青霉素生產工藝

1、生物制藥課程論文題 目 青霉素的生產工藝 系 部 食品科學與工程學院 青霉素生產工藝摘要：青霉素是一種重要的抗生素，在目前的制藥工業(yè)中占有舉足輕重的地位，生產規(guī)模非常大。通過數(shù)十年的完善，青霉素針劑和口服青霉素已能分別治療肺炎、肺結核、腦膜炎、心內膜炎、白喉、炭疽等病，增強了人類治療傳染性疾病的能力。研究和優(yōu)化其生產工藝對人類健康有重要意義。關鍵詞;青霉素；生產工藝青霉素概述青霉素是抗生素的一種，是指從青霉菌培養(yǎng)液中提制的分子中含有青霉烷、能破壞細菌的細胞壁并在細菌細胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素，是第一種能夠治療人類疾病的抗生素。青霉素類抗生素是-內酰胺類中一大類抗生素的總稱。但它不能耐受

2、耐藥菌株(如耐藥金葡)所產生的酶，易被其破壞，且其抗菌譜較窄，主要對革蘭氏陽性菌有效。最初青霉素的生產菌是音符型青霉菌，生產能力只有幾十個單位，不能滿足工業(yè)需要。隨后找到了適合于深層培養(yǎng)的橄欖型青霉菌，即產黃青霉（P. chrosogenum），生產能力為100U/ml。經過X、紫外線誘變，生產能力達到10001500U/ml。隨后經過誘變，得到不產生色素的變種，目前生產能力可達6600070000U/ml。青霉素是抗生素工業(yè)的首要產品。青霉素的發(fā)酵工藝過程青霉素生產流程：     發(fā)酵工藝過程（1）生產孢子的制備將砂土保藏的孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組

3、成的培養(yǎng)基進行斜面培養(yǎng)，經傳代活化。最適生長溫度在2526 ，培養(yǎng)68天，得單菌落，再傳斜面，培養(yǎng)7天，得斜面孢子。移植到優(yōu)質小米或大米固體培養(yǎng)基上，生長7天，25，制得小米孢子。每批孢子必需進行嚴格搖瓶試驗，測定效價及雜菌情況。（2）種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)工藝種子培養(yǎng)要求產生大量健壯的菌絲體，因此，培養(yǎng)基應加入比較豐富的易利用的碳源和有機氮源。青霉素采用三級發(fā)酵一級種子發(fā)酵：發(fā)芽罐.小罐，接入小米孢子后，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基成分：葡萄糖，蔗糖，乳糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等。通無菌空氣，空氣流量1：3（體積比）；充分攪拌300350r/min；4050小時；pH自然，溫度27

4、77;1。二級發(fā)酵罐：繁殖罐.大量繁殖。玉米漿、葡萄糖等。1：11.5；250280r/min；pH自然，25±1；014h。三級發(fā)酵罐：生產罐?；ㄉ灧郏ǜ邷兀?，麩質粉、玉米漿、葡萄糖，尿素，硫酸銨，硫酸鈉、硫代硫酸鈉，磷酸二氫鈉，苯乙酰胺及消泡劑，CaCO3等。接種量為1215%。青霉素的發(fā)酵對溶氧要求極高，通氣量偏大，通氣比控制0.71.8；150200r/min；要求高功率攪拌，100 m3的發(fā)酵罐攪拌功率在200300 Kw，罐壓控制0.040.05 MPa，于2526 下培養(yǎng)，發(fā)酵周期在200h左右。前60h，pH5.76.3，后6.36.6；前60h為26，以后24。發(fā)

5、酵過程控制反復分批式發(fā)酵，100m3發(fā)酵罐，裝料80m3，帶放610次，間隔24h。帶放量10，發(fā)酵時間204h。發(fā)酵過程需連續(xù)流加補入葡萄糖、硫酸銨以及前體物質苯乙酸鹽，補糖率是最關鍵的控制指標，不同時期分段控制。在青霉素的生產中，讓培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)物只夠維持青霉菌在前40h生長，而在40h后，靠低速連續(xù)補加葡萄糖和氮源等，使菌半饑餓，延長青霉素的合成期，大大提高了產量。所需營養(yǎng)物限量的補加常用來控制營養(yǎng)缺陷型突變菌種，使代謝產物積累到最大。（1） 培養(yǎng)基青霉素發(fā)酵中采用補料分批操作法，對葡萄糖、銨、苯乙酸進行緩慢流加，維持一定的最適濃度。葡萄糖的流加，波動范圍較窄，濃度過低使抗生素合成速

6、度減慢或停止，過高則導致呼吸活性下降，甚至引起自溶，葡萄糖濃度調節(jié)是根據(jù)pH，溶氧或CO2釋放率予以調節(jié)。碳源的選擇：生產菌能利用多種碳源，乳糖，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖，淀粉和天然油脂。經濟核算問題，生產成本中碳源占12以上，對工藝影響很大；糖與6-APA結合形成糖基-6-APA，影響青霉素的產量。葡萄糖、乳糖結合能力強，而且隨時間延長而增加。通常采用葡萄糖和乳糖。發(fā)酵初期，利用快效的葡萄糖進行菌絲生長。當葡萄糖耗竭后，利用緩效的乳糖，使pH穩(wěn)定，分泌青霉素。可根據(jù)形態(tài)變化，滴加葡萄糖，取代乳糖。目前普遍采用淀粉的酶水解產物，葡萄糖化液流加。降低成本。氮源：玉米漿是最好的，是玉米淀粉生

7、產時的副產品，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。玉米漿質量不穩(wěn)定，可用花生餅粉或棉籽餅粉取代。補加無機氮源。無機鹽：硫、磷、鎂、鉀等。鐵有毒，控制在30µg/ml以下。流加控制：補糖，根據(jù)殘?zhí)恰H、尾氣中CO2和O2含量。殘?zhí)窃?.6左右，pH開始升高時加糖。補氮：流加酸酸銨、氨水、尿素，控制氨基氮0.05%。添加前體：合成階段，苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可為青霉素側鏈的前體，直接摻入青霉素分子中。也具有刺激青霉素合成作用。但濃度大于0.19時對細胞和合成有毒性。還能被細胞氧化。策略是流加低濃度前體，一次加入量低于0.1%，保持供應速率略大于生物合成的

8、需要。（2）溫度一生長適宜溫度30，分泌青霉素溫度20。但20青霉素破壞少，周期很長。生產中采用變溫控制，不同階段不同溫度。前期控制2526左右，后期降溫控制23。過高則會降低發(fā)酵產率，增加葡萄糖的維持消耗，降低葡萄糖至青霉素的轉化得率。有的發(fā)酵過程在菌絲生長階段采用較高的溫度，以縮短生長時間，生產階段適當降低溫度，以利于青霉素合成。（3）pH合成的適宜pH6.46.6左右，避免超過7.0，青霉素在堿性條件下不穩(wěn)定，易水解。緩沖能力弱的培養(yǎng)基，pH降低，意味著加糖率過高造成酸性中間產物積累。pH上升，加糖率過低不足以中和蛋白產生的氨或其他生理堿性物質。前期pH控制在5.76.3，中后期pH控制

9、6.36.6，通過補加氨水進行調節(jié)。pH較低時，加入CaCO3、通氨調節(jié)或提高通氣量。pH上升時，加糖或天然油脂。一般直接加酸或堿自動控制，流加葡萄糖控制。（4）溶氧溶氧30飽和度，產率急劇下降，低于10，則造成不可逆的損害。所以不能低于30飽和溶氧濃度。通氣比一般為1：0.8VVM。溶氧過高，菌絲生長不良或加糖率過低，呼吸強度下降，影響生產能力的發(fā)揮。適宜的攪拌速度，保證氣液混合，提高溶氧，根據(jù)各階段的生長和耗氧量不同，對攪拌轉速調整。（5）菌絲生長速度與形態(tài)、濃度對于每個有固定通氣和攪拌條件的發(fā)酵罐內進行的特定好氧過程，都有一個使氧傳遞速率（OTR）和氧消耗率（OUR）在某一溶氧水平上達到

10、平衡的臨界菌絲濃，超過此濃度，OUROTR，溶氧水平下降，發(fā)酵產率下降。在發(fā)酵穩(wěn)定期，濕菌濃可達1520%，絲狀菌干重約3%，球狀菌干重在5%左右。另外，因補入物料較多，在發(fā)酵中后期一般每天帶放一次，每次放掉總發(fā)酵液的10%左右。有絲狀生長和球狀生長兩種。前者由于所有菌絲體都能充分和發(fā)酵液中的基質及氧接觸，比生產率高，發(fā)酵粘度低，氣/液兩相中氧的傳遞率提高，允許更多菌絲生長。球狀菌絲形態(tài)的控制，與碳、氮源的流加狀況，攪拌的剪切強度及稀釋度相關。（6）消沫發(fā)酵過程泡沫較多，需補入消沫劑。天然油脂：玉米油；化學消沫劑：泡敵。少量多次。不適在前期多加入，影響呼吸代謝。青霉素的發(fā)酵過程控制十分精細，一

11、般2 h取樣一次，測定發(fā)酵液的pH、菌濃、殘?zhí)恰埖?、苯乙酸濃度、青霉素效價等指標，同時取樣做無菌檢查，發(fā)現(xiàn)染菌立即結束發(fā)酵，視情況放過濾提取，因為染菌后pH值波動大，青霉素在幾個小時內就會被全部破壞。青霉素的提煉工藝過程青霉素提純工藝流程簡圖： 青霉素不穩(wěn)定，發(fā)酵液預處理、提取和精制過程要條件溫和、快速，防止降解。1.預處理發(fā)酵液結束后，目標產物存在于發(fā)酵液中，而且濃度較低，如抗生素只有1030Kg/m3，含有大量雜質，它們影響后續(xù)工藝的有效提取，因此必須對其進行的預處理，目的在于濃縮目的產物，去除大部分雜質，改變發(fā)酵液的流變學特征，利于后續(xù)的分離純化過程。是進行分離純化的一個工序

12、。2.過濾發(fā)酵液在萃取之前需預處理，發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白，然后經真空轉鼓過濾或板框過濾，除掉菌絲體及部分蛋白。青霉素易降解，發(fā)酵液及濾液應冷至10 以下，過濾收率一般90%左右。（1）菌絲體粗長10µm，采用鼓式真空過濾機過濾，濾渣形成緊密餅狀，容易從濾布上刮下。濾液pH6.27-7.2，蛋白質含量0.05-0.2%。需要進一步除去蛋白質。（2）改善過濾和除去蛋白質的措施：硫酸調節(jié)pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶PPB，0.7%硅藻土為助濾劑。再通過板框式過濾機。濾液澄清透明，進行萃取。3.萃取青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉素游離酸易溶于有機溶劑，而青霉素鹽易

13、溶于水。利用這一性質，在酸性條件下青霉素轉入有機溶媒中，調節(jié)pH，再轉入中性水相，反復幾次萃取，即可提純濃縮。選擇對青霉素分配系數(shù)高的有機溶劑。工業(yè)上通常用醋酸丁酯和戊酯。萃取23次。從發(fā)酵液萃取到乙酸丁酯時，pH選擇1.8-2.0，從乙酸丁酯反萃到水相時，pH選擇6.8-7.4。發(fā)酵濾液與乙酸丁酯的體積比為1.5-2.1，即一次濃縮倍數(shù)為1.5-2.1。為了避免pH波動，采用硫酸鹽、碳酸鹽緩沖液進行反萃。發(fā)酵液與溶劑比例為34。幾次萃取后，濃縮10倍，濃度幾乎達到結晶要求。萃取總收率在85左右。所得濾液多采用二次萃取，用10%硫酸調pH2.03.0，加入醋酸丁酯，用量為濾液體積的三分之一，反

14、萃取時常用碳酸氫鈉溶液調pH7.08.0。在一次丁酯萃取時，由于濾液含有大量蛋白，通常加入破乳劑防止乳化。第一次萃取，存在蛋白質，加0.05-0.1%乳化劑PPB。萃取條件：為減少青霉素降解，整個萃取過程應在低溫下進行（10 以下）。萃取罐冷凍鹽水冷卻。4.脫色萃取液中添加活性炭，除去色素、熱源，過濾，除去活性炭。5.結晶萃取液一般通過結晶提純。青霉素鉀鹽在醋酸丁酯中溶解度很小，在二次丁酯萃取液中加入醋酸鉀-乙醇溶液，青霉素鉀鹽就結晶析出。然后采用重結晶方法，進一步提高純度，將鉀鹽溶于KOH溶液，調pH至中性，加無水丁醇，在真空條件下，共沸蒸餾結晶得純品。直接結晶：在2次乙酸丁酯萃取液中加醋酸鈉乙醇溶液反應，得到結晶鈉鹽。加醋酸鉀乙醇溶液，得到青霉素鉀鹽。共沸蒸餾結晶：萃取液，再用0.5 M NaOH萃取，pH6.4-4.8下得到鈉鹽水濃縮液。加2.5倍體積丁醇，1626，0.67-1.3KPa下蒸餾。水和丁醇形成共沸物而蒸出。鈉鹽結晶析出。結晶經過洗滌、干燥后，得到青霉素產品。參考文獻【1】陳陽，王錦玲，黃維國，等.甲磺酸去鐵胺對抗慶大霉素耳毒性的實驗研究.聽力學及言語疾病雜志，1999，7:138-139.【2】孫愛華，林順漲，葉青，等.缺鐵條件下青霉素耳毒性作用的實驗觀察.聽力學及言語疾病雜志，2001，9（2）:74-76.【