不同類(lèi)型細(xì)胞的培點(diǎn)

1、第六章第六章 個(gè)別細(xì)胞和組織的培養(yǎng)個(gè)別細(xì)胞和組織的培養(yǎng)類(lèi)型：類(lèi)型：正常細(xì)胞培養(yǎng)正常細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)第一節(jié)第一節(jié) 正常細(xì)胞培養(yǎng)正常細(xì)胞培養(yǎng)v正常細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時(shí)都正常細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時(shí)都不易生長(zhǎng)，建不易生長(zhǎng)，建立細(xì)胞系更難。立細(xì)胞系更難。v正常細(xì)胞難培養(yǎng)的正常細(xì)胞難培養(yǎng)的原因是它們是分化的細(xì)原因是它們是分化的細(xì)胞，對(duì)體外生存條件要求嚴(yán)格胞，對(duì)體外生存條件要求嚴(yán)格.v但只要一切條件適當(dāng)仍有培養(yǎng)成功可能。但只要一切條件適當(dāng)仍有培養(yǎng)成功可能。一、上皮細(xì)胞類(lèi)培養(yǎng)一、上皮細(xì)胞類(lèi)培養(yǎng)v上皮細(xì)胞可來(lái)源于外、內(nèi)、中三個(gè)胚層；上皮細(xì)胞可來(lái)源于外、內(nèi)、中三個(gè)胚層；v培養(yǎng)中只有源于外和內(nèi)胚層的細(xì)胞能

2、反映出上培養(yǎng)中只有源于外和內(nèi)胚層的細(xì)胞能反映出上皮細(xì)胞的特征，細(xì)胞呈膜狀生長(zhǎng)的特點(diǎn)。皮細(xì)胞的特征，細(xì)胞呈膜狀生長(zhǎng)的特點(diǎn)。v上皮細(xì)胞培養(yǎng)有三個(gè)難點(diǎn)：上皮細(xì)胞培養(yǎng)有三個(gè)難點(diǎn)：需求特殊底物，如在底物上涂有膠原底層則需求特殊底物，如在底物上涂有膠原底層則利于細(xì)胞生長(zhǎng)；利于細(xì)胞生長(zhǎng)；需求特殊培養(yǎng)基；需求特殊培養(yǎng)基；與上皮細(xì)胞相鄰的成纖維細(xì)胞常與上皮細(xì)胞與上皮細(xì)胞相鄰的成纖維細(xì)胞常與上皮細(xì)胞同時(shí)混雜生長(zhǎng)，并常壓過(guò)上皮細(xì)胞。同時(shí)混雜生長(zhǎng)，并常壓過(guò)上皮細(xì)胞。v純化和延長(zhǎng)上皮細(xì)胞生存期純化和延長(zhǎng)上皮細(xì)胞生存期是上皮細(xì)胞培養(yǎng)是上皮細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵之一。的關(guān)鍵之一。(一一)表皮細(xì)胞培養(yǎng)表皮細(xì)胞培養(yǎng)1特點(diǎn)特點(diǎn)：v在有膠

3、原的底物上易生長(zhǎng)在有膠原的底物上易生長(zhǎng)；v把人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以把人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以3t3 細(xì)胞為飼養(yǎng)層細(xì)胞為飼養(yǎng)層(用射線(xiàn)照射用射線(xiàn)照射后后)上時(shí)，細(xì)胞易生長(zhǎng)并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。上時(shí)，細(xì)胞易生長(zhǎng)并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。v降低降低ph、ca2+的含量和溫度等，均利于表皮細(xì)胞生長(zhǎng)。的含量和溫度等，均利于表皮細(xì)胞生長(zhǎng)。v向培養(yǎng)基中加氫化可的松向培養(yǎng)基中加氫化可的松(10 g/m1)、10-6m的異丙基腎上的異丙基腎上腺素腺素(isoproterenol) 和和10 ng/m1 促表皮生長(zhǎng)因子促表皮生長(zhǎng)因子(egf) 能能促表皮細(xì)胞生長(zhǎng)。促表皮細(xì)胞生長(zhǎng)。v【飼細(xì)胞【飼細(xì)胞】飼細(xì)

4、胞飼細(xì)胞(feeder cells)也稱(chēng)滋養(yǎng)也稱(chēng)滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過(guò)射線(xiàn)照射或絲裂霉素傷害處理細(xì)胞，是一層經(jīng)過(guò)射線(xiàn)照射或絲裂霉素傷害處理的、用作克隆細(xì)胞附著底物的細(xì)胞層。的、用作克隆細(xì)胞附著底物的細(xì)胞層。v飼細(xì)胞作用：飼細(xì)胞作用：v有同化營(yíng)養(yǎng)液的能力有同化營(yíng)養(yǎng)液的能力。v飼細(xì)胞能促克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)，利于克隆的形成飼細(xì)胞能促克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)，利于克隆的形成。克隆形成后飼細(xì)胞漸死亡，換液時(shí)清除?？寺⌒纬珊箫暭?xì)胞漸死亡，換液時(shí)清除。飼細(xì)胞的制備：飼細(xì)胞的制備：(1)取原代培養(yǎng)的取原代培養(yǎng)的人或動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞人或動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞，90% 匯合時(shí)制成細(xì)胞懸液，再按匯合時(shí)制成細(xì)胞懸液，再按103 細(xì)胞細(xì)

5、胞/毫升重新接毫升重新接種培養(yǎng)；種培養(yǎng)；(2)在細(xì)胞半?yún)R合時(shí)，準(zhǔn)備在細(xì)胞半?yún)R合時(shí)，準(zhǔn)備0.25g/ml 的絲裂霉素，的絲裂霉素，按按2ug/105 細(xì)胞的量加入到培養(yǎng)瓶中過(guò)夜；或用細(xì)胞的量加入到培養(yǎng)瓶中過(guò)夜；或用射線(xiàn)單次照射，劑量射線(xiàn)單次照射，劑量3050 戈瑞戈瑞(gy)；(3)細(xì)胞經(jīng)上述處理后，細(xì)胞經(jīng)上述處理后，hanks 液漂洗兩次、更換培液漂洗兩次、更換培養(yǎng)液、再培養(yǎng)養(yǎng)液、再培養(yǎng)24 小時(shí)，胰蛋白酶消化細(xì)胞制成懸小時(shí)，胰蛋白酶消化細(xì)胞制成懸液，按液，按5104/ml接種入新培養(yǎng)基中；接種入新培養(yǎng)基中；(4)48 小時(shí)后，即可用于細(xì)胞克隆之用。小時(shí)后，即可用于細(xì)胞克隆之用。2表皮細(xì)胞培養(yǎng)

6、程序：表皮細(xì)胞培養(yǎng)程序：(1) 取材取材：取外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，以角化層薄者為佳，：取外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，以角化層薄者為佳，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，切成早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，切成0.5 1cm2小塊；小塊；(2) edta 處理處理：先置入：先置入0.02 edta 中室溫置中室溫置5 分鐘。分鐘。(3) 冷消化冷消化：換入：換入0.25% 胰蛋白酶中，置胰蛋白酶中，置4過(guò)夜；過(guò)夜；(4) 分離：分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開(kāi)；取出皮塊，用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開(kāi)；(5) 溫消化：溫消化：取出表皮單獨(dú)處理；用剪刀剪成更小的塊后，取出表皮單獨(dú)處理；用剪刀剪成更小

7、的塊后，置入新的置入新的0.25胰蛋白酶中，胰蛋白酶中，37再消化再消化30 60 分鐘；分鐘；(6)制細(xì)胞懸液：制細(xì)胞懸液：用吸管輕輕反復(fù)吹打，使成細(xì)胞懸液；用吸管輕輕反復(fù)吹打，使成細(xì)胞懸液；(7) 加培養(yǎng)液：加培養(yǎng)液：通過(guò)通過(guò)80 目不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)后，低速離心，吸目不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)后，低速離心，吸上清，直接加入上清，直接加入eagle 液和液和20小牛血清小牛血清.(8)培養(yǎng)：培養(yǎng)：接種入碟皿中，接種入碟皿中，co2 溫箱培養(yǎng)。溫箱培養(yǎng)。v注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：冷消化目的在于使表皮和真皮結(jié)冷消化目的在于使表皮和真皮結(jié)合松散；合松散；如冷消化后分離下來(lái)的表皮膜自身如冷消化后分離下來(lái)的表皮膜自身也

8、已松散，此時(shí)亦可直接置入也已松散，此時(shí)亦可直接置入pbs 中用吸管中用吸管吹打制備細(xì)胞懸液；不再經(jīng)過(guò)第二次消化。吹打制備細(xì)胞懸液；不再經(jīng)過(guò)第二次消化。(二二) 胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)v適于胃上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的條件是：適于胃上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的條件是：膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化法并用消化細(xì)胞；膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化法并用消化細(xì)胞；應(yīng)用膠原底物培養(yǎng)；應(yīng)用膠原底物培養(yǎng)；制備含有特定成分的培養(yǎng)基；制備含有特定成分的培養(yǎng)基；v培養(yǎng)程序：培養(yǎng)程序：(1) 取材取材：取胃潰瘍或胃癌手術(shù)切除胃標(biāo)本遠(yuǎn)端：取胃潰瘍或胃癌手術(shù)切除胃標(biāo)本遠(yuǎn)端非病非病變區(qū)變區(qū)粘膜少許；粘膜少許；(2) 清洗清洗：用含慶大霉素：用含慶大霉素(4

9、00g/m1)和兩性霉素和兩性霉素(2g/m1 的的hanks)液漂洗后，用鈍器剝離下粘膜，液漂洗后，用鈍器剝離下粘膜，剪成剪成1mm大小；大??；(3) 消化消化：在：在i 型膠原酶型膠原酶和和透明質(zhì)酸酶透明質(zhì)酸酶中，于中，于37中消中消化化80 分鐘；分鐘；(4) 離心離心：收集細(xì)胞懸液，：收集細(xì)胞懸液，800 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分離心后，分離心后，hanks 液漂洗兩次；液漂洗兩次；(5) 接種接種：末次離心后加入含有：末次離心后加入含有1 2胎牛胎牛血清的完全培養(yǎng)基血清的完全培養(yǎng)基，接種入不同孔數(shù)的培養(yǎng)，接種入不同孔數(shù)的培養(yǎng)板中；接種量依不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。板中；接種量依不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ā細(xì)胞接種后

10、一般在細(xì)胞接種后一般在16 小時(shí)內(nèi)貼壁，細(xì)胞呈小時(shí)內(nèi)貼壁，細(xì)胞呈多角形，成島狀或片狀生長(zhǎng)，以后逐漸聯(lián)接多角形，成島狀或片狀生長(zhǎng)，以后逐漸聯(lián)接成片。初代培養(yǎng)可維持成片。初代培養(yǎng)可維持2 3 周，第一周末周，第一周末達(dá)高峰，最后逐漸衰退剝落。達(dá)高峰，最后逐漸衰退剝落。(三三) 肝細(xì)胞培養(yǎng)肝細(xì)胞培養(yǎng)v肝臟具有取材方便和易于生長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，能獲肝臟具有取材方便和易于生長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，能獲得典型上皮細(xì)胞培養(yǎng)。得典型上皮細(xì)胞培養(yǎng)。1初代組織塊培養(yǎng)：初代組織塊培養(yǎng)：v肝組織做組織塊培養(yǎng)效果很好。取新鮮肝臟，肝組織做組織塊培養(yǎng)效果很好。取新鮮肝臟，先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或剪刀先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或

11、剪刀把肝剪成把肝剪成1mm3 左右的小塊，采用貼壁培養(yǎng)左右的小塊，采用貼壁培養(yǎng)法。肝組織易于貼壁，生長(zhǎng)力好，一般次日法。肝組織易于貼壁，生長(zhǎng)力好，一般次日即可出現(xiàn)生長(zhǎng)暈。即可出現(xiàn)生長(zhǎng)暈。2初代消化法培養(yǎng)：初代消化法培養(yǎng)：(1) 把肝組織切成把肝組織切成2 4 立方毫米的小塊，用不合鈣鎂立方毫米的小塊，用不合鈣鎂的的bss 液洗兩次；液洗兩次；(2) 移入移入1:1 的的0.1胰蛋白酶和胰蛋白酶和0.1膠原酶膠原酶(都用無(wú)鈣都用無(wú)鈣鎂鎂bss 配制配制) 中，中，4冷消化冷消化10 12 小時(shí)后，通過(guò)小時(shí)后，通過(guò)250 微米和微米和64 微米尼龍網(wǎng)或不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)微米尼龍網(wǎng)或不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)(用紗

12、布用紗布濾過(guò)亦可濾過(guò)亦可)；(3) 收集細(xì)胞、收集細(xì)胞、bss 液洗液洗1 2 次、計(jì)數(shù)、接種培養(yǎng)；次、計(jì)數(shù)、接種培養(yǎng)；3肝臟灌流法：肝臟灌流法：v需用全肝，以較小動(dòng)物如小鼠和大鼠為好需用全肝，以較小動(dòng)物如小鼠和大鼠為好。(1) 無(wú)菌解剖動(dòng)物，取出肝臟，先用無(wú)菌解剖動(dòng)物，取出肝臟，先用bss 洗除血污；洗除血污；(2) 取取5ml 注射器一支，吸取消化液后，把注射器一支，吸取消化液后，把注射器頭輕輕插入肝注射器頭輕輕插入肝管中管中，用線(xiàn)繩結(jié)扎牢固，以防消化液漏出，輕輕把消化液注，用線(xiàn)繩結(jié)扎牢固，以防消化液漏出，輕輕把消化液注入膽管系統(tǒng)，并不時(shí)輕柔壓肝臟，以便消化液進(jìn)入肝小葉中；入膽管系統(tǒng)，并不

13、時(shí)輕柔壓肝臟，以便消化液進(jìn)入肝小葉中； 消化液在肝內(nèi)停留消化液在肝內(nèi)停留20 30 分后，在吸出消化液的同時(shí)并輕柔分后，在吸出消化液的同時(shí)并輕柔壓肝臟，以使肝細(xì)胞脫落和消化液吸出；壓肝臟，以使肝細(xì)胞脫落和消化液吸出；(3) 待吸凈消化液后，注入離心管中，低待吸凈消化液后，注入離心管中，低速離心分離，用速離心分離，用rpmi 1640 培養(yǎng)基培培養(yǎng)基培養(yǎng)養(yǎng)(較其它培養(yǎng)基為好較其它培養(yǎng)基為好)，能獲得較純的，能獲得較純的肝上皮細(xì)胞和獲較好的效果。肝上皮細(xì)胞和獲較好的效果。(四四) 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)v應(yīng)用材料：應(yīng)用材料：人臍帶臍靜脈、動(dòng)物大動(dòng)脈等，人臍帶臍靜脈、動(dòng)物大動(dòng)脈等，用灌流消化法獲取

14、細(xì)胞最為簡(jiǎn)便。用灌流消化法獲取細(xì)胞最為簡(jiǎn)便。(1)取產(chǎn)后的新鮮臍帶；如不立即培養(yǎng)可保存取產(chǎn)后的新鮮臍帶；如不立即培養(yǎng)可保存于于4中，但不宜超過(guò)中，但不宜超過(guò)12 小時(shí)；小時(shí)；無(wú)菌剪取無(wú)菌剪取長(zhǎng)長(zhǎng)10 15 厘米一段厘米一段。 其它如胚胎和幼體動(dòng)物的大血管，亦可用其它如胚胎和幼體動(dòng)物的大血管，亦可用于培養(yǎng)；于培養(yǎng)；(2) 先用三通注射器吸先用三通注射器吸溫溫pbs 液注入臍帶的臍液注入臍帶的臍靜脈中，洗除殘血靜脈中，洗除殘血；注入口處宜用線(xiàn)繩結(jié)；注入口處宜用線(xiàn)繩結(jié)扎，以防液體返流；扎，以防液體返流；(3) 用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃

15、度為徐徐注入最終濃度為0.1的膠原酶的膠原酶，待末端，待末端出現(xiàn)液體后結(jié)扎之，令充滿(mǎn)血管，注入口亦出現(xiàn)液體后結(jié)扎之，令充滿(mǎn)血管，注入口亦應(yīng)結(jié)扎，以防液體返流，應(yīng)結(jié)扎，以防液體返流，消化消化3 10 分鐘分鐘；(4) 吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，注入離心管中吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，注入離心管中；為獲取更多細(xì)胞，可再注入溫為獲取更多細(xì)胞，可再注入溫pbs 沖洗沖洗2 3 次徹底清除干凈殘余細(xì)胞，一并注入離心管次徹底清除干凈殘余細(xì)胞，一并注入離心管中離心；中離心；(5) 吸除上清，加吸除上清，加1640 培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液，培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液，接種入瓶皿中培養(yǎng)接種入瓶皿中培養(yǎng)，順利時(shí)，順利時(shí)2

16、3 天內(nèi)細(xì)胞即天內(nèi)細(xì)胞即可長(zhǎng)成單層。可長(zhǎng)成單層。v人臍帶易于獲得，培養(yǎng)效果好；細(xì)胞生長(zhǎng)后，人臍帶易于獲得，培養(yǎng)效果好；細(xì)胞生長(zhǎng)后，一般傳一般傳6 7 代后即衰退，難以長(zhǎng)期維持。代后即衰退，難以長(zhǎng)期維持。用兔血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)較好，可傳用兔血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)較好，可傳10 30 代；代；v不同部位血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，對(duì)不同部位血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，對(duì)各種作用因素反應(yīng)亦有很大差別。各種作用因素反應(yīng)亦有很大差別。(五五) 毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)v毛細(xì)血管細(xì)小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，內(nèi)皮細(xì)胞外有較毛細(xì)血管細(xì)小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，內(nèi)皮細(xì)胞外有較多的結(jié)締組織，進(jìn)行分離培養(yǎng)有很大困難。多的結(jié)締組織，

17、進(jìn)行分離培養(yǎng)有很大困難。v近年毛細(xì)血管培養(yǎng)已獲成功；近年毛細(xì)血管培養(yǎng)已獲成功；v利用人的小兒包皮、人脾臟、牛腎上腺、癌利用人的小兒包皮、人脾臟、牛腎上腺、癌組織組織(如卵巢癌如卵巢癌) 等均可；等均可；1材料：材料：v腫瘤條件培養(yǎng)基制備腫瘤條件培養(yǎng)基制備(1) 取取c3h 小鼠的小鼠的s-180 實(shí)體肉瘤組織實(shí)體肉瘤組織；(2) 胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化，dulbecco 改良改良eagle 氏氏培養(yǎng)液培養(yǎng)液15m1 (含含10小牛血清小牛血清) 種到培養(yǎng)種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；瓶中培養(yǎng)；(3) 在細(xì)胞生長(zhǎng)接近完全匯合時(shí)，收集培養(yǎng)液制成條件培養(yǎng)基；在細(xì)胞生長(zhǎng)接近完全匯合時(shí)，收集培養(yǎng)液制成條件培養(yǎng)基；

18、再用含再用含10小牛血清的新培養(yǎng)液后，也每隔兩天收集一次，小牛血清的新培養(yǎng)液后，也每隔兩天收集一次，可獲多量條件培養(yǎng)基；可獲多量條件培養(yǎng)基；(4) 4000 轉(zhuǎn)分離心后，再通過(guò)轉(zhuǎn)分離心后，再通過(guò)0.22m 微孔濾膜濾過(guò)，微孔濾膜濾過(guò)，-20凍存?zhèn)溆脙龃鎮(zhèn)溆?臨用前融解臨用前融解)。v凝膠底層制備凝膠底層制備(1) 取取60 mm falcon 產(chǎn)培養(yǎng)皿，加產(chǎn)培養(yǎng)皿，加1% difco 產(chǎn)明膠產(chǎn)明膠(用不合鈣用不合鈣和鎂的和鎂的hanks 液配制液配制)，鋪蓋瓶底，形成薄層；，鋪蓋瓶底，形成薄層；(2) 置置4過(guò)夜；用前再用少許培養(yǎng)液沖洗一次。過(guò)夜；用前再用少許培養(yǎng)液沖洗一次。2初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)

19、(1) 取材取材：取新鮮牛腎上腺數(shù)個(gè)，先用：取新鮮牛腎上腺數(shù)個(gè)，先用hanks 液洗除血污；液洗除血污；(2) 消化：消化：剝除被膜，分離出皮質(zhì)，切成剝除被膜，分離出皮質(zhì)，切成l mm3 小塊，加小塊，加0.5膠原酶室溫中消化膠原酶室溫中消化1 小時(shí)；每小時(shí)；每隔隔10 分鐘用吸管吹打懸液令消化充分；分鐘用吸管吹打懸液令消化充分；(3)過(guò)濾：過(guò)濾：通過(guò)不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)，網(wǎng)眼要求只允通過(guò)不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)，網(wǎng)眼要求只允許能通過(guò)小于許能通過(guò)小于110 微米長(zhǎng)的毛細(xì)血管小段；微米長(zhǎng)的毛細(xì)血管小段；(4)離心：離心：650 rpm，4，離心，離心7 分鐘后，棄掉分鐘后，棄掉上清膠原酶；上清膠原酶；(5)再離

20、心：再離心：沉淀物用培養(yǎng)液重懸并離心，再重懸，再沉淀物用培養(yǎng)液重懸并離心，再重懸，再離心，共兩次；離心，共兩次；(6) 制細(xì)胞懸液：制細(xì)胞懸液：末次沉淀物仍用含末次沉淀物仍用含10小牛血清的小牛血清的dulbecco 改良改良eag1e 氏培養(yǎng)液重懸后，稍吹打；氏培養(yǎng)液重懸后，稍吹打；(7)接種：接種：接種入鋪有明膠底層的培養(yǎng)皿中，接種入鋪有明膠底層的培養(yǎng)皿中，37培養(yǎng)；培養(yǎng)；在培養(yǎng)頭在培養(yǎng)頭1 3 小時(shí)中，毛細(xì)血管小段和內(nèi)皮細(xì)胞最小時(shí)中，毛細(xì)血管小段和內(nèi)皮細(xì)胞最先貼附于底物上，而腎上腺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞卻仍先貼附于底物上，而腎上腺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞卻仍在培養(yǎng)液中漂??；在培養(yǎng)液中漂??；(8)換液：

21、換液：吸除培養(yǎng)液，再吸除培養(yǎng)液，再加入腫瘤條件培養(yǎng)液加入腫瘤條件培養(yǎng)液；每?jī)?；每?jī)商鞊Q液一次。毛細(xì)血管小段一般成自天換液一次。毛細(xì)血管小段一般成自1 4 個(gè)內(nèi)皮細(xì)個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞，胞，v以后每個(gè)小段在底物上慢慢展成特殊形態(tài)的細(xì)胞島，以后每個(gè)小段在底物上慢慢展成特殊形態(tài)的細(xì)胞島，能持續(xù)能持續(xù)2 5 天。天。3毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)：毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)：(1) 初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)2 3 天后，鏡下確認(rèn)幾個(gè)毛細(xì)血天后，鏡下確認(rèn)幾個(gè)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞島，在培養(yǎng)皿背面，用不脫色筆管內(nèi)皮細(xì)胞島，在培養(yǎng)皿背面，用不脫色筆劃圈圈起；劃圈圈起；(2) 鏡下檢查，如圈內(nèi)殘有非內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，可用鏡下檢查，如圈內(nèi)殘有非內(nèi)

22、皮細(xì)胞時(shí)，可用顯微細(xì)針在倒置顯微鏡下挑除；用細(xì)胞解剖顯微細(xì)針在倒置顯微鏡下挑除；用細(xì)胞解剖器也可，宜在凈化臺(tái)無(wú)菌氣流中、打開(kāi)培養(yǎng)器也可，宜在凈化臺(tái)無(wú)菌氣流中、打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋進(jìn)行，但時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)皿蓋進(jìn)行，但時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)(15 20 分鐘分鐘)；圈外非內(nèi)皮細(xì)胞可用無(wú)菌膠刮刮除；圈外非內(nèi)皮細(xì)胞可用無(wú)菌膠刮刮除；(3) 用培養(yǎng)液漂洗兩次，以去除漂浮細(xì)胞；用培養(yǎng)液漂洗兩次，以去除漂浮細(xì)胞；(4) 剩余內(nèi)皮細(xì)胞島如小剩余內(nèi)皮細(xì)胞島如小(5 20 個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞) 而少時(shí)，生長(zhǎng)而少時(shí)，生長(zhǎng)增殖常變得緩慢或完全不生長(zhǎng)，此時(shí)需加入增殖常變得緩慢或完全不生長(zhǎng)，此時(shí)需加入3t3等等飼細(xì)胞；飼細(xì)胞接種量為飼細(xì)胞；飼細(xì)胞接

23、種量為4000 細(xì)胞細(xì)胞cm2；(5) 當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞充滿(mǎn)所有飼細(xì)胞空間后，用胰蛋白酶消當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞充滿(mǎn)所有飼細(xì)胞空間后，用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養(yǎng)基；化、離心、加入腫瘤條件培養(yǎng)基；(6) 接種入明膠底物皿中繼續(xù)培養(yǎng)接種入明膠底物皿中繼續(xù)培養(yǎng)(飼細(xì)胞死亡被淘汰飼細(xì)胞死亡被淘汰)，細(xì)胞增殖生長(zhǎng)匯合后，按細(xì)胞增殖生長(zhǎng)匯合后，按1:5 傳代。傳代。二、結(jié)締組織類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)二、結(jié)締組織類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)(一一) 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)v包括人在內(nèi)的各種成纖維細(xì)胞都很容易培養(yǎng)，包括人在內(nèi)的各種成纖維細(xì)胞都很容易培養(yǎng)，也是其它組織培養(yǎng)時(shí)的副產(chǎn)物，極易獲得。也是其它組織培養(yǎng)時(shí)的副產(chǎn)物，極易獲得。v用人或動(dòng)

24、物胚體為好；動(dòng)物可用小鼠或雞胚，用人或動(dòng)物胚體為好；動(dòng)物可用小鼠或雞胚，去頭和內(nèi)臟，剪成小碎塊后，用胰蛋白酶消去頭和內(nèi)臟，剪成小碎塊后，用胰蛋白酶消化法培養(yǎng)；如為人胚，可取皮膚培養(yǎng)。幼兒化法培養(yǎng)；如為人胚，可取皮膚培養(yǎng)。幼兒包皮是培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的很好對(duì)象。包皮是培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的很好對(duì)象。小鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)條件v12.514.5d胎齡的小鼠胎兒分離效果最好；胎齡的小鼠胎兒分離效果最好；v最佳培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基為dmem添加添加15%小牛血清；小牛血清；v第第3代細(xì)胞增殖最旺盛；代細(xì)胞增殖最旺盛；v室溫條件下，室溫條件下，0.125%胰蛋白酶消化時(shí)間以胰蛋白酶消化時(shí)間以810min為宜。為宜。v在

25、培養(yǎng)在培養(yǎng)es細(xì)胞時(shí)，應(yīng)選擇第細(xì)胞時(shí)，應(yīng)選擇第35代的小鼠成代的小鼠成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。小鼠成纖維細(xì)胞；小鼠成纖維細(xì)胞；細(xì)胞來(lái)源：細(xì)胞來(lái)源：swiss小鼠胚胎小鼠胚胎 (二二) 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)v巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象。噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象。v巨噬細(xì)胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進(jìn)行純化。但巨噬細(xì)胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進(jìn)行純化。但屬不繁殖型細(xì)胞群，難以長(zhǎng)期生存，好的條件下僅屬不繁殖型細(xì)胞群，難以長(zhǎng)期生存，好的條件下僅能生活能生活2 3周，因之多

26、用作初代培養(yǎng)周，因之多用作初代培養(yǎng)。v巨噬細(xì)胞也能建成無(wú)限細(xì)胞系；大多來(lái)自小鼠，如巨噬細(xì)胞也能建成無(wú)限細(xì)胞系；大多來(lái)自小鼠，如p388d-1、j774a1、raw309、cr. 1 等。等。1培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)：培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)：v來(lái)源和取材來(lái)源和取材 巨噬細(xì)胞可來(lái)源于人胸水、腹巨噬細(xì)胞可來(lái)源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。水、血和透析液等材料。v實(shí)驗(yàn)多從動(dòng)物血液、肺、脾和胸腹腔獲取，實(shí)驗(yàn)多從動(dòng)物血液、肺、脾和胸腹腔獲取，其中以從動(dòng)物腹腔取材最常用。用其中以從動(dòng)物腹腔取材最常用。用40g 的的pha 注入腹腔中，能產(chǎn)生注入腹腔中，能產(chǎn)生6 8106 個(gè)細(xì)個(gè)細(xì)胞，而且無(wú)刺激性，效果較好。胞，而且無(wú)刺激性

27、，效果較好。2培養(yǎng)方法：培養(yǎng)方法：v培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各種方法和各種來(lái)源獲取細(xì)胞，其培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各種方法和各種來(lái)源獲取細(xì)胞，其中以小鼠腹腔取材法最為實(shí)用。人的材料除來(lái)源不同中以小鼠腹腔取材法最為實(shí)用。人的材料除來(lái)源不同外，培養(yǎng)方法大同小異。外，培養(yǎng)方法大同小異。v程序程序(1) 實(shí)驗(yàn)前三天，向每只小鼠腹腔內(nèi)注入無(wú)菌硫基乙酸實(shí)驗(yàn)前三天，向每只小鼠腹腔內(nèi)注入無(wú)菌硫基乙酸肉湯肉湯1ml (勿注入腸內(nèi)勿注入腸內(nèi))；(2) 引頸殺死動(dòng)物；手提鼠尾將全鼠浸入引頸殺死動(dòng)物；手提鼠尾將全鼠浸入70酒精中酒精中3 5 秒；秒；(3) 置動(dòng)物于解剖臺(tái)上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕置動(dòng)物于解剖臺(tái)上，用針頭固定四肢

28、，雙手持鑷撕開(kāi)皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁；開(kāi)皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁；(4) 再用再用70酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml eag1e 液注入腹腔中，同時(shí)從兩側(cè)用手指揉壓腹膜液注入腹腔中，同時(shí)從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動(dòng)；壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動(dòng)；(5) 用針頭輕輕挑起腹壁，使動(dòng)物體微傾向一側(cè)，使用針頭輕輕挑起腹壁，使動(dòng)物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內(nèi)；腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內(nèi)；(6) 小心拔出針頭，把液體注入離心管中，小心拔出針頭，把液體注入離心管中， (4)離離心心10 分鐘后，去上

29、清，加分鐘后，去上清，加10 ml eagle 培養(yǎng)基；培養(yǎng)基；(7) 計(jì)數(shù)細(xì)胞，每只小鼠可產(chǎn)生計(jì)數(shù)細(xì)胞，每只小鼠可產(chǎn)生20 30106 細(xì)胞，細(xì)胞，其中其中90為巨噬細(xì)胞；為巨噬細(xì)胞；(8) 為獲取為獲取3105 個(gè)貼附細(xì)胞平方厘米，需接種個(gè)貼附細(xì)胞平方厘米，需接種2.5106m1；(9) 為純化培養(yǎng)細(xì)胞，去除其它白細(xì)胞，接種數(shù)小時(shí)為純化培養(yǎng)細(xì)胞，去除其它白細(xì)胞，接種數(shù)小時(shí)后，去除培養(yǎng)液，用后，去除培養(yǎng)液，用eagle 液沖洗液沖洗1 2 次后，再次后，再加新加新eagle 培養(yǎng)液置培養(yǎng)液置37 co2 溫箱中培養(yǎng)。溫箱中培養(yǎng)。三、肌組織細(xì)胞培養(yǎng)三、肌組織細(xì)胞培養(yǎng)v以心肌和骨骼肌培養(yǎng)較為實(shí)用

30、。以心肌和骨骼肌培養(yǎng)較為實(shí)用。(一一) 骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)v動(dòng)物胚或幼體的動(dòng)物胚或幼體的大腿肌組織為最好的培養(yǎng)材料大腿肌組織為最好的培養(yǎng)材料。取。取材常用生后材常用生后1 2 天的乳鼠天的乳鼠(wistar 大鼠更好大鼠更好)。(1) 取材取材：殺死動(dòng)物，無(wú)菌取大腿肌組織，切成殺死動(dòng)物，無(wú)菌取大腿肌組織，切成0.3 0.5 厘米小塊；厘米小塊；(2)消化消化：用不含鈣鎂離子的用不含鈣鎂離子的hanks 液配的液配的0.25胰胰蛋白酶消化，無(wú)菌紗網(wǎng)或紗布濾過(guò)，合成培養(yǎng)基加蛋白酶消化，無(wú)菌紗網(wǎng)或紗布濾過(guò)，合成培養(yǎng)基加10小牛小牛(或馬或馬)血清培養(yǎng)，血清培養(yǎng)，為促進(jìn)分化可加為促進(jìn)分化可加

31、1 的的胎汁；胎汁；(3)接種：接種：細(xì)胞接種量為細(xì)胞接種量為2106/皿；接種在膠原或明皿；接種在膠原或明膠的底物上能促進(jìn)細(xì)胞分化。膠的底物上能促進(jìn)細(xì)胞分化。v明膠制備比較簡(jiǎn)單，常用明膠制備比較簡(jiǎn)單，常用hanks 液配的液配的0.01明明膠。膠。v生長(zhǎng)特點(diǎn)：生長(zhǎng)特點(diǎn)：細(xì)胞生長(zhǎng)開(kāi)始呈紡錘形，培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)開(kāi)始呈紡錘形，培養(yǎng)50 52 小時(shí)后將出現(xiàn)融合形成肌細(xì)胞狀多核纖維。數(shù)日小時(shí)后將出現(xiàn)融合形成肌細(xì)胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止，此時(shí)能觀(guān)察到橫紋。一般在融合后后融合停止，此時(shí)能觀(guān)察到橫紋。一般在融合后二三天內(nèi)能見(jiàn)到收縮現(xiàn)象；因收縮運(yùn)動(dòng)有時(shí)可導(dǎo)二三天內(nèi)能見(jiàn)到收縮現(xiàn)象；因收縮運(yùn)動(dòng)有時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞從底物

32、脫離。致細(xì)胞從底物脫離。(二) 心肌細(xì)胞培養(yǎng)v最常用材料：最常用材料：v雞胚心肌、小鼠、大鼠以及人胎兒心肌等都雞胚心肌、小鼠、大鼠以及人胎兒心肌等都可應(yīng)用可應(yīng)用。v心肌是比較容易培養(yǎng)和生長(zhǎng)的組織，可應(yīng)用心肌是比較容易培養(yǎng)和生長(zhǎng)的組織，可應(yīng)用多種方法進(jìn)行培養(yǎng)，如多種方法進(jìn)行培養(yǎng)，如懸滴培養(yǎng)、組織塊培懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法養(yǎng)和消化培養(yǎng)法等，主要取等，主要取心室肌心室肌培養(yǎng)，均培養(yǎng)，均能獲得良好的生長(zhǎng)效果。能獲得良好的生長(zhǎng)效果。v程序程序(1) 選新鮮受精雞卵，置溫箱中孵育選新鮮受精雞卵，置溫箱中孵育(溫箱中放有水槽，以維持溫箱中放有水槽，以維持箱內(nèi)濕度箱內(nèi)濕度)；每日翻動(dòng)一次；每日翻動(dòng)一

33、次(180 度度)，孵育，孵育9 12 天；天；(2) 取雞胎；取雞胎；(3) 用眼科剪剪開(kāi)胸腔，剝出心臟，置入皿中用用眼科剪剪開(kāi)胸腔，剝出心臟，置入皿中用hanks 液漂洗液漂洗1 2 次；次；(4) 小心剪除大的動(dòng)靜脈，保留心室?。挥眯⌒募舫蟮膭?dòng)靜脈，保留心室?。挥媒M織塊或消化培養(yǎng)組織塊或消化培養(yǎng)法均可法均可。初代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形，。初代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形，v純化及生長(zhǎng)特點(diǎn)：純化及生長(zhǎng)特點(diǎn)：常雜有成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞；常雜有成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞；心肌細(xì)胞心肌細(xì)胞亦較其它成分貼壁慢，可反復(fù)貼壁法排除其它細(xì)胞成分。在亦較其它成分貼壁慢，可反復(fù)貼壁法排除其它細(xì)胞成分。在培養(yǎng)成功時(shí)，相

34、差顯微鏡下可觀(guān)察到橫紋；一周后便可出現(xiàn)培養(yǎng)成功時(shí)，相差顯微鏡下可觀(guān)察到橫紋；一周后便可出現(xiàn)節(jié)律性收縮現(xiàn)象。節(jié)律性收縮現(xiàn)象。乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)四、神經(jīng)組織細(xì)胞培養(yǎng)四、神經(jīng)組織細(xì)胞培養(yǎng)v神經(jīng)組織主要由兩種神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)組織主要由兩種神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元和神經(jīng)膠神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞）組成。質(zhì)細(xì)胞）組成。v神經(jīng)元為高度分化的細(xì)胞，在組織發(fā)生晚期已神經(jīng)元為高度分化的細(xì)胞，在組織發(fā)生晚期已失掉增殖能力，對(duì)生存條件要求高，失掉增殖能力，對(duì)生存條件要求高，只有在適只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或在加入神宜情況下，如接種在膠原底層上，或在加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子經(jīng)生長(zhǎng)因子(ngf) 和膠質(zhì)細(xì)胞因

35、子時(shí)，才能生和膠質(zhì)細(xì)胞因子時(shí)，才能生存，并可能出現(xiàn)一定程度的分化現(xiàn)象，如長(zhǎng)出存，并可能出現(xiàn)一定程度的分化現(xiàn)象，如長(zhǎng)出突起等，但卻難使之增殖；突起等，但卻難使之增殖；即使培養(yǎng)胚胎組織即使培養(yǎng)胚胎組織情況也是如此。情況也是如此。v神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為較易培養(yǎng)成分，它分少突、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為較易培養(yǎng)成分，它分少突、星形和小膠質(zhì)三種星形和小膠質(zhì)三種。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元有共存關(guān)系。有共存關(guān)系。人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞大鼠大鼠c6膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)細(xì)胞v(一一) 初代培養(yǎng)初代培養(yǎng) 神經(jīng)元能發(fā)生一定分化現(xiàn)象，如生長(zhǎng)突起，神經(jīng)元能發(fā)生一定分化現(xiàn)象，如生長(zhǎng)突起，但因無(wú)增殖能力，最后衰退死亡；但神經(jīng)膠

36、但因無(wú)增殖能力，最后衰退死亡；但神經(jīng)膠質(zhì)尤以星形細(xì)胞能繼續(xù)生存和分裂增殖。質(zhì)尤以星形細(xì)胞能繼續(xù)生存和分裂增殖。v(二二) 傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng) 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。不僅能獲得生長(zhǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞并可形成成分。不僅能獲得生長(zhǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞并可形成能傳代的二倍體細(xì)胞系。能傳代的二倍體細(xì)胞系。(三三) 培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法v人腦組織可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)組織來(lái)自人腦組織可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)組織來(lái)自手術(shù)室無(wú)菌取腦髓灰質(zhì)或白質(zhì)均可用于培養(yǎng)，手術(shù)室無(wú)菌取腦髓灰質(zhì)或白質(zhì)均可用于培養(yǎng)，1程序：程序：(1) 細(xì)胞懸液制備：細(xì)胞懸液制備：獲取腦組織后，先仔

37、細(xì)剝除腦膜獲取腦組織后，先仔細(xì)剝除腦膜和血管等纖維成分，置入和血管等纖維成分，置入hanks 液中漂洗液中漂洗1 2 次次后，置于后，置于30 50倍的倍的hanks 液中；腦組織比較柔液中；腦組織比較柔軟，反復(fù)吹打即可制備成細(xì)胞懸液；軟，反復(fù)吹打即可制備成細(xì)胞懸液；(2) 排除脂肪成分和其它碎塊排除脂肪成分和其它碎塊：把懸液注入離心管中，：把懸液注入離心管中，在室溫直立在室溫直立5 10 分鐘后，細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊自然下分鐘后，細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊自然下沉，脂肪等雜物易漂浮于懸液表層，吸除上清，如沉，脂肪等雜物易漂浮于懸液表層，吸除上清，如此反復(fù)二三次可獲較多的細(xì)胞成分；此反復(fù)二三次可獲較多的細(xì)胞成分

38、；(3)濾過(guò)、計(jì)數(shù)、接種：濾過(guò)、計(jì)數(shù)、接種：向末次沉降物中加入適向末次沉降物中加入適量營(yíng)養(yǎng)液，通過(guò)紗網(wǎng)或紗布濾過(guò)，計(jì)數(shù)細(xì)胞量營(yíng)養(yǎng)液，通過(guò)紗網(wǎng)或紗布濾過(guò)，計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)整好細(xì)胞密度，接種入培養(yǎng)瓶或皿中，并調(diào)整好細(xì)胞密度，接種入培養(yǎng)瓶或皿中，置置5c02 溫箱中培養(yǎng)；溫箱中培養(yǎng)；(4)傳代：傳代：細(xì)胞生長(zhǎng)匯合后，可用細(xì)胞生長(zhǎng)匯合后，可用0.25胰蛋白胰蛋白酶消化法做傳代處理。酶消化法做傳代處理。2生長(zhǎng)特點(diǎn)：生長(zhǎng)特點(diǎn)：v接種后初期，細(xì)胞可能出現(xiàn)飄浮不貼壁現(xiàn)象，接種后初期，細(xì)胞可能出現(xiàn)飄浮不貼壁現(xiàn)象，貼壁后在短期內(nèi)也可能不見(jiàn)細(xì)胞分裂現(xiàn)象；貼壁后在短期內(nèi)也可能不見(jiàn)細(xì)胞分裂現(xiàn)象；細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境過(guò)程較長(zhǎng)，然而一

39、旦生長(zhǎng)后，細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境過(guò)程較長(zhǎng)，然而一旦生長(zhǎng)后，即能進(jìn)入較旺盛的增殖狀態(tài)。即能進(jìn)入較旺盛的增殖狀態(tài)。v生長(zhǎng)開(kāi)始常雜有巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上生長(zhǎng)開(kāi)始常雜有巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞等，傳二、三代后，這些成分即消失，皮細(xì)胞等，傳二、三代后，這些成分即消失，逐漸形成均一的星形膠質(zhì)細(xì)胞，一般形成連逐漸形成均一的星形膠質(zhì)細(xì)胞，一般形成連接不甚緊密的單層細(xì)胞接不甚緊密的單層細(xì)胞第二節(jié)第二節(jié) 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)v腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞，當(dāng)前建立先癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞，當(dāng)前建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是最多的。的細(xì)胞

40、系中癌細(xì)胞系是最多的。v腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機(jī)理、抗癌藥檢測(cè)、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機(jī)理、抗癌藥檢測(cè)、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。癌分子生物學(xué)極其重要的手段。培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法v腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個(gè)方的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個(gè)方面。面。v初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。一、要點(diǎn)一、要點(diǎn)1取材：取材：v人腫瘤細(xì)胞來(lái)自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材時(shí)人腫瘤細(xì)胞來(lái)自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材時(shí)盡量避免用退變組織，要盡量避免用退變組織，要挑選活力較好

41、的部位。挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。2培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：v腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格，一腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格，一般常用的般常用的rpmi l640、dmem、mc-coy5a 等培等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞對(duì)血清養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞對(duì)血清的需求比正常細(xì)胞低，正常細(xì)胞培養(yǎng)不加血清不的需求比正常細(xì)胞低，正常細(xì)胞培養(yǎng)不加血清不能生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長(zhǎng)。能生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大。腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大。v培養(yǎng)腫

42、瘤細(xì)胞仍需加血清和相關(guān)生長(zhǎng)因子培養(yǎng)更培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞仍需加血清和相關(guān)生長(zhǎng)因子培養(yǎng)更易成功。易成功。3成纖維細(xì)胞的排除：成纖維細(xì)胞的排除：v成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時(shí)混雜生長(zhǎng)，致成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時(shí)混雜生長(zhǎng)，致難以純化腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫難以純化腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)得快，最終能壓制腫瘤細(xì)胞的生瘤細(xì)胞生長(zhǎng)得快，最終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)長(zhǎng)。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。中的關(guān)鍵。成纖維細(xì)胞排除法1機(jī)械刮除法：機(jī)械刮除法：v是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插以不用膠塞剪成三角形插

43、以不銹鋼絲銹鋼絲)，或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備，或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用用(也可用特制電熱燒灼器刮除也可用特制電熱燒灼器刮除)。刮除程序?yàn)椋?。刮除程序?yàn)椋?1) 標(biāo)記：鏡下觀(guān)察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長(zhǎng)標(biāo)記：鏡下觀(guān)察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的部位；腫瘤細(xì)胞的部位；(2) 刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無(wú)菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無(wú)菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無(wú)標(biāo)記空間；鏡窺視下，刮除無(wú)標(biāo)記空間；(3) 用用hanks 液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細(xì)胞；液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細(xì)胞；(5) 注入培養(yǎng)液繼續(xù)

44、培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至完全除掉為止。復(fù)刮除至完全除掉為止。2反復(fù)貼壁法：反復(fù)貼壁法：v根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結(jié)合使用不加血清的營(yíng)養(yǎng)液，并結(jié)合使用不加血清的營(yíng)養(yǎng)液， (1) 細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，消化后，hanks 沖洗沖洗2 次，加入不含血清的培養(yǎng)次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液；液，吹打制成細(xì)胞懸液；(2) 編號(hào)為編號(hào)為a、b、c 三個(gè)培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種三個(gè)培養(yǎng)瓶；首先把懸液

45、接種入入a 培養(yǎng)瓶中，置溫箱中靜止培養(yǎng)培養(yǎng)瓶中，置溫箱中靜止培養(yǎng)520 分鐘后，分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入部培養(yǎng)液，再接種入b 培養(yǎng)瓶中后；向培養(yǎng)瓶中后；向a 瓶中補(bǔ)瓶中補(bǔ)充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；(3) b瓶中細(xì)胞瓶中細(xì)胞520 分鐘后，按處理分鐘后，按處理a 的方法，把的方法，把培養(yǎng)液注入培養(yǎng)液注入c 培養(yǎng)瓶中；再向培養(yǎng)瓶中；再向b 瓶中補(bǔ)加完全培瓶中補(bǔ)加完全培養(yǎng)基。養(yǎng)基。v當(dāng)三個(gè)瓶?jī)?nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼當(dāng)三個(gè)瓶?jī)?nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀(guān)察可見(jiàn)續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀(guān)察可見(jiàn)a 瓶主瓶主要為成纖維細(xì)胞，要為成纖維細(xì)胞，b 瓶?jī)深?lèi)細(xì)胞相雜，瓶?jī)深?lèi)細(xì)胞相雜，c 瓶瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時(shí)可反復(fù)處理多次，可能主要為癌細(xì)胞。必要時(shí)可反復(fù)處理多次，直至癌細(xì)胞純化為止。直至癌細(xì)胞純化為止。3消化排除法：消化排除法：(