第07章蛋白質(zhì)的分離純化

1、 chapter7 protein的分離、純化和表征的分離、純化和表征一、一、protein的酸堿性質(zhì)的酸堿性質(zhì)（一）（一）protein的兩性解離的兩性解離 1、主鏈上兩個末端、主鏈上兩個末端nh2和和cooh的解離的解離 2、側(cè)鏈上基團(tuán)的解離、側(cè)鏈上基團(tuán)的解離（二）（二）protein的等電點（的等電點（pi） 1、定義：使蛋白質(zhì)分子所帶正電荷與負(fù)電荷相等，即凈電、定義：使蛋白質(zhì)分子所帶正電荷與負(fù)電荷相等，即凈電荷為零時的溶液的荷為零時的溶液的ph值稱為值稱為pi(isoelectric point). 2、當(dāng)、當(dāng)ph值值 pi 時，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷時，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷 當(dāng)當(dāng)ph值值pi 時，

2、蛋白質(zhì)帶正電荷時，蛋白質(zhì)帶正電荷 當(dāng)當(dāng)ph值值=pi 時，蛋白質(zhì)帶凈電荷為零時，蛋白質(zhì)帶凈電荷為零 3、等電點沉淀法用于分離純化蛋白質(zhì)、等電點沉淀法用于分離純化蛋白質(zhì)電泳分離電泳分離正極移動正極移動負(fù)極移動負(fù)極移動不移動不移動電泳二、二、protein的高分子性質(zhì)的高分子性質(zhì)1、穩(wěn)定性因素（、穩(wěn)定性因素（299頁）：頁）：（1）膠體性質(zhì)（）膠體性質(zhì)（丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運動）丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運動）； （2）形）形 成水化膜；（成水化膜；（3）雙電離層）雙電離層2、通透性：不易透過半透膜，可用透析的方法將蛋白質(zhì)分子與其它、通透性：不易透過半透膜，可用透析的方法將蛋白質(zhì)分子與其它 小分子物質(zhì)分離，純化

3、蛋白質(zhì)。小分子物質(zhì)分離，純化蛋白質(zhì)。3、沉降系數(shù)（、沉降系數(shù)（s）：蛋白質(zhì)在一定的溶劑中，經(jīng)超速離心沉降，單）：蛋白質(zhì)在一定的溶劑中，經(jīng)超速離心沉降，單 位力場中的沉降速度即該蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)位力場中的沉降速度即該蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)，它表示沉，它表示沉 降分子的大小特性降分子的大小特性 。 三、三、protein的變性與復(fù)性的變性與復(fù)性 1、定義：蛋白質(zhì)在一定的理化因素的影響下，三維構(gòu)象破壞，理化、定義：蛋白質(zhì)在一定的理化因素的影響下，三維構(gòu)象破壞，理化性質(zhì)發(fā)生改變和生物學(xué)活性喪失，叫變性作用（性質(zhì)發(fā)生改變和生物學(xué)活性喪失，叫變性作用（denaturation)。其本質(zhì)是。其本質(zhì)是高級結(jié)構(gòu)破壞、

4、一級結(jié)構(gòu)不變。高級結(jié)構(gòu)破壞、一級結(jié)構(gòu)不變。 蛋白質(zhì)的復(fù)性：消除理化因素的影響，生物活性恢復(fù)或部分恢復(fù)。蛋白質(zhì)的復(fù)性：消除理化因素的影響，生物活性恢復(fù)或部分恢復(fù)。 加熱凝固變性不可逆。加熱凝固變性不可逆。 2、意義：生產(chǎn)和保存蛋白制品；消毒；提純等應(yīng)用。、意義：生產(chǎn)和保存蛋白制品；消毒；提純等應(yīng)用。四、四、protein的沉淀（的沉淀（precipitation) 沉淀蛋白質(zhì)的方法有沉淀蛋白質(zhì)的方法有（一）鹽溶鹽析：中式鹽，如硫酸銨，（一）鹽溶鹽析：中式鹽，如硫酸銨，（降低蛋白質(zhì)與水的親和力 ）；（二）有機(jī)溶劑沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（二）有機(jī)溶劑沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（破壞蛋白質(zhì)膠粒上的

5、水化層 ）；（三）重金屬鹽沉淀法：（三）重金屬鹽沉淀法：產(chǎn)生重金屬蛋白鹽沉淀； （四）生物堿試劑和某些酸類沉淀法：鞣酸、苦味酸、硝酸等（四）生物堿試劑和某些酸類沉淀法：鞣酸、苦味酸、硝酸等（五）加熱變性沉淀法（五）加熱變性沉淀法五、五、protein的顏色反應(yīng)的顏色反應(yīng) （一）茚三酮反應(yīng)：在（一）茚三酮反應(yīng)：在ph57的溶液中，與茚三酮共熱可產(chǎn)生藍(lán)紫色物的溶液中，與茚三酮共熱可產(chǎn)生藍(lán)紫色物質(zhì)，用于蛋白質(zhì)的定性和定量。質(zhì)，用于蛋白質(zhì)的定性和定量。 （二）雙縮脲反應(yīng)：與雙縮脲試劑（即堿性銅溶液）反應(yīng)生成紫紅色絡(luò)（二）雙縮脲反應(yīng)：與雙縮脲試劑（即堿性銅溶液）反應(yīng)生成紫紅色絡(luò)合物，只與兩個以上肽鍵化合

6、物的特征反應(yīng)?？捎糜诘鞍踪|(zhì)定性、定量或合物，只與兩個以上肽鍵化合物的特征反應(yīng)?？捎糜诘鞍踪|(zhì)定性、定量或蛋白質(zhì)水解程度的測定。蛋白質(zhì)水解程度的測定。 （三）酚試劑反應(yīng)：與酚試劑（磷鉬酸（三）酚試劑反應(yīng)：與酚試劑（磷鉬酸磷鎢酸化合物）作用生成藍(lán)磷鎢酸化合物）作用生成藍(lán)色物質(zhì)，再用比色法定性和定量，其靈敏度比雙縮脲反應(yīng)高色物質(zhì)，再用比色法定性和定量，其靈敏度比雙縮脲反應(yīng)高100倍。倍。六、六、protein吸收光譜的特點吸收光譜的特點 phe、tyr、trp 具有吸收紫外光的能力，最大的吸收峰為具有吸收紫外光的能力，最大的吸收峰為280nm處，處，此外，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵可引起此外，蛋白質(zhì)分子中的肽

7、鍵可引起200220nm的最大光吸收，可用于蛋的最大光吸收，可用于蛋白質(zhì)的定性和定量。白質(zhì)的定性和定量。七、七、protein分子的免疫學(xué)特性分子的免疫學(xué)特性 免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能八、八、 proteinprotein的分離純化及鑒定的分離純化及鑒定（一）（一）protein的提取的提?。?00頁）頁） 1、選材：、選材： 2、破碎：、破碎：常用的方法有研磨法、超聲波法、凍融法和酶解法等機(jī)械破碎法。 3、提?。骸⑻崛。海ǘǘ﹑rotein的分離純化的分離純化 1、鹽析法：、鹽析法：中性鹽分級沉淀法，常用的鹽為硫酸銨。不同的蛋白質(zhì)由于所帶的電荷和水化程度不同，鹽析時

8、所需的鹽的濃度也不相同，因而可以將不同的蛋白質(zhì)加以分離。 2、等電點沉淀法：、等電點沉淀法：凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。該法適用于在等電點ph穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。 3、有機(jī)溶劑沉淀法：、有機(jī)溶劑沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低溫），破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而沉淀。 4、凝膠過濾（、凝膠過濾（303頁）（頁）（凝膠層析凝膠層析）(gel filtration chromatography):又又叫分子篩層析，常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖叫分子篩層析，常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖(sephadex)、聚丙烯酰胺凝膠、聚丙烯酰胺凝膠(bio-gel p)和瓊脂糖凝膠和

9、瓊脂糖凝膠(bio-gel a)等。常用于大分子物質(zhì)的分離純化，等。常用于大分子物質(zhì)的分離純化，以及蛋白質(zhì)樣品的脫鹽和蛋白質(zhì)分子量的測定等。以及蛋白質(zhì)樣品的脫鹽和蛋白質(zhì)分子量的測定等。5、離子交換層析離子交換層析：6、密度梯度（區(qū)帶）離心：常用蔗糖密度梯度。、密度梯度（區(qū)帶）離心：常用蔗糖密度梯度。 此外，有透析法、超過濾法、萃取法、此外，有透析法、超過濾法、萃取法、sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳和和等電聚焦電泳等電聚焦電泳、超速離心、親和層析等。、超速離心、親和層析等。the end蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)與氨基酸、氨基酸、多肽一多肽一樣，能夠發(fā)生兩性解離樣，能夠發(fā)生兩性解離（兩性電解質(zhì)

10、），也有等（兩性電解質(zhì)），也有等電點（電點（pipi）。）。陽離子交換劑本身帶負(fù)電荷，陰離子交換劑本身帶正電荷。（221頁）l此法又稱為分子篩層析。凝膠過濾所此法又稱為分子篩層析。凝膠過濾所用的介質(zhì)是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或用的介質(zhì)是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝膠珠。凝膠珠的聚丙烯酰胺形成的凝膠珠。凝膠珠的內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。lsephadexsephadex- -葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠g10-g200g10-g200lsepharosesepharose- -瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠2 2b,4b,6bb,4b,6blsephacrylsephacryl- -丙烯

11、酰胺葡聚糖凝膠丙烯酰胺葡聚糖凝膠s100,s200,s300,s400s100,s200,s300,s400sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量 （sds學(xué)名為十二烷基磺酸鈉）學(xué)名為十二烷基磺酸鈉）sdssds（十二烷基磺酸鈉）（十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子型表面活是一種陰離子型表面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)性劑，它能夠與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基多肽鏈中的氨基酸殘基按大約按大約1 1 2 2比例結(jié)合。比例結(jié)合。這樣，每一個蛋白質(zhì)分這樣，每一個蛋白質(zhì)分子都因為結(jié)合了許多的子都因為結(jié)合了許多的sdssds而帶有大量的負(fù)電而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有荷，

12、而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。由的電荷則可以忽略。由于所有的蛋白質(zhì)顆粒都于所有的蛋白質(zhì)顆粒都帶有大量的負(fù)電荷，而帶有大量的負(fù)電荷，而且它們的電荷密度也大且它們的電荷密度也大體相同，因此，體相同，因此，e e q q值接值接近一個常數(shù)。所以該法近一個常數(shù)。所以該法主要利用了蛋白質(zhì)分子主要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離蛋白量大小不同而分離蛋白質(zhì)。質(zhì)。等電聚焦電泳：兩性電解質(zhì)載體由多烯多胺與丙烯酸加合得等電聚焦電泳：兩性電解質(zhì)載體由多烯多胺與丙烯酸加合得到，在電場作用下能形成連續(xù)的梯度。到，在電場作用下能形成連續(xù)的梯度。電電 泳泳 在等電點時蛋白質(zhì)比較穩(wěn)在等電點時蛋白質(zhì)比較穩(wěn)定，其物理性質(zhì)如定，其物理性質(zhì)如導(dǎo)電性、溶導(dǎo)電性、溶解度、粘度、滲透壓解度、粘度、滲透壓等皆最小。等皆最小。因此可利用蛋白質(zhì)在等電點時因此可利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最小的特性來制備或沉溶解度最小的特性來制備或沉淀蛋白質(zhì)。淀蛋