 1 表達 il 15、il 18、4 1bbl k562 細胞 的構(gòu)建采

8、用rt pcr方法分別從人pbmc中擴增il 15、 4 1bbl. il 18 cdna,測序正確后，il 15、il 18 基 因分別克隆至cd8a信號肽的下游、cd8a跨膜區(qū)基因的上 游。重組的il 15、il 18、4 1bbl再分別亞克隆至含 有不同篩選標記的3種真核表達載體，先后轉(zhuǎn)染k562細胞 后，篩選穩(wěn)定表達的細胞克隆，構(gòu)建了 k562工程細胞株（以 下簡稱k562d3細胞）。k562d3細胞應用前（與pbmc共培養(yǎng) 前），用y射線滅活。1.2.2 nk細胞的刺激培養(yǎng) 新鮮分離的人pbmc, pbs 洗3次后，用含100 ml/l胎牛血清、1x106u/l可溶性 il 2的rp

9、mi1640培養(yǎng)液懸浮，加入24孔板中，每孔106 個細胞；隨后每孔再另加v射線滅活的k562d3細胞106個,37°c、50 ml/l c02孵箱培養(yǎng)，第6天起每隔3d對孔中的 液體半換液，培養(yǎng)21 d后收獲細胞并用流式細胞術(shù)進行細 胞分類分析，確定cd56+cd3-細胞的比例。同時設以下平行 對照組：單純k562細胞刺激組、單純加入k562細胞以及 可溶性 il 15/il18 刺激組、表達 il 15/41bbl/k562細胞刺激組、單獨表達4 1bbl的k562細胞組、單獨表 達il 15的k562細胞組和單獨表達il 18的k562細胞組。 所有組的培養(yǎng)液均為rpmi164

10、0含100 ml/l胎牛血清、 1x106 u/l 可溶性 il 2o1. 2. 3nk細胞標志物的測定 擴增前的pbmc以及擴增 培養(yǎng)21 d的細胞通過流式細胞術(shù)分析，分別用cd56、cd3 抗體對擴增（培養(yǎng)）前后的細胞進行分類鑒定，確認nk細 胞的比例。同時還對擴增nk細胞的激活性受體和抑制性受 體水平分別用 cd94、nkg2d、nkp46、nkp30、nkp44、 cd158b、cd158a、nkb1. nkat2抗體，通過流式細胞術(shù)進 行評估。1. 2. 4 nk細胞殺傷活性測定96孔培養(yǎng)板，每孔含一 定數(shù)量的nk細胞作為效應細胞，另加入一定數(shù)量的k562細 胞作為靶細胞，兩種細胞的

11、數(shù)量比例根據(jù)效應細胞與靶細 胞的比值要求而定，總體積200 ul （液體為100 ml/l胎牛 血清的rpmi1640培養(yǎng)液），37°c、c02培養(yǎng)箱4 h,每孔 加入 20 p l cell counting 試劑，37°c c02 培養(yǎng)箱 2 h,450 run波長測定吸光值（a）,計算殺傷率。同時設只有nk細胞以及只有k562細胞的對照孔。殺傷率二1 （ae+t-ae）/at x100%； ae：單純效應細胞孔即nk細胞孔 的a值；at：單純靶細胞孔即k562細胞孔的a值；ae+t：效 應細胞加靶細胞孔的a值。2結(jié)果2. 1 k562d3細胞 構(gòu)建的k562d3細胞通

12、過抗 4 1bbl、 il 15和il 18抗體染色，證明k562d3細胞 同時表達了這3種蛋白。y射線照射后的k562d3細胞經(jīng)過 2周的連續(xù)培養(yǎng)，未見有存活細胞。照射后的細胞在36 d 內(nèi)仍然保持完整的細胞形狀，與pbmc混合后的該照射細胞 在第56天后破碎并被逐漸吞噬干凈。2.2 k562d3細胞與pbmc共培養(yǎng)后nk細胞的擴增8 份健康供血者pbmc細胞，擴增前經(jīng)流式細胞術(shù)分析，確認 cd56+cd3-細胞占總細胞的7%±4%, cd3+細胞（主要為t細 胞）占總數(shù)的56%±8%（圖1a）ok562d3工程細胞刺激組（pbmc 與表達il 18/il15/4 1bb

13、l的k562細胞共培養(yǎng)），經(jīng)過21 d刺激培養(yǎng)后，cd56+cd3-細胞占總細胞的93%±3%, cd3+細胞只占總數(shù)的2%±1.2%（圖ib）, nk細胞（cd56+cd3-） 數(shù)量擴增了（520±75）倍。平行對照培養(yǎng)中，表達 il 15/4 1bbl 的 k562 細胞刺激組，21 d 后 cd56+cd3-細胞大約擴增了 (500±50)倍，cd56+cd3-細胞占擴增后總細胞 數(shù)的91%±4%。k562細胞加可溶性il 15/il18組，21 d后nk細胞大約擴增了 (50±10)倍；單純與k562細胞共培養(yǎng) 組，21 d后

14、nk細胞大約擴增了(20±8)倍；單獨表達 4 1bbl或單獨表達il 15或單獨表達il 18的k562細胞 刺激組21 d后分別擴增了(80±26)倍、(110±32)倍和 (25±9)倍(圖2)；各組之間，k562d3工程細胞刺激組與 k562表達il 15/4 1bbl細胞刺激組，這兩組的擴增倍數(shù) 接近(p&gt；0.05,無統(tǒng)計學意義)，但明顯高于其余組 (p&lt；0. 05)o2. 3擴增的nk細胞表面標記分析對k562d3工程細 胞刺激擴增的nk細胞，除了用cd56、cd3抗體予以確認外, 還采用流式細胞術(shù)分析，對其他幾種

15、代表nk細胞特征性的 受體 cd94、nkg2d、nkp46、nkp30. nkp44、cd 158b、 cd158&、nkb1和nkat2分別進行了檢測。結(jié)果證實這些標 志性的受體在擴增的nk細胞中分別為cd94陽性95%、nkg2d 陽性 95%、nkp46 陽性 84%、nkp30 陽性 62%、nkp44 陽性 65%、cd 158b 陽性 20%、cd158a 陽性 18%、nkb1 陽性 30%、 nkat2 陽性 20% o2.4擴增的nk細胞殺傷實驗對k562d3工程細胞刺 激組和il 15/4 1bbl k562細胞刺激組所擴增的nk細胞 的殺傷能力進行了比較，結(jié)果表

16、明在效應細胞：靶細胞為 5 ： 1時，兩組的殺傷率分別為95%±4%和85%±7%；在效應 細胞：靶細胞為2 ： 1時，兩組的殺傷率分別為75%±6%和 60%±9% (圖3)；兩組nk細胞的殺傷率差別有統(tǒng)計學意義(p&lt；0. 05)o圖1擴增前后的樣品流式細胞術(shù)分析(略)fig 1 flow cytometry analysis before and after expasiona： pbmc analyzed by flow cytometry before expansion； b： expanded cells analyzed by

17、 flow cytometry on days 21 of expansion.圖2 7組刺激成分對pbmc中nk細胞擴增效果比較 (略)fig 2 expansion efficiency of 7 stimulators1： k562d3 (520±75) ； 2： il 15/4 1bbl membrane bound k562 (500±50) ； 3： k562 cell with soluble il 15 and il 18 (50±10) ； 4： k562 cell only (20±8) ； 5： 4 1bbl membrane bo

18、und k562(800±26) ； 6： il 15membrane bound k562( 110 + 32) ； 7: il 18 membranebound k562(25±9)圖3 k562d3刺激擴增的nk細胞與k562表達il 15/4 1bbl刺激擴增的nk細胞殺傷率比較（略）fig 3 cytotoxicity between nk cells expanded by stimulator of k562d3 and nk cells expanded by stimulator of il 15/4 1bbl membrane bound k562a：

19、the cytotoxicity were 95%±4% for nk cells expanded by k562d3 and 85%±7% for nk cells expanded by il 15/4 1bbl membrane bound k562 at 5 * 1 e ： t ratio. b： cytotoxicity were 75%±6% for nk cells expanded by k562d3 and 60%+9% for nk cells expanded by il 15/4 1bbl membrane bound k562 at 2

20、 * 1 e ： t ratio.3討論nk細胞在抗病毒、抗腫瘤上扮演著重要的角色，因 其作用不需初次免疫活化，因而在過繼免疫治療上有其獨 特的應用前景。由于不能獲得數(shù)量大、純度高的人nk細胞, 使nk細胞在免疫治療中的應用受到了限制。采用體外擴增 的方法獲得足夠數(shù)量和較高純度的人nk細胞，是近年來研 究nk細胞功能特別是探討過繼免疫治療的一個重要基礎平 臺。國內(nèi)外學者在擴增的方法上進行了各種的探索，如采用 磁株分選的方法先從人pbmc中分離nk細胞，獲得的nk細胞在體外培養(yǎng)條件下，用可溶性il 2、 il 12、 il 15 等細胞因子共同刺激，能使nk細胞擴增數(shù)十倍3, 4。除 了細胞因子

21、外，k562、hfwt等腫瘤細胞也能夠刺激nk細胞 的擴增，采用照射致死的k562細胞或hfwt細胞與pbmc共 培養(yǎng)，也能使pbmc中的nk細胞得到一定的擴增80在數(shù) 量上，上述這些擴增方法獲得的nk細胞似乎還不能滿足過 繼免疫治療的需要，僅僅靠可溶性細胞因子的刺激還很難 使nk細胞得到大量的擴增。4 與其配體4 1bbl是一 對重要的共刺激分子，對于活化t細胞、nk細胞以及介導 免疫應答具有重要的作用。4 1bbl與il 15結(jié)合是pbmc 中nk細胞得到特異擴增的基礎，而以非可溶形式表達的這 兩種蛋白，通過細胞間的接觸刺激則是使nk細胞大量擴增 的主要原因。imai等7建立的這種擴增方法

22、是迄今為止 擴增效率最高的一種方法。我們在綜合這些方法的基礎上對 體外大規(guī)模擴增人nk細胞進行了探索。由于il 18是一種 重要的nk細胞調(diào)節(jié)因子，可以促進nk細胞的增殖、活化、 殺傷及分泌等功能9,本研究在以膜蛋白形式表達 4 1bbl 與 il 15 的基礎上，構(gòu)建了表達 4 1bbl/il 15/il18 3 種成分的 k562 刺激細胞 k562d3,結(jié)果表明用k562d3擴增的nk細胞，其細胞毒活性比 il 15/41bbl/k562擴增的nk細胞提高了約10%,擴增倍數(shù)達到了 520倍。本擴增方法獲得的nk細胞活性好（95%殺 傷率)、純度高(93%),且方法簡便實用，有望成為探索

23、 nk細胞過繼免疫治療的一重要平臺?！緟⒖嘉墨I】1 klingemann hg natural killer cell based immunotherapeutic strategies j . cytotherapy, 2005, 7(1)： 16-22.2 grzywacz b, miller js, verneris mr. use of natural killer cells as immunotherapy for leukaemiaj . best pract res clin haematol, 2008, 21 (3): 467-483.3 klingemann hg and martinson j. ex vivo expansion of natural killer cells for clinical applications j cytotherapy, 2004, 6(1): 15一22.4 李曉紅，馬健，汪菲菲，等.體外擴增高純 度的人外周血來源的nk細胞的研究j.中國實驗血液學 雜志，2007, 15(2)： 373-3775 musso t, calosso l, zucca m, et al. human monocytes constitutively e