薄層色譜法-補(bǔ)充

1、薄層色譜法（TLC）薄層色譜法概述： 薄層色譜法簡稱TLC，是在50年代從經(jīng)典柱色譜法和紙色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種色譜技術(shù)。60年代后，人們對薄層色譜法的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化及擴(kuò)大應(yīng)用等方面進(jìn)行了許多工作，使該方法日趨成熟。 薄層色譜法工作的過程是這樣的： 首先將要分離的混合物點(diǎn)在用固定相均勻涂布的薄板的一端； 然后將薄板的這一端浸入流動相，在流動相浸濕薄板的過程中，樣品隨著流動相被展開，不同的組分隨流動相以不同的速度向前移動，最終保留在薄板上的不同位置，從而達(dá)到分離的目的； 再用適當(dāng)?shù)姆椒▽Σ煌慕M分進(jìn)行檢測，就可以定性或定量的對樣品作出分析。 此時的固定相被稱為載體或吸附劑，而流動相被稱為展開

2、劑，被展開的樣品叫做斑點(diǎn)。薄層色譜的特點(diǎn)： 靈敏度及分辨率高、分離快速、操作方便、同時分離多個樣品、樣品預(yù)處理簡單、設(shè)備簡單。由于這些特點(diǎn)，薄層色譜在實(shí)際工作中的應(yīng)用十分廣泛。 由于通常用薄層色譜分析法進(jìn)行定量分析的過程中，薄層掃描儀是最為重要的，因此對它進(jìn)行略詳?shù)慕榻B。 薄層掃描儀的基本結(jié)構(gòu)及主要功能基本是相同的，每臺儀器都包括光源、分光器、檢測器、數(shù)據(jù)處理及信號輸出幾個部分。 典型的檢測方法是吸收檢測法，其基本測定原理為，用一束長寬可以調(diào)節(jié)的一定波長、一定強(qiáng)度的光照射到薄層斑點(diǎn)上進(jìn)行整個斑點(diǎn)或被斑點(diǎn)反射的光束，根據(jù)光束被斑點(diǎn)吸收后強(qiáng)度的變化來確定組分的含量。 薄層色譜法的優(yōu)點(diǎn)特別適合我國國

3、情，已成為許多實(shí)驗(yàn)室不可缺少的分離手段。該方法在科研、教學(xué)、臨床、生產(chǎn)等各個領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用，分離對象也無所不包。 目前它正向聯(lián)用的方向發(fā)展，如薄層色譜-氣相色-質(zhì)譜聯(lián)用，或都薄層色譜-紅外光譜等的聯(lián)用。醫(yī)藥工業(yè)薄層色譜在醫(yī)藥工業(yè)中有很廣泛的應(yīng)用，特別應(yīng)用在中草藥、中成藥的成分分析和合成藥物分析。臨床醫(yī)學(xué) 在臨床醫(yī)學(xué)中，它主要用于對生物樣品和有毒的物質(zhì)進(jìn)行分析。環(huán)境科學(xué)薄層色譜可以用來進(jìn)行農(nóng)藥及農(nóng)藥殘留分析，或都對有毒金屬、多環(huán)芳烴進(jìn)行檢測。食品化學(xué)食品添加劑的安全性問題已婚經(jīng)越來越多的得到關(guān)注，用薄層色譜對食品添加劑進(jìn)行分析是一種簡單有效的方法。化學(xué)化工薄層色譜在化學(xué)、化工方面也有很多應(yīng)用，例

4、如對高分子材料的助劑、填料等進(jìn)行分析。1.方法原理薄層色譜是一種微量分析的分離過程，它將樣品點(diǎn)在以玻璃板或鋁、塑料等片材為載體的多孔吸附劑薄層的固定相上,利用流動相在特定的展開室中將混合物中的組份推移到不同距離處，在色譜展開整個過程中，樣品的成份受到正反不同的力的作用。(1) 流動相利用毛細(xì)管力帶著樣品穿過固定相。(2) 樣品與固定相的相互作用是指組份在移行過程中由于偶極 - （誘導(dǎo)） - 偶極相互作用，氫鍵和范德華力的作用而產(chǎn)生不同程度的延緩、吸附、分散、離子交換和絡(luò)合等分離機(jī)理。由于樣品組份與流動相和固定相之間的相互作用力程度不同，整個毛細(xì)管流動過程中分離運(yùn)動都在進(jìn)行?；谶@點(diǎn)，TLC系統(tǒng)

5、（流動相和固定相）必須與樣品很好地匹配。用顯色試劑處理，許多組份可在日光或紫外燈光下檢視。色譜可用肉眼或使用光密度計和照相機(jī)記錄或影像系統(tǒng)方法來評價。2. 薄層板2.1手工自制板2.1.1玻璃板的要求:用于制備薄層板的玻璃板要求表面光潔、平整，最好使用厚薄12mm的優(yōu)質(zhì)平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜用于制作薄層板，玻璃板需洗凈至不掛水，晾干，貯存于干燥潔凈處備用。玻璃板反復(fù)使用時，應(yīng)注意經(jīng)常用洗液及堿液清洗，保持玻璃板面的光潔是保證薄層板質(zhì)量的最基本要求2.1.2制作方法:除另有規(guī)定外，將1份吸附劑加適量的水（如1份硅膠G一般加3份水），在研缽中用研杵沿一個方向小心研磨至成均勻的有適當(dāng)粘稠度的膠

6、漿,立即傾入涂布器中,均勻地向前推進(jìn)涂布在玻璃板上;或按照不同涂布器的規(guī)定操作涂布;涂布好的薄層板于室溫下在水平臺上晾干,再在規(guī)定的溫度(一般為105110)下烘約30分鐘活化,貯于干燥器中備用。薄層板的厚度一般為0.250.5mm.。2.2 商品化供應(yīng)的預(yù)制板和高效板2.2.1板的尺寸 20x20cm 10x20cm 20x10cm 10x10cm圖1 不同的板尺寸TLC/HPTLC預(yù)制板有不同的規(guī)格供應(yīng)。常用的尺寸為20 x 20，10 x 20，20 x 10，或10 x 10 cm。使用的規(guī)格取決于TLC或HPTLC的類別和樣品的數(shù)目。2.2.3 TLC/HPTLC板的預(yù)洗及活化一般來

7、說，色譜板應(yīng)用溶劑如氯仿-甲醇(8:2)，甚至用更強(qiáng)的洗脫溶劑的混合物進(jìn)行預(yù)洗。具體操作可通過空白色譜展開來實(shí)現(xiàn)。色譜板預(yù)洗完后,應(yīng)在105°C加熱1小時進(jìn)行干燥，再在室溫下置放至少2小時（需采取保護(hù)措施以防止實(shí)驗(yàn)室空氣中的污染物重新附著在其上面，如放置在空的干燥器中）。3. 樣品點(diǎn)樣31點(diǎn)狀點(diǎn)樣和條帶狀點(diǎn)樣每次點(diǎn)樣前，TLC/HPTLC板應(yīng)在正常光線下和紫外燈下用肉眼檢查薄層的損傷情況和雜質(zhì)，只有無損傷、清潔的TLC/HPTLC板方可使用。樣品可進(jìn)行點(diǎn)狀或條帶狀點(diǎn)樣。要想獲得最佳的薄層分辨率，必須保證移行方向中的起點(diǎn)要小，常規(guī)的TLC薄層點(diǎn)狀點(diǎn)樣每次點(diǎn)0.5至5微升，相比之下，HP

8、TLC薄層最大點(diǎn)樣量為1微升。點(diǎn)樣量較大的樣品可使用自動化裝置點(diǎn)樣，噴霧成條帶狀是一種可以點(diǎn)樣量大而同時又能促成最有效分離的點(diǎn)樣方法。在常規(guī)操作過程中，人工點(diǎn)樣一般使用微量毛細(xì)管（0.5/1/2/3和5 µl），點(diǎn)樣時毛細(xì)管必須完全充滿和完全排空，要以垂直方向小心接觸TLC/HPTLC板面，不要損傷薄層，受損的薄層會導(dǎo)致溶劑不規(guī)律地流動而在色譜上產(chǎn)生失真的TLC譜帶。人工點(diǎn)樣建議使用Nanomat。它點(diǎn)樣位置精確并安全，使薄層免于受損。用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)干燥Nanomat也可用作單個量的多次點(diǎn)樣。樣品體積大于5 µl，通常用如Linomat或Automatic TLC Sampl

9、er III的方法用氮?dú)鈬婌F成窄條。若（就是）要求點(diǎn)狀樣品點(diǎn)樣，Linomat 和Automatic TLC Sampler III應(yīng)將條長度設(shè)定在1至2 mm。3.2 樣品點(diǎn)樣位置起點(diǎn)的最佳位置如圖2和3所示。起點(diǎn)下緣的最小距離b取決于溶劑量。兩個起點(diǎn)之間的距離c必須令平行移行的主成份不會相互觸及。點(diǎn)狀點(diǎn)樣時原點(diǎn)的直徑應(yīng)小于或等于3mm（高效板原點(diǎn)的直徑應(yīng)更?。?條帶的長度d由點(diǎn)樣樣品體積或樣品的種類和相對于板的尺寸點(diǎn)樣的數(shù)目來決定。到板側(cè)邊的距離a必須足夠大以避免分離區(qū)失真變形（見圖2和3）。圖2： 斑狀樣品點(diǎn)樣的一般點(diǎn)樣位置（a = 20mm, b = 10mm, c =兩起點(diǎn)之間的距離

10、。）圖3： 條狀樣品點(diǎn)樣的一般點(diǎn)樣位置（a = 20mm, b = 10mm, c = 兩起點(diǎn)之間的距離，d = 條的長度）4.層析4.1展開室 4.1.1直立式雙槽展開室 具有節(jié)省溶劑、便于預(yù)平衡、可控制展開箱內(nèi)的濕度等優(yōu)點(diǎn)。4.1.2 水平展開室 可以從薄層板的兩側(cè)向中間水平地展開，這樣可使一塊薄層板所承受的樣品個數(shù)比常規(guī)上行展開的薄層板增加一倍。 4.1.3 自動展開室(AMD) 可使用五種溶劑對同一薄層進(jìn)行多次展開，自動控制預(yù)飽和、展開方式、展開距離和干燥條件，分離效率比傳統(tǒng)方式提高三倍（可在80mm之內(nèi)分離40種成分），符合GLP/GMP要求。4.2. 溶劑使用的溶劑必須是“分析純”

11、或“色譜純”，溶劑組成采用體積量比（如正丁醇 - 冰乙酸 - 水 = 4：1：1，V/V/V），或者絕對量（如18ml甲苯 + 2 ml甲醇）。其總量應(yīng)足以使TLC/HPTLC板的浸入深度約為5mm。展開劑要求新鮮配制，不要多次反復(fù)使用,如需分層，則按要求放置分層后取需要的一相（上層或下層），備用。在雙槽展開室中，對每種類型和規(guī)格和層析板，每槽通常注入的溶劑數(shù)量如表3。表3：板的規(guī)格板的尺寸（寬×高）溶劑量預(yù)制板20×20cm20×10cm10×10cm25ml15ml8ml高效板20×10cm10×10cm10ml5ml4.3展開室

12、狀況溶劑的蒸氣相在展開箱中也參與色譜展開而形成三維的層析過程，展開箱的氣體空間在層析過程中起著重要的作用。以下有四種常見的情況（A、B、C、和D）。4.3.1方法A（展開室不飽和）方法A的特點(diǎn)：l 不呈飽和狀態(tài)l 無濾紙l 只有一個槽內(nèi)有溶劑 l 每個展開室只有一塊TLC/HPTLC板l 薄層向里（如圖4）圖4：有溶劑和TLC/HPTLC板的雙槽展開室 圖5： 有溶劑和TLC/HPTLC板的雙槽展開室方法A的操作程序：TLC/HPTLC板在倒入相應(yīng)量的展開劑后立即放至展開室中，薄導(dǎo)層板應(yīng)垂直地豎放在溶劑中，薄層向里，展開室蓋上后層析立即展開。對某些分離過程，在產(chǎn)品專用方法中有明確的說明時，另一

13、槽可盛放一些調(diào)節(jié)液體（乙酸，濃氨水等）。4.3.2方法B（部分飽和，無濾紙）方法B的特點(diǎn)：l 不完全飽和l 無濾紙l 在兩個槽內(nèi)盛放溶劑 l 每個展開室只有一塊TLC/HPTLC板l 薄層向里（如圖5）方法B的操作程序：將展開劑倒入至兩個槽內(nèi)，蓋上蓋子，置放15分鐘后，將蓋子移向一邊，TLC/HPTLC板涂層向時地豎放入溶劑中，蓋上展開室，讓TLC/HPTLC板開始展開。對某些分離過程，在產(chǎn)品專門方法中有明確的說明時，另一槽可放置調(diào)節(jié)液體（乙酸，濃氨水等）。4.3.3方法C（展開室飽和，有濾紙）方法C的特點(diǎn)：l 用放入濾紙使飽和（至少30分鐘）l 在兩個槽內(nèi)盛放溶劑 l 每個展開室只有一塊TL

14、C/HPTLC板l 薄層面向?yàn)V紙（如圖6）l圖6： 有溶劑、濾紙和TLC/HPTLC板的雙槽展開室 圖7：有溶劑， 濾紙和TLC/HPTLC板的雙槽展開室方法C的程序：將展開劑倒入至兩個槽內(nèi)，將與展開室相同型號的濾紙（如CAMAG序號022.5243）用規(guī)定量的溶劑濕潤后貼在玻璃展開室正面，蓋上蓋子，放置30分鐘（標(biāo)準(zhǔn)時間），然后將蓋子移向一邊, TLC/HPTLC板薄層面向著濾紙豎放入溶劑中，蓋好展開室讓板進(jìn)行層析。對某些分離過程，在產(chǎn)品專用方法中有明確說明時，另一槽可置放調(diào)節(jié)液體（乙酸，濃氨水等）。4.3.4方法D（展開室飽和，薄層預(yù)穩(wěn)定）方法D的特點(diǎn)：l 薄層預(yù)穩(wěn)定，放置濾紙使展開室飽和

15、l 溶劑量增加一倍l 每個展開室只有一塊TLC/HPTLC板l 薄層面向?yàn)V紙(如圖7)方法D的程序：將展開劑倒入至一個槽內(nèi)，將與展開室相同型號的濾紙（如CAMAG序號022.5243）用規(guī)定量的溶劑濕潤后貼在玻璃展開室正面，另一槽空著,TLC/HPTLC板薄層面向?yàn)V紙地置放在空槽中，除非產(chǎn)品專用方法另有規(guī)定，15分鐘（標(biāo)準(zhǔn)時間）后，穩(wěn)穩(wěn)地傾斜使足夠量的溶劑移至有TLC/HPTLC板的槽中（圖8，只有用20x20和20x10cm的展開室才能這樣做；若為10x10cm的展開室，溶劑需從外部用移液管或類似器材實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移）。圖8： 傾斜的雙槽展開室圖9：有溶劑，濾紙和經(jīng)預(yù)穩(wěn)定TLC/HPTLC板的雙槽展

16、開室，層析開始4.4參數(shù)4.4.1溫度 薄層色譜分析一般在室溫中進(jìn)行。對這過程，溫度在20 - 25ºC算不上是臨界值。 在這過程，中無短期的溫度波動才是更為重要（避免抽風(fēng)）。展開室應(yīng)放置在無直射陽光和不通風(fēng)處。溫度波動對層析結(jié)果不利，故將展開室放在靠近窗口或熱源處是欠妥的。4.4.2空氣濕度 空氣濕度極高或極低主要影響有非極性溶劑 體系的無機(jī)涂層。相對空氣濕度高于70-80%會影響薄層鈍化，使Rf值增加。樣品點(diǎn)樣后，TLC薄層可置放在適當(dāng)?shù)牧蛩岷退幕旌衔锏纳厦娌簧儆?0分鐘，調(diào)整至指定的相對濕度。有關(guān)這方面的更多資料可從HPTLC Vario系統(tǒng)的操作手冊中獲得。另一方面，在樣品

17、點(diǎn)樣前，TLC/HPTLC板可在105ºC再活化30分鐘進(jìn)行干燥。然后薄層必須用一塊玻璃板保護(hù)起來，只有起點(diǎn)區(qū)露出以便于樣品點(diǎn)樣。若空氣太干燥，可在干燥器中將TLC/HPTLC薄層置于水的上方以達(dá)到所要求的狀況。確定合適的層析條件的有效方法（用規(guī)定的濕度，溶劑蒸汽或溶劑調(diào)整使薄層達(dá)到要求的狀況）是使用HPTLC Vario體系?？刂葡鄬穸扔玫牧蛩崛芤合卤恚?相對濕度所需硫酸濃度（V/V）硫酸（ml） + 水（ml）32%47%42%58%65%72%88%68.0 10050.0 10057.0 10039.5 10034.0 10027.5 10010.8 1005 層析后衍生作

18、用若層析板分離的物質(zhì)肉眼看不見又不能被紫外光活化，需加試劑 方能顯色或發(fā)射熒光者，則需使用適當(dāng)?shù)脑噭┙n或均勻噴灑于薄層板面上，直接觀察或加熱顯色后觀察。加熱顯色者須注意加熱時間和溫度，尤其含羧甲基纖維素鈉的薄層板，加熱溫度過高或時間過長，容易引起板面的焦化，如用硫酸等顯色劑更易造成板面的炭化而影響顯色效果。有的成分加試劑后，如揮發(fā)油成分經(jīng)香草醛硫酸顯色，加熱溫度和時間長短不同或放置時間不同均可能使斑點(diǎn)的顯色有所改變。有的品種可熏以試劑或試液的蒸氣（如碘蒸氣、氨蒸氣）顯色。5.1 噴霧試劑溶液以氣溶膠的形式均勻地噴灑在薄層上。電動的TLC噴霧器用最少的試劑溶液產(chǎn)生幾近理想的氣溶膠。5.2 浸漬

19、使用適當(dāng)?shù)脑O(shè)備如色譜浸漬設(shè)備III（Chromotogram Immersion Device III）,TLC/HPTLC板浸漬具有重現(xiàn)的結(jié)果。通過設(shè)定垂直方向速度（進(jìn)入，抽出）和規(guī)定停留時間，浸漬條件可被精確地標(biāo)準(zhǔn)化。6檢測6.1 定性分析（同一性試驗(yàn)）在相同的狀態(tài)下（相同類型的TLC/HPTLC板、相同的溶劑體系組成、相同的組份點(diǎn)樣體積和其它TLC設(shè)備系統(tǒng)），樣品成份的Rf值、顏色、與專用的或特殊基因衍生化試劑的反應(yīng)和參考物或標(biāo)準(zhǔn)物在同一TLC/HPTLC板同時層析所得的結(jié)果相符時，未知物就可認(rèn)為是存在而被鑒別出來。分析的結(jié)果可以采用照片，照片復(fù)制品，影像記錄（如：CAMAG 薄層色譜數(shù)

20、碼成像系統(tǒng)）或TLC掃描儀方法記錄下來。當(dāng)混合物物質(zhì)被測試時，參考標(biāo)準(zhǔn)物中單個餾份的Rf值可能會與純物質(zhì)的Rf有所不同，但測試物理學(xué)餾份和標(biāo)準(zhǔn)化餾份的hRf值必須相符，其DhRf在 ± 3之內(nèi)。為增加測試物與參照物同一性的可信度，采用TLC掃描儀即時記錄其紫外光和可見光圖譜并進(jìn)行比較。多波長測定將測試物和參照物的圖譜情況和hRf值相關(guān)聯(lián)供進(jìn)一步鑒別。6.2 定量分析（儀器：CAMAG scanner-3；具體操作請參考操作手冊或教學(xué)軟件）定量分析采用光密度掃描法來評價。用winCATS 軟件控制薄層色譜掃描儀以及進(jìn)行掃描結(jié)果的數(shù)據(jù)處理，計算出各成分的峰高和峰面積及其平均值和離散系數(shù)（

21、CV）或置信窨（CI）。通過單水平或多水平校準(zhǔn)計算出結(jié)果。最后以報告形式將所有掃描參數(shù)、原始數(shù)據(jù)及圖象結(jié)果保存及打印。掃描狹縫寬度根據(jù)被測成份斑點(diǎn)的大小來調(diào)整（1）點(diǎn)狀點(diǎn)樣得到TLC中各成份，掃描其全寬度；（2）條帶狀點(diǎn)樣，通常可以掃描其色譜帶同心部份的50 - 70%。物質(zhì)的掃描波長可以通過光譜掃描來決定。TLC/HPTLC板空白部位的漫射反射光用光電倍增器（PM）來收集并定其值為10% （=0% 吸收）。掃描吸光物質(zhì)時，其吸收隨著物質(zhì)的量而增加。對于具有熒光或可轉(zhuǎn)變成具熒光性衍生物的物質(zhì)的測定。光源一般使用發(fā)射光譜在254 - 578 nm之間的高壓汞蒸汽燈，在254，302，313，36

22、6，405，436，546和578nm處有特別高強(qiáng)度的譜線。吸收了選擇性激發(fā)波長后TLC中各成份發(fā)射出的較長波長熒光由光倍增器記錄下來，使用銳截止濾波器或窄帶濾波器將會阻止TLC/HPTLC板反射的激發(fā)波長光到達(dá)光電倍增器。和吸附測定一樣，熒光強(qiáng)度作為板上定位的函數(shù)作圖得模擬曲線（熒光定位曲線）（圖10）。TLC掃描儀的測定原理在有關(guān)的設(shè)備文獻(xiàn)中有報導(dǎo)。熒光測定比吸收測定優(yōu)越在于如下幾點(diǎn)：（1）檢出極限低1 - 3個數(shù)量級；（2）在較寬的濃度范圍內(nèi)校準(zhǔn)曲線呈線性；（3）選擇性較高。圖10： a) 有好幾個成份的TLC/HPTLC板 b)TLC/HPTLC板的模擬曲線在測定極限以上所有的檢測成份

23、可被量化。在檢出極限以上而在測定極限以下的檢測成份會給出檢出和測定極限的平均值（作為結(jié)果）。7 標(biāo)準(zhǔn)條件下述的兩個標(biāo)準(zhǔn)條件對不同的板規(guī)格適用。在產(chǎn)品專用試驗(yàn)方法中，應(yīng)參考這一普通的分析方法。標(biāo)準(zhǔn)條件或?qū)?biāo)準(zhǔn)條件的偏差必須限定。71 HPTLC板10 x 10和20 x 10 cm HPTLC預(yù)涂板的標(biāo)準(zhǔn)條件總結(jié)如下以便于參考。(ommisioned)薄層商品化生產(chǎn)的HPTLC板規(guī)格10 x 10和20 x 10 cm板；由樣品數(shù)目決定點(diǎn)樣用毛細(xì)管移液管或Nanomat進(jìn)行斑狀點(diǎn)樣或用自動點(diǎn)樣器作條狀點(diǎn)樣數(shù)量一般，斑狀點(diǎn)樣用20 nl - 1 ml, 窄條點(diǎn)樣用2 - 20ml定位起點(diǎn)在距板下緣

24、10 mm處溶劑數(shù)量限定采用體積量或絕對量。一般，對10 x 10 cm雙槽展開室的一個槽加5ml,對20 x 10 cm雙槽展開室的一個槽加10ml分離距離5 cm展開室對10 x 10或20 x 10 cm板用雙槽展開室下同，略72 TLC板20 x 20和10 x 20 cm TLC預(yù)涂板的標(biāo)準(zhǔn)條件總結(jié)如下以便于參考。薄層商品化生產(chǎn)的TLC板規(guī)格20 x 20cm， 20 x 10cm或10 x 20 cm（標(biāo)準(zhǔn)的）板；由點(diǎn)樣樣品數(shù)目決定點(diǎn)樣斑狀點(diǎn)樣用標(biāo)準(zhǔn)的用后即棄的毛細(xì)管移液管，條狀點(diǎn)樣用自動點(diǎn)樣器數(shù)量一般，斑狀點(diǎn)樣用1 ml - 5 ml, 條狀點(diǎn)樣用2 - 20ml定位起點(diǎn)在距板下緣15 mm處溶劑數(shù)量限定采用體積量或絕對量。一般，