溶菌酶的提純結(jié)晶和活力測(cè)定.實(shí)驗(yàn)報(bào)告doc

1、溶菌酶的提純結(jié)晶和活力測(cè)定姓名： 學(xué)號(hào)： 班級(jí)： 指導(dǎo)老師：一、實(shí)驗(yàn)前言1.實(shí)驗(yàn)背景溶菌酶（lysozyme）是一種能夠水解細(xì)胞壁成分中N- 乙酰胞壁酸與N- 乙酰葡萄糖胺之間的- 1，4 糖苷鍵的酶，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品工業(yè)、生物工程等方面，現(xiàn)從雞蛋蛋清中提取溶菌酶已達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平。蛋清中的溶菌酶含量越高，酶活力越強(qiáng)，越有利于雞蛋的保存，因此測(cè)定雞蛋蛋清中的溶菌酶對(duì)我國(guó)溶菌酶生產(chǎn)、禽蛋產(chǎn)品加工有重要的指導(dǎo)作用，也為蛋品質(zhì)評(píng)定提供了一個(gè)重要參數(shù)?；盍y(cè)定的基本原理是用一種細(xì)菌懸液作為基質(zhì),加入待測(cè)標(biāo)本后保持一定時(shí)間,如樣品中含有溶菌酶則細(xì)菌被溶解,即其細(xì)胞壁不溶性多糖變成可溶性粘膚。測(cè)定

2、方法很多:如平皿測(cè)定法、光電比濁法、粘度測(cè)定法、分解產(chǎn)物測(cè)定法(因?yàn)榈孜锿^(guò)量,通常不用底物)、化學(xué)滴定法、分光光度法及同位素技術(shù),其中以平皿測(cè)定法和比濁法最為常用。溶菌酶分布很廣,而且不是單獨(dú)存在的,往往是和許多因子共同作用、相互協(xié)調(diào)。同時(shí),可以直接或間接地通過(guò)酶的分解產(chǎn)物而起作用。在這里許多問(wèn)題正處于摸索階段,有些方面通過(guò)特定的實(shí)驗(yàn),預(yù)測(cè)其應(yīng)用。而這些特定的實(shí)驗(yàn)往往對(duì)某種或某一個(gè)動(dòng)物而言,還有其局限性。未定論的問(wèn)題很多,許多應(yīng)用尚未大面積使于臨床,但是溶菌酶必將越來(lái)越引起人們的重視,特別是其廣布于人體,在醫(yī)藥、科研方面的作用尤為重要.(l)抗菌溶菌酶不但作用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,而且它作為一

3、種非特異性免疫,即對(duì)所有的病原微生物都有一定程度的抵抗力,沒(méi)有特殊的選擇性,對(duì)身體的自然防御起很大作用.如鼻粘膜,口腔中含有一些溶菌酶,臨床用于治療副鼻竇炎和齲齒;眼淚和白血球中溶菌酶含量最高,因此在干燥綜合癥診斷上,認(rèn)為淚液溶菌酶值的下降可以提供敏感可靠的指標(biāo),并能反映淚腺受損程度;在白血病患者的尿中,含有大量溶菌酶,臨床上可有效地診斷白血病。白血球中的溶菌酶在脫顆粒過(guò)程中被排列到噬菌體內(nèi),噬菌體感染宿主(抗原)后,誘導(dǎo)產(chǎn)生溶菌酶(抗體),這種溶菌酶是噬菌體染色體組,通過(guò)細(xì)胞壁分解酶和膜多糖分解酶的作用而表現(xiàn),其主要功能一是使噬菌體產(chǎn)生吸附作用,二是使噬菌體向宿主菌體內(nèi)注入DNA,溶菌酶在噬

4、菌體侵入宿主菌細(xì)胞和溶菌的整個(gè)過(guò)程中都起著重要作用,此溶菌酶(抗體)和補(bǔ)體共同作用,使某些微生物敏感,因此,溶菌酶可能和噬菌體內(nèi)其他抗微生物系統(tǒng)有協(xié)同作用,主要作用是消化細(xì)菌,而不是殺死細(xì)菌。普遍認(rèn)為,這種白細(xì)胞具有抗腫瘤作用和治療由細(xì)菌、病毒引起的炎癥。以上這種抗原抗體反應(yīng)也可以在體外進(jìn)行溶菌反應(yīng),即血清學(xué)反應(yīng),可解析細(xì)菌表層結(jié)構(gòu)和作為研究分子生物學(xué)的材料,通過(guò)它尋找新酶類,也可用做病毒性傳染病的診斷。(2)抗病毒一方面如流行感冒和腺病毒,可能它的蛋白質(zhì)外殼具有溶菌酶的作用點(diǎn),現(xiàn)已證明,腺病毒在人體內(nèi)引起呼吸道炎癥,在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中引起腫瘤。因此,用溶菌酶可以治療呼吸道疾患,抗動(dòng)物腫瘤。另一方面

5、溶菌酶作用的細(xì)菌產(chǎn)物可誘發(fā)產(chǎn)生干擾素,而干擾素主要功能是抗病毒。(3)提高抗菌素療效因?yàn)榭咕厥俏⑸锖铣傻拇x產(chǎn)物,通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁膚聚糖及核酸和蛋白質(zhì)的合成,影響細(xì)胞膜,因而具有抑制或致死其他微生物的作用。而溶菌酶也作用于細(xì)胞膜,與抗菌素合用可提高療效。(4)組織修復(fù)一方面酞胺類溶菌酶已證明對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂起直接作用.另一方面溶菌酶作用的微生物細(xì)胞壁是含氮的多糖(叫粘多糖),它在組織生長(zhǎng)和再生過(guò)程中起重要作用。日本學(xué)者在各種類型傷口的實(shí)驗(yàn)鼠中證明了溶菌酶的組織修復(fù)和臨床治療作用。(5)促進(jìn)血凝實(shí)驗(yàn)證明:糖昔酶作用于魚(節(jié)肢動(dòng)物甲殼類),其分解產(chǎn)物一脂多糖具有凝膠化作用,通過(guò)激活凝血酶原

6、,促進(jìn)血凝,在人類臨床上已用于牙科和泌尿科等小手術(shù)止血。(6)微生物分類上的作用如果兩種不同的微生物細(xì)胞壁都能受同一種酶的作用,就說(shuō)明這兩種微生物細(xì)胞壁有相同成分,可以此作為微生物分類的依據(jù)。(7)膚聚糖的免疫生物學(xué)活性免疫是機(jī)體抵抗一切抗原異物的能力,已知作用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌上有三種酶:糖昔酶、膚鏈內(nèi)切酶和酞胺酶,這些酶在體內(nèi)或游離在玻璃容器內(nèi)的檢出體外用,會(huì)產(chǎn)生不同的免疫效應(yīng),其中膚鏈內(nèi)切酶產(chǎn)生的胞壁酞二縮氨酸的作用尤為突出。最近日本學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)溶菌酶可作為潛在檢測(cè)金屬免疫毒性的生物標(biāo)志劑。(8)在分子遺傳學(xué)方面的研究進(jìn)展搞清溶菌酶基因的結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)、表達(dá)及定位,對(duì)于開發(fā)和利用溶菌酶起很重要

7、的作用,這正是現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展方向。美國(guó)學(xué)者,3,研究昆蟲的溶菌酶基因的結(jié)構(gòu)和誘導(dǎo),用CDNA進(jìn)行Norhtern雜交證明脂肪含量最高。還有學(xué)者,們搞清了水牛中溶菌酶基因的染色體定位。美國(guó)學(xué)者還在轉(zhuǎn)基因鼠乳腺中成功地表達(dá)了人溶菌酶mRNA?？傊?溶菌酶是研究細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、衛(wèi)生學(xué)等方面的一種重要的水解酶。對(duì)溶菌酶的研究始于20 世紀(jì)初，英國(guó)細(xì)菌學(xué)家弗萊明在1922 年發(fā)現(xiàn)人的鼻涕、唾液、眼淚有強(qiáng)大的溶菌活性，并把其溶菌作用的因子命名為溶菌酶。此后研究者在人和動(dòng)物的多種組織、分泌液及某些植物、微生物中也發(fā)現(xiàn)了溶菌酶的存在，其中雞蛋蛋清的溶菌酶含量最高（約含0.

8、3%）。雞蛋蛋清已成為溶菌酶生產(chǎn)的主要原料，但是蛋清中溶菌酶的定量測(cè)定還沒(méi)有一個(gè)較便捷的方法，傳統(tǒng)的方法是先提取蛋清中的溶菌酶，再測(cè)定提取液中的蛋白含量。由于不可能完全提取出蛋清中的溶菌酶，這種方法計(jì)算出的蛋清溶菌酶含量往往比實(shí)際的數(shù)值小。溶菌酶活力的測(cè)定方法很多，目前，國(guó)內(nèi)常用的有瓊脂板擴(kuò)散法、比色法、高效液相色譜法等，而國(guó)外多用比濁法測(cè)定溶菌酶活力。測(cè)定雞蛋蛋清中的溶菌酶含量的傳統(tǒng)途徑是先提取再測(cè)定，從蛋清中分離純化溶菌酶已有不少報(bào)道，雖然正交試驗(yàn)的酶回收率可達(dá)94%，但是再精確的提取途徑也無(wú)法完全提取出蛋清中的溶菌酶。2.實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)溶菌酶的提純方法和酶活力的測(cè)定3.實(shí)驗(yàn)原理雞蛋清內(nèi)含有

9、豐富的溶菌酶（lysozyme），向蛋清中加入一定量的中性鹽，并調(diào)節(jié)pH至溶菌酶的等電區(qū)，溶菌酶即可結(jié)晶析出。如結(jié)晶不純，可重結(jié)晶。溶菌酶之所以溶菌，是因?yàn)樗艽呋锾m氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁黏多糖水解。測(cè)定溶菌酶活力，可用某些細(xì)菌細(xì)胞壁作底物，以單位時(shí)間內(nèi)被它水解的細(xì)胞壁的量表示酶活力的大小。二、主要儀器設(shè)備及試劑1.主要儀器設(shè)備可見分光光度計(jì) 離心機(jī) 恒溫水浴鍋 勻漿器 燒杯 布氏漏斗 真空干燥器 紗布 吸管 量筒 抽濾瓶 電子天平 2.主要試劑1.氯化鈉（C.P）：應(yīng)研細(xì)2.五氧化二磷3.1mol/L NaOH溶液4.丙酮（無(wú)水，C.P）5.0.1mol/L磷酸緩沖液（pH6.2）6.溶菌酶晶種

10、7.牛肉膏蛋白胨固體、液體培養(yǎng)基8.底物懸液：溶菌小球菌（Micrococcus lysodeik Licus）的細(xì)胞壁三、實(shí)驗(yàn)步驟1底物懸液的制作將菌種接種于液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)（28,24h），離心（4000rpm，20min），傾去上清液，沉淀為菌體。加入少量蒸餾水，用玻璃棒攪成懸液，離心，傾去上清液，如此反復(fù)洗滌菌體數(shù)次，最后用少量蒸餾水制成懸液，冷凍干燥。亦可將菌體鋪于玻板上吹干，刮下，置干燥器中。取干菌粉5mg，置勻漿器中，加入少量pH6.2磷酸緩沖液，研磨數(shù)分鐘，傾出，用少量緩沖液洗勻漿器，一并稀釋至20-25ml。比色測(cè)定A450nm 。此懸液吸光度應(yīng)在0.5-0.7范圍內(nèi)。2.

11、溶菌酶的提純結(jié)晶（1）將2只雞蛋的蛋清置于小燒杯中（蛋清pH不得低于8.0），慢慢攪拌數(shù)分鐘，使蛋清稠度均勻，然后用兩層紗布濾去卵帶或碎蛋殼，量記蛋清體積。（2）按100ml蛋清加5g氯化鈉的比例，向蛋清內(nèi)慢慢加入氯化鈉細(xì)粉，邊加邊攪，使氯化鈉及時(shí)溶解，避免氯化鈉沉于容器底部，否則將因局部鹽濃度過(guò)高而產(chǎn)生大量白色沉淀。（3）加完氯化鈉，用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.5-10.0，隨加隨攪勻，避免局部過(guò)堿。加入少量溶菌酶結(jié)晶作為晶種，4放置數(shù)天。當(dāng)肉眼觀察有結(jié)晶形成后，吸取晶液一滴，置載玻片上，用顯微鏡觀察（100×），記錄晶形。（4）結(jié)晶用布氏漏斗濾得，用0丙酮洗滌數(shù)次，置真

12、空干燥器干燥。3.活力測(cè)定（1）酶液的制備：準(zhǔn)確稱取干酶粉5mg，用0.1mol/L pH6.2磷酸緩沖液溶解成1mg/ml酶液。用時(shí)稀釋20倍，則每毫升酶液酶量為50ug。（2）將酶液和底物懸液分別置25水浴中保溫10-15min，然后吸底物懸液3.0ml置比色杯中，比色測(cè)定A450nm，此為零時(shí)讀數(shù)。然后加入酶液0.2ml（10ug酶），迅速搖勻，從加入酶計(jì)時(shí)，每隔30s測(cè)一次A450nm，共測(cè)3次。（3）本實(shí)驗(yàn)的酶活力單位定義為：每分鐘A450nm下降0.001為一個(gè)活力單位（25，pH6.2） P=(A0-A1)/m ×1000式中 P：每毫克酶的活力單位（U/mg）； A0：零時(shí)450nm處的吸光度； A1：1min時(shí)450nm處的吸光度； m：樣品的質(zhì)量（mg）； 1000：0.001的倒數(shù)，即相當(dāng)于除以0.001。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析1.晶形2.比色測(cè)定結(jié)果五、注意事項(xiàng)1.雞蛋清的攪拌速度切忌不能起泡，攪拌方向不得改變，攪棒應(yīng)光滑，這些都是防止蛋白變性的措施。2.氯化鈉細(xì)粉應(yīng)慢慢加入，并邊加邊攪