發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)過關(guān)

1、發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書適用專業(yè)：生物工程 生物技術(shù) 指導(dǎo)教師：李安華實(shí)驗(yàn)一  發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)系統(tǒng)及使用方法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?#160;   1了解發(fā)酵罐（氣升式、攪拌式）的幾大系統(tǒng)組成，即空氣系統(tǒng)、蒸汽系統(tǒng)、補(bǔ)料系統(tǒng)、進(jìn)出料系統(tǒng)、溫度系統(tǒng)、在線控制系統(tǒng)。2掌握發(fā)酵罐空消的具體方法及步驟3掌握發(fā)酵罐進(jìn)料及實(shí)消的具體方法及步驟4掌握發(fā)酵罐各系統(tǒng)的控制操作方法二、實(shí)驗(yàn)原理：1 蒸汽系統(tǒng)：三路進(jìn)汽空氣管路、補(bǔ)料管路、罐體2溫度系統(tǒng)：(1) 夾套升溫：蒸汽通入夾套。(2) 夾套降溫：冷水通入夾套，下進(jìn)水，上出水。3空氣系統(tǒng)：取氣口空壓機(jī)：往復(fù)式油泵獲得

2、高脈沖的壓縮空氣  粗過濾器：由沙布包裹棉花壓實(shí)成塊狀疊加制得，作用是去除部分細(xì)菌及大部分灰塵（貯氣罐）：空壓機(jī)壓縮使氣體溫度升高，經(jīng)貯氣使氣體保溫殺菌；壓縮空氣中有油污、水滴，且壓力不穩(wěn)，有一定的脈沖作用，會(huì)沖翻后面的過濾介質(zhì)，貯氣后可使油滴重力沉降，減小脈沖。（冷卻塔）：有降溫并穩(wěn)定作用，同時(shí)經(jīng)旋風(fēng)分離器進(jìn)行氣液分離(絲網(wǎng)分離器)：通過附著作用，逐步累積沉降而分離5微米以上的微粒               其作用介質(zhì)為銅絲網(wǎng)(加溫器)： 對(duì)

3、壓縮空氣升溫，除濕，使?jié)穸冗_(dá)50%-60%總過濾器：紗布包裹棉花加活性炭顆粒，逐層壓緊而成。分過濾器：平板式纖維，中間為玻璃纖維或絲棉，下面放水閥應(yīng)適時(shí)打開放出油、水，再用壓縮空氣控干。種子罐或發(fā)酵罐4補(bǔ)料系統(tǒng)：補(bǔ)培養(yǎng)基、消泡劑、酸堿等。5在線控制系統(tǒng)：熱電偶（溫度探關(guān)）、溶氧探頭、pH探頭（后二者實(shí)消時(shí)才安裝，為不可再生探頭，有限定使用次數(shù)，pH探頭使用前要先校準(zhǔn)）、控制柜、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)。6、進(jìn)出料系統(tǒng)：進(jìn)料口(接種口)、出料口(取樣口)。 7蒸汽過濾器：在蒸汽進(jìn)入空氣系統(tǒng)時(shí)應(yīng)用，以免蒸汽中攜帶的雜質(zhì)顆粒堵塞分過濾器微孔。三、方法與步驟：(一)原則：1 通蒸汽前先關(guān)閉所有

4、閥門。2粗過濾器不空消也不實(shí)消，要定期處理，所以必須關(guān)閉通向粗過濾器的閥門。3活蒸汽，滅過頭，即尾汽不能關(guān)死，要保證有活蒸汽放出，但不能太大，以免分壓。4罐體排汽口排汽，并保持罐內(nèi)正壓。5空氣過濾系統(tǒng)只空消，不實(shí)消，以免罐中物料沖入過濾器內(nèi)。但空消一結(jié)束，即要通入無菌空氣吹干管路并保壓，避免染菌。6進(jìn)蒸汽時(shí)順著蒸汽管路開閥門，結(jié)束時(shí)逆著進(jìn)路關(guān)閥門，先開尾閥后開主閥，結(jié)束時(shí)先關(guān)主閥后關(guān)尾閥。8蒸汽一停，即由無菌空氣充入保持罐內(nèi)正壓。（二）空消：先開啟蒸汽發(fā)生器，自有蒸汽產(chǎn)生并排掉管路中冷凝水后，按以下步驟進(jìn)行：1先關(guān)閉所有閥門，檢查處是否關(guān)緊密封，打開罐上方排氣口。2蒸汽先進(jìn)空氣系統(tǒng)，蒸汽蒸汽過

5、濾器分過濾器，無論蒸汽走到哪一路得先放尾閥，放出冷凝水，排掉冷空氣，待有蒸汽沖出后調(diào)小，打開主閥。3再進(jìn)罐體：由主路進(jìn)罐，然后通入取料管路，再入補(bǔ)料系統(tǒng)（兩邊）。4罐壓升至0.12Mpa(此時(shí)控制系統(tǒng)中溫度讀數(shù)約為120左右)時(shí)開始計(jì)時(shí)，保溫保壓，30分鐘。保壓方式：（1）調(diào)節(jié)主汽路進(jìn)汽閥門控制進(jìn)汽量；（2）調(diào)節(jié)排氣口排氣量大小或尾閥放汽量。5結(jié)束空消：（1）逆著蒸汽進(jìn)路關(guān)，先關(guān)近罐閥。（2）同時(shí)準(zhǔn)備好壓縮空氣確保蒸汽一停即充入無菌壓縮空氣以維持空氣系統(tǒng)及罐內(nèi)的正壓。近罐空氣閥的尾閥要一直微開啟。注意：空消前應(yīng)檢查夾套中是否殘留了冷水，若有，影響罐體升溫，須自夾套出水口將水放出。（三）進(jìn)料及升

6、溫1、調(diào)大排氣口排氣量，至罐壓掉零，開啟進(jìn)料口，加料。裝上溶氧探頭及pH探頭。2夾套升溫：蒸汽由夾套蒸汽管路進(jìn)入夾套進(jìn)行升溫（有表壓可讀出進(jìn)入夾套的氣壓），溫度可由控制面板上讀出，升至90，關(guān)閉夾套蒸汽。*升溫目的：冷的物料和罐體中直接沖入蒸汽，極易產(chǎn)生大量冷凝水而使培養(yǎng)基中水分過大；另外，對(duì)淀粉質(zhì)的物料，則直接通入蒸汽很容易使物料結(jié)球不溶，表面糊化結(jié)團(tuán)，影響滅菌效果；升溫還可以利于淀粉質(zhì)原料液化。*說明：(1)培養(yǎng)基配制時(shí)，考慮實(shí)消時(shí)會(huì)產(chǎn)生水分，因此，若考慮用7升的裝液量(10升罐)，則加液量應(yīng)為6升左右，其余物料按7升需量稱量。裝料系數(shù)一般為70%。（2）通蒸汽對(duì)夾套升溫時(shí)，必須排空夾套內(nèi)

7、水(可用蒸汽沖出)，但可微開啟出水口閥門適當(dāng)減壓，避免夾套內(nèi)壓力過大。 (四) 實(shí)消：1關(guān)閉氣路入罐閥，主汽路進(jìn)汽補(bǔ)料口進(jìn)汽（方法同空消）罐壓升至0.12Mpa（121），保壓、保溫30分鐘實(shí)消結(jié)束。（五）冷卻接種：蒸汽關(guān)閉的同時(shí)，即通入壓縮空氣（罐壓表頭掉至0.05MPa時(shí)接入無菌空氣）夾套通入自來水冷卻（下進(jìn)水，上出水閥門，送水排水）冷卻至約32接種（放大排氣口出氣量，至表頭掉零，開啟接種口，火圈接種）接種后擰緊接種口，將排氣閥調(diào)小，接上玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)，使流量計(jì)讀數(shù)在8.0左右，同時(shí)保持罐壓0.06Mpa在控制系統(tǒng)中設(shè)定好發(fā)酵溫度保溫保壓發(fā)酵24hr（六）數(shù)據(jù)采集、取樣、放罐數(shù)據(jù)

8、采集：系統(tǒng)自動(dòng)采集，每2分鐘采集一組數(shù)據(jù)并存貯，包括：溫度、溶氧、pH、等，系統(tǒng)可自動(dòng)給出有關(guān)曲線。同時(shí)由值班者每20分鐘記錄一次，準(zhǔn)確填表，獲取數(shù)據(jù)制作過程曲線。中間取樣：每取樣前，將取樣口蒸汽滅菌半小時(shí)棄去始放出的樣液約10毫升，再用無菌空容器取樣約100毫升無菌封存取樣口再滅菌30分鐘樣液冷藏待測(cè)。(具體步驟見電腦桌面文件)放罐：調(diào)節(jié)無菌空氣量放罐，方法同取樣。 (七) 罐體清洗放罐后，加大排氣，使表壓掉零，取出各探頭，加蓋，由進(jìn)料口加入凈水關(guān)好，罐內(nèi)升壓，放罐，如此重復(fù)兩次。實(shí)驗(yàn)二 紫外線誘變育種 一目的要求通過實(shí)驗(yàn)，觀察紫外線對(duì)枯草芽孢桿菌的誘變效應(yīng)，學(xué)習(xí)微生物誘變育種的基

9、本方法。二基本原理由于微生物自發(fā)突變率一般很低，為了提高突變頻率，可采用物理或化學(xué)的因素進(jìn)行誘發(fā)突變，紫外線是目前使用最方便且十分有效的物理誘變劑之一。紫外線對(duì)微生物有誘變作用，主要引起是DNA的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成共價(jià)結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體），從而引起菌體遺傳性變異。三菌種與儀器菌種：枯草芽孢桿菌； 培養(yǎng)基：肉湯培養(yǎng)基 淀粉培養(yǎng)基（牛肉膏 0.5g蛋白胨 1g氯化鈉 0.5g可溶性淀粉 0.2g水 100mLpH 7.07.2瓊脂 2g)滅菌 1.05kg/cm2，20min儀器：血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡，紫外線燈（15W），電磁攪拌器，離心機(jī) 、培養(yǎng)皿、三角瓶、涂布棒等四操

10、作步驟（1）菌懸液的制備a）取培養(yǎng)48小時(shí)的枯草芽孢桿菌的斜面45支，用無菌生理鹽水將菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角燒瓶中，振蕩30分鐘，以打碎菌塊。b）將上述菌液離心（3000r/min，離心15分鐘），棄去上清液，將菌體用無菌生理鹽水洗滌23次，最后制成菌懸液。c）用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升108個(gè)。（2）平板制作將淀粉瓊脂培養(yǎng)基溶化后，冷至55左右時(shí)倒平板，凝固后待用。（3）紫外線處理a）將紫外線燈開關(guān)打開預(yù)熱約20分鐘。b）取直徑6cm無菌平皿2套，分別加入上述菌懸液5ml，并放入無菌攪拌棒于平皿中。c）將盛有菌懸液的2平皿置于磁力攪拌器上，在距離為30cm，功率

11、為15W的紫外線燈下分別攪拌照射1分鐘及3分鐘。(4) 稀釋在紅燈下，將上述經(jīng)誘變處理的菌懸液以10倍稀釋法稀釋成10-1-10-6（具體可按估計(jì)的存活率進(jìn)行稀釋）。(5)涂平板取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度涂平板，每個(gè)稀釋度涂平板3只，每只平板加稀釋菌液0.1ml，用無菌玻璃刮棒涂勻。以同樣操作，取未經(jīng)紫外線處理的菌稀釋液涂平板作對(duì)照。(6)培養(yǎng)將上述涂勻的平板，用黑布（或黑紙）包好，置37培養(yǎng)48小時(shí)。注意每個(gè)平皿背面要標(biāo)明處理時(shí)間和稀釋度。(7)計(jì)數(shù)將培養(yǎng)48小時(shí)后的平板取出進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，根據(jù)對(duì)照平板上菌落數(shù)，計(jì)算出每毫升菌液中的活菌數(shù)。同樣計(jì)算出紫外線處理1分鐘、3分鐘后的存

12、活細(xì)胞數(shù)及其致死率。(8)觀察誘變效應(yīng)將細(xì)胞計(jì)數(shù)后的平板，分別向菌落數(shù)在56個(gè)左右的平板內(nèi)加碘液數(shù)滴，在菌落周圍將出現(xiàn)透明圈。分別測(cè)量透明圈直徑與菌落直徑并計(jì)算其比值（HC值）。與對(duì)照平板進(jìn)行比較，根據(jù)結(jié)果，說明誘變效應(yīng)。并選取HC比值大的菌落移接到試管斜面上培養(yǎng)。此斜面可作復(fù)篩用。五實(shí)驗(yàn)結(jié)果1結(jié)果將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下表。稀釋倍數(shù)平均菌落處理時(shí)間 （數(shù)/皿）誘變劑 （min）10-410-510-6存活率%致死率%紫外線（UV）0（對(duì)照）13結(jié)果處理透明圈和菌落直徑大?。ǎ┘捌銱C比值123456透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落H

13、C比值UV處理對(duì)照實(shí)驗(yàn)三 乳酸菌的分離及乳酸飲料的制作一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諒男迈r酸乳中進(jìn)行乳酸菌的分離純化的方法和制作乳酸菌飲料技術(shù)，了解乳酸發(fā)酵的條件及乳酸菌的生長(zhǎng)特性。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具 嗜熱乳酸鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亞乳酸桿菌（Lactobacillus casei），乳酸菌種也可以從市場(chǎng)銷售的各種新鮮酸乳或酸乳飲料中分離。乳酸菌培養(yǎng)基（MRS）、蔗糖、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、試管、300mL三角瓶、恒溫水溶鍋、酸度計(jì)、涂布棒等。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）乳酸菌的分離純化1、流程倒平板制備梯度稀釋液涂布（或劃線法）培養(yǎng)挑單菌落保存。

14、2、步驟：稀釋涂布平板法（1）制作MRS培養(yǎng)基乳酸菌培養(yǎng)基（MRS）配方：蛋白胨5g；牛肉膏5 g ；酵母浸膏 2.5 g ；葡萄糖10g； 土溫80 0.5ml；磷酸氫二鉀1g ；乙酸鈉2.5g ；檸檬酸氫二銨1g ；七水硫酸鎂0.29g；四水硫酸錳0.125g； 瓊脂條9g； 加入500ml蒸餾水中加熱溶解，調(diào)pH值為 6.8（6.26.6），115，滅菌15分鐘。（2)  倒平板 將MRS培養(yǎng)基分離乳酸菌加熱溶化待冷至5560時(shí)，混合均勻后分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿。 倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地?fù)艹?，試管或瓶口?/p>

15、持對(duì)著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒人培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。（3） 制備酸乳稀釋液（最好在無菌操作臺(tái)上進(jìn)行） 取市售新鮮酸乳反復(fù)搖勻，用無菌吸管吸取1ml，放入盛9ml無菌水的試管中，振搖約20min，使充分混合，將細(xì)胞分散。用一支lml無菌吸管從中吸取1ml懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取lml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4不同稀釋度的乳酸溶液，注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面

16、，每一個(gè)稀釋度換一支試管。（4） 涂布培養(yǎng)乳酸稀釋液涂布：將上述牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基三個(gè)平板底面分別用記號(hào)筆寫上 10-3和10-4兩種稀度，然后用無菌吸管分別由10-3、10-4兩管乳酸飲料稀釋液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在對(duì)應(yīng)平板培養(yǎng)基上，用無菌涂布器依次涂布，右手拿無菌涂棒平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴(kuò)展，使之分布均勻。；或者直接用接種環(huán)蘸取原液平板劃線分離，每稀釋液做兩個(gè)平板，置40培養(yǎng)48h，如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步定為乳酸菌。（5）鑒別：選取乳酸菌典型菌落轉(zhuǎn)至脫脂乳（脫脂乳粉與5%蔗糖水為1：10的比例配制

17、，裝量以試管的1/3為宜，115滅菌20min ）試管中，40培養(yǎng)8-24h，若牛乳出現(xiàn)凝固，無氣泡，呈酸性，涂片鏡檢細(xì)胞桿狀或鏈球狀（兩種形狀的菌種均分別選入），革蘭氏染色呈陽性，則可將其連續(xù)傳代4-6次，最終選擇出在3-6h能凝固的牛乳管，作菌種待用。(三)乳酸菌飲料的制作1、乳酸菌培養(yǎng)基的制作牛奶250ml加入6%蔗糖，充分混合，于8085滅菌105min，然后冷卻至3540，作為制作飲料的培養(yǎng)基質(zhì)。2、接種 將市售鮮酸乳作為發(fā)酵劑，以2%5%的接種量分別接入以上培養(yǎng)基質(zhì)中即為飲料發(fā)酵液。接種后搖勻，分裝到已滅菌的酸乳瓶中，每一種菌的飲料發(fā)酵液重復(fù)分裝35瓶，隨后將瓶蓋擰緊密封

18、。 3發(fā)酵 把接種后的酸乳瓶置于40-42恒溫箱中培養(yǎng)34h。培養(yǎng)時(shí)注意觀察，在出現(xiàn)凝乳后停止培養(yǎng)。然后轉(zhuǎn)入45的低溫下冷藏24h以上。經(jīng)此后熟階段，達(dá)到酸乳酸度適中(pH44.5)，凝塊均勻致密，無乳清析出，無氣泡，獲得較好的口感和特有風(fēng)味。 4以品嘗為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定酸乳質(zhì)量  品嘗時(shí)若出現(xiàn)異味，表明酸乳污染了雜菌。四、注意事項(xiàng) 1制作乳酸菌飲料，應(yīng)選用優(yōu)良的乳酸菌，采用乳酸球菌與乳酸桿菌等量混合發(fā)酵，使其具有獨(dú)特風(fēng)味和良好口感。 2牛乳的消毒應(yīng)掌握適宜溫度和時(shí)間，防止長(zhǎng)時(shí)間采用過高溫度消毒而破壞酸乳風(fēng)味。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄品評(píng)項(xiàng)目pH 值凝乳情況口 感香 味異 味1234實(shí)驗(yàn)

19、四 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定(一)目的要求1通過細(xì)菌數(shù)量的測(cè)量了解大腸桿菌的生物特征和規(guī)律，繪制生長(zhǎng)線。2學(xué)習(xí)利用分光光度計(jì)測(cè)量細(xì)菌數(shù)量的方法。(二)器材1菌種  大腸桿菌 pH計(jì) 分光光度計(jì)2培養(yǎng)基    肉湯液體培養(yǎng)基100ml/500ml或70ml/250ml三角瓶，補(bǔ)加2%，4%和6%的葡萄糖。3儀器或其他用具    722型分光光度計(jì)，回轉(zhuǎn)搖床，無菌吸管等。(三)操作步驟1標(biāo)記按照不同配比配制液體培養(yǎng)基，并標(biāo)記滅菌。2接種用斜面接種試管發(fā)酵液，培養(yǎng)14-18h，分別用5ml無菌吸管，按照

20、1%的接種量，在無菌情況下，吸取相應(yīng)培養(yǎng)液(培養(yǎng)16h左右)轉(zhuǎn)入盛有肉湯培養(yǎng)液的三角瓶?jī)?nèi)。3培養(yǎng)將已接種的試管置搖床37振蕩培養(yǎng)(振蕩頻率200r/min)，分別培養(yǎng)0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，每一時(shí)間點(diǎn)，在無菌條件下取樣3.5毫升到干凈的試管中，貼上標(biāo)簽（培養(yǎng)時(shí)間），立即放冰箱中貯存，最后一同比濁測(cè)定其光密度值和pH值（試管內(nèi)用試紙，搖瓶用pH計(jì)）。4比濁測(cè)定用未接種的肉湯液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，選用600nm波長(zhǎng)進(jìn)行光電比濁測(cè)定。從早取出的培養(yǎng)液開始依次測(cè)定，對(duì)細(xì)胞密度大的培養(yǎng)液用肉湯液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測(cè)定，使其光密度值在0.11.0之內(nèi)(測(cè)定OD值前，將待測(cè)定的培養(yǎng)液振蕩，使細(xì)胞均勻分布)。(四)實(shí)驗(yàn)報(bào)告1結(jié)果(1)將測(cè)定的OD600值填入下表：(2)繪制大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線培養(yǎng)時(shí)間02468101214161820OD600pH值實(shí)驗(yàn)五 搖床培養(yǎng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化一實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆瘴⑸镄泵媾囵B(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基確定方法，學(xué)會(huì)對(duì)已確定菌種確定實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵工藝。