王鏡巖生物化學(xué)筆記

1、第一章 蛋白質(zhì)化學(xué)教學(xué)目標(biāo)：1.掌握蛋白質(zhì)的概念、重要性和分子組成。2.掌握-氨基酸的結(jié)構(gòu)通式和20種氨基酸的名稱、符號(hào)、結(jié)構(gòu)、分類；掌握氨基酸的重要性質(zhì)；熟悉肽和活性肽的概念。3.掌握蛋白質(zhì)的一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)及其重要化學(xué)鍵。4.了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系。5.熟悉蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)和分類導(dǎo)入：100年前，恩格斯指出“蛋白體是生命的存在形式”；今天人們?nèi)绾握J(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的概念和重要性？ 1839年荷蘭化學(xué)家馬爾德（G.J.Mulder）研究了乳和蛋中的清蛋白,并按瑞典化學(xué)家Berzelius的提議把提取的物質(zhì)命名為蛋白質(zhì)（Protein，源自希臘語，意指 “第一重要的” ）。德國化學(xué)家費(fèi)

2、希爾(E.Fischer)研究了蛋白質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)，在1907年奠立蛋白質(zhì)化學(xué)。英國的鮑林(L.Pauling)在1951年推引出蛋白質(zhì)的螺旋；桑格(F.Sanger)在1953年測(cè)出胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)。佩魯茨(M.F.Perutz)和肯德魯(J.C.kendrew) 在1960年測(cè)定血紅蛋白和肌紅蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。1965年，我國生化學(xué)者首先合成了具有生物活性的蛋白質(zhì)胰島素（insulin）。 蛋白質(zhì)是由L-氨基酸通過肽鍵縮合而成的，具有較穩(wěn)定的構(gòu)象和一定生物功能的生物大分子（biomacromolecule）。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)所依賴的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生物體中含量最豐富的大分子。單細(xì)胞的大腸桿菌含有

3、3000多種蛋白質(zhì)，而人體有10萬種以上結(jié)構(gòu)和功能各異的蛋白質(zhì)，人體干重的45%是蛋白質(zhì)。生命是物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的高級(jí)形式，是通過蛋白質(zhì)的多種功能來實(shí)現(xiàn)的。新陳代謝的所有的化學(xué)反應(yīng)幾乎都是在酶的催化下進(jìn)行的，已發(fā)現(xiàn)的酶絕大多數(shù)是蛋白質(zhì)。生命活動(dòng)所需要的許多小分子物質(zhì)和離子，它們的運(yùn)輸由蛋白質(zhì)來完成。生物的運(yùn)動(dòng)、生物體的防御體系離不開蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在遺傳信息的控制、細(xì)胞膜的通透性，以及高等動(dòng)物的記憶、識(shí)別機(jī)構(gòu)等方面都起著重要的作用。隨著蛋白質(zhì)工程和蛋白質(zhì)組學(xué)的興起和發(fā)展，人們對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識(shí)越來越深刻。第一節(jié) 蛋白質(zhì)的分子組成一、蛋白質(zhì)的元素組成經(jīng)元素分析，主要有 C（50%55%）、H（6%

4、7%）、O（19%24%）、N（13%19%）、S（0%4%）。有些蛋白質(zhì)還含微量的P、Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo、I等。各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16%。因此，可以用定氮法來推算樣品中蛋白質(zhì)的大致含量。 每克樣品含氮克數(shù)×6.25×100=100g樣品中蛋白質(zhì)含量（g%）二、蛋白質(zhì)的基本組成單位氨基酸蛋白質(zhì)在酸、堿或蛋白酶的作用下，最終水解為游離氨基酸（amino acid），即蛋白質(zhì)組成單體或構(gòu)件分子。存在于自然界中的氨基酸有300余種，但合成蛋白質(zhì)的氨基酸僅20種（稱編碼氨基酸），最先發(fā)現(xiàn)的是天門冬氨酸（1806年），最后鑒定的是蘇氨酸（1938年）。（

5、一）氨基酸的結(jié)構(gòu)通式組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸有共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1氨基連接在- C上，屬于-氨基酸（脯氨酸為-亞氨基酸）。2R是側(cè)鏈，除甘氨酸外都含手性C，有D-型和L-型兩種立體異構(gòu)體。天然蛋白質(zhì)中的氨基酸都是L-型。 注意：構(gòu)型是指分子中各原子的特定空間排布，其變化要求共價(jià)鍵的斷裂和重新形成。旋光性是異構(gòu)體的光學(xué)活性，是使偏振光平面向左或向右旋轉(zhuǎn)的性質(zhì)，（-）表示左旋，（+）表示右旋。構(gòu)型與旋光性沒有直接對(duì)應(yīng)關(guān)系。（二）氨基酸的分類1按R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)分為脂肪族、芳香族、雜環(huán)、雜環(huán)亞氨基酸四類。2按R基的極性和在中性溶液的解離狀態(tài)分為非極性氨基酸、極性不帶電荷、極性帶負(fù)電荷或帶正電荷的四類。

6、帶有非極性R（烴基、甲硫基、吲哚環(huán)等，共9種）：甘（Gly）、丙（Ala）、纈（Val）、亮（Leu）、異亮（Ile）、苯丙（Phe）、甲硫（Met）、脯（Pro）、色（Trp） 帶有不可解離的極性R（羥基、巰基、酰胺基等，共6種）：絲（Ser）、蘇（Thr）、天胺（Asn）、谷胺（Gln）、酪（Tyr）、半（Cys）帶有可解離的極性R基（共5種）：天（Asp）、谷（Glu）、賴（Lys）、精（Arg）、組（His），前兩個(gè)為酸性氨基酸，后三個(gè)是堿性氨基酸。蛋白質(zhì)分子中的胱氨酸是兩個(gè)半胱氨酸脫氫后以二硫鍵結(jié)合而成，膠原蛋白中的羥脯氨酸、羥賴氨酸，凝血酶原中的羧基谷氨酸是蛋白質(zhì)加工修飾而成。（三

7、）氨基酸的重要理化性質(zhì) 1一般物理性質(zhì)-氨基酸為無色晶體，熔點(diǎn)一般在200 oC以上。各種氨基酸在水中的溶解度差別很大（酪氨酸不溶于水）。一般溶解于稀酸或稀堿，但不能溶解于有機(jī)溶劑，通常酒精能把氨基酸從其溶液中沉淀析出。芳香族氨基酸（Tyr、Trp、Phe）有共軛雙鍵，在近紫外區(qū)有光吸收能力，Tyr、Trp的吸收峰在280nm，Phe在265 nm。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)含Tyr、Trp殘基，所以測(cè)定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值，是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡(jiǎn)便的方法。2兩性解離和等電點(diǎn)（isoelectric point, pI） 氨基酸在水溶液或晶體狀態(tài)時(shí)以兩性離子的形式存在，既可作為酸（質(zhì)子

8、供體），又可作為堿（質(zhì)子受體）起作用，是兩性電解質(zhì)，其解離度與溶液的pH有關(guān)。 在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢(shì)和程度相等，成為兼性離子，呈電中性，此時(shí)溶液的pH稱為該氨基酸的等電點(diǎn)。氨基酸的pI是由-羧基和-氨基的解離常數(shù)的負(fù)對(duì)數(shù)pK1和pK2決定的。計(jì)算公式為：pI=1/2(pK1+ pK2)。若1個(gè)氨基酸有3個(gè)可解離基團(tuán)，寫出它們電離式后取兼性離子兩邊的pK值的平均值，即為此氨基酸的等電點(diǎn)（酸性氨基酸的等電點(diǎn)取兩羧基的pK值的平均值，堿性氨基酸的等電點(diǎn)取兩氨基的pK值的平均值）。3氨基酸的化學(xué)反應(yīng) 氨基酸的化學(xué)反應(yīng)是其基團(tuán)的特征性反應(yīng)。重要的有：（1）茚三酮反應(yīng) 所有

9、具有自由-氨基的氨基酸與過量茚三酮共熱形成藍(lán)紫色化合物（脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)）。用分光光度法可定量測(cè)定微量的氨基酸。藍(lán)紫色化合物的最大吸收峰在570nm波長處，黃色在440nm波長下測(cè)定。吸收峰值的大小與氨基酸釋放的氨量成正比。 （2）與2，4-二硝基氟苯（DNFB）的反應(yīng) 在弱堿性溶液中，氨基酸的-氨基很容易與DNFB作用生成穩(wěn)定的黃色2，4-二硝基苯氨基酸（DNP-氨基酸），這一反應(yīng)在蛋白質(zhì)化學(xué)的研究史上起過重要作用，Sanger等人應(yīng)用它測(cè)定胰島素一級(jí)結(jié)構(gòu)。多肽順序自動(dòng)分析儀是根據(jù)相類似的原理設(shè)計(jì)的，即利用多肽鏈N端氨基酸的-氨基與異硫氰酸苯酯PITC反應(yīng)（Edman

10、降解法）。三、肽（peptide）1肽鍵與肽鏈一個(gè)氨基酸的-羧基和另一個(gè)氨基酸的-氨基脫水形成的酰胺鍵稱為肽鍵。由氨基酸通過肽鍵相連而成的化合物稱為肽。肽鍵及其兩端的-碳原子相連所形成的長鏈骨架，即CCNCCNCCNC稱為多肽主鏈，CCN是重復(fù)單位。肽鍵是蛋白質(zhì)分子中的主要共價(jià)鍵。多肽鏈的方向性是從N末端指向C末端。肽分子中不完整的氨基酸稱為氨基酸殘基。肽按其序列從N端到C端命名。一般10肽以下屬寡肽，10肽以上為多肽。2生物活性肽（1）谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由Glu、Cys、Gly組成的一種三肽，又叫-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸（含-肽鍵）。Cys的-SH是主要功能基團(tuán)，GS

11、H是一種抗氧化劑，是某些酶的輔酶，可保護(hù)蛋白質(zhì)分子中的-SH免遭氧化，保護(hù)巰基蛋白和酶的活性。在GSH過氧化物酶的作用下，GSH還原細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的H2O2，生成H2O，2分子GSH被氧化成GSSG，后者在GSH還原酶催化下，又生成GSH。 （2）多肽類激素和神經(jīng)肽人體內(nèi)有許多激素屬寡肽或多肽，如下丘腦垂體分泌的催產(chǎn)素（9肽）、加壓素（9肽）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH，39肽）等。催產(chǎn)素和加壓素結(jié)構(gòu)僅第3、第8位兩個(gè)氨基酸殘基不同，前者使平滑肌收縮，有催產(chǎn)和使乳腺泌乳的作用；后者能使小動(dòng)脈收縮，增高血壓，也有減少排尿的作用。神經(jīng)肽是在神經(jīng)傳導(dǎo)過程中起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的肽類。如腦啡肽（5肽）、-內(nèi)啡肽

12、（31肽）、強(qiáng)啡肽（17肽）等。隨著腦科學(xué)的發(fā)展，會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的生物活性肽。第二節(jié) 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是生物大分子，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，人們用4個(gè)層次來描述，包括蛋白質(zhì)的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。一級(jí)結(jié)構(gòu)描述的是蛋白質(zhì)的線性（或一維）結(jié)構(gòu)，即共價(jià)連接的氨基酸殘基的序列，又稱初級(jí)或化學(xué)結(jié)構(gòu)。二級(jí)以上的結(jié)構(gòu)稱高級(jí)結(jié)構(gòu)或構(gòu)象（conformation）。一、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（primary structure）1953年，英國科學(xué)家F. Sanger首先測(cè)定了胰島素（insulin）的一級(jí)結(jié)構(gòu)，有51個(gè)氨基酸殘基，由一條A鏈和一條B鏈組成，分子中共有3個(gè)二硫鍵，其中兩個(gè)在A、B鏈之間，另一個(gè)在A鏈內(nèi)。

13、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定或稱序列分析常用的方法是Edman降解和重組DNA法。Edman降解是經(jīng)典的化學(xué)方法，比較復(fù)雜。首先要純化一定量的待測(cè)蛋白質(zhì)，分別作分子量測(cè)定、氨基酸組成分析、N-末端分析、C-末端分析；要應(yīng)用不同的化學(xué)試劑或特異的蛋白內(nèi)切酶水解將蛋白質(zhì)裂解成大小不同的肽段，測(cè)出它們的序列，對(duì)照不同水解制成的兩套肽段，找出重疊片段，最后推斷蛋白質(zhì)的完整序列。重組DNA法是基于分子克隆的分子生物學(xué)方法，比較簡(jiǎn)單而高效，不必先純化該種蛋白質(zhì)，而是先要得到編碼該種蛋白質(zhì)的基因（DNA片段），測(cè)定DNA中核苷酸的序列，再按三個(gè)核苷酸編碼一個(gè)氨基酸的原則推測(cè)蛋白質(zhì)的完整序列。這兩種方法可以相互印證和

14、補(bǔ)充。目前，國際互聯(lián)網(wǎng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫已有3千多種一級(jí)結(jié)構(gòu)清楚。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。二、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)（secondary structure）蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指其分子中主鏈原子的局部空間排列，是主鏈構(gòu)象（不包括側(cè)鏈R基團(tuán)）。構(gòu)象是分子中原子的空間排列，但這些原子的排列取決于它們繞鍵的旋轉(zhuǎn)，構(gòu)象不同于構(gòu)型，一個(gè)蛋白質(zhì)的構(gòu)象在不破壞共價(jià)鍵情況下是可以改變的。但是蛋白質(zhì)中任一氨基酸殘基的實(shí)際構(gòu)象自由度是非常有限的，在生理?xiàng)l件下，每種蛋白質(zhì)似乎是呈現(xiàn)出稱為天然構(gòu)象的單一穩(wěn)定形狀。20世紀(jì)30年代末，L.Panling 和R.B.Corey應(yīng)用X射線衍射分析測(cè)定了一些氨基酸

15、和寡肽的晶體結(jié)構(gòu)，獲得了一組標(biāo)準(zhǔn)鍵長和鍵角，提出了肽單元（peptide unit）的概念, 還提出了兩種主鏈原子的局部空間排列的分子模型（-螺旋）和（-折疊）。1肽單位 肽鍵及其兩端的-C共6個(gè)原子處于同一平面上，組成了肽單位（所在的平面稱肽鍵平面）。肽鍵CN鍵長為0.132nm，比相鄰的單鍵（0.147nm）短，而較C=N雙鍵（0.128nm）長，有部分雙鍵的性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。肽鍵平面上各原子呈順反異構(gòu)關(guān)系，肽鍵平面上的O、H以及2個(gè)-碳原子為反式構(gòu)型（trans configuration）。主鏈中的CC和CN單鍵可以旋轉(zhuǎn)，其旋轉(zhuǎn)角、決定了兩個(gè)相鄰的肽鍵平面相對(duì)關(guān)系。由于肽鍵平面的相對(duì)

16、旋轉(zhuǎn)，使主鏈可以以非常多的構(gòu)象出現(xiàn)。事實(shí)上，肽鏈在構(gòu)象上受到很大限制，因?yàn)橹麈溕嫌?/3不能自由旋轉(zhuǎn)的肽鍵，另外主鏈上有很多側(cè)鏈R的影響。蛋白質(zhì)的主鏈骨架由許多肽鍵平面連接而成。2.-螺旋(-helix) -螺旋是肽鍵平面通過-碳原子的相對(duì)旋轉(zhuǎn)形成的一種緊密螺旋盤繞，是有周期的一種主鏈構(gòu)象。其特點(diǎn)是： 螺旋每轉(zhuǎn)一圈上升3.6個(gè)氨基酸殘基，螺距約0.54nm（每個(gè)殘基上升0.15nm，旋轉(zhuǎn)100O）。 相鄰的螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵，氫鍵的取向幾乎與中心軸平行。典型-螺旋一對(duì)氫鍵O與N之間共有13個(gè)原子（3.613），前后間隔3個(gè)殘基。螺旋的走向絕大部分是右手螺旋，殘基側(cè)鏈伸向外側(cè)。R基團(tuán)的大小、荷

17、電狀態(tài)及形狀均對(duì)-螺旋的形成及穩(wěn)定有影響。3.-折疊(-pleated sheet) -折疊是一種肽鏈相當(dāng)伸展的周期性結(jié)構(gòu)。 相鄰肽鍵平面間折疊成110O角，呈鋸齒狀。 兩個(gè)以上具-折疊的肽鏈或同一肽鏈內(nèi)不同肽段相互平行排列，形成-折疊片層，其穩(wěn)定因素是肽鏈間的氫鍵。 逆向平行的片層結(jié)構(gòu)比順向平行的穩(wěn)定。-螺旋和-折疊是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式。毛發(fā)中的-角蛋白和蠶絲中的絲心蛋白是其典型，在許多球蛋白中也存在，但所占比例不一樣。膠原蛋白中存在的螺旋結(jié)構(gòu)不同于一般的-螺旋，是由3條具有左手螺旋的鏈相互纏繞形成右手超螺旋分子。鏈間氫鍵以及螺旋和超螺旋的反向盤繞維持其穩(wěn)定性。4-轉(zhuǎn)角（-turn）為

18、了緊緊折疊成球蛋白的緊密形狀，多肽鏈180O回折成發(fā)夾或-轉(zhuǎn)角。其處由4個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基構(gòu)成，常有Gly和Pro存在，穩(wěn)定-轉(zhuǎn)角的作用力是第一個(gè)氨基酸殘基羰基氧（O）與第四個(gè)氨基酸殘基的氨基氫（H）之間形成的氫鍵。-轉(zhuǎn)角常見于連接反平行-折疊片的端頭。5無規(guī)卷曲（random coil）多肽鏈的主鏈呈現(xiàn)無確定規(guī)律的卷曲。典型球蛋白大約一半多肽鏈?zhǔn)沁@樣的構(gòu)象。6超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)二級(jí)至三級(jí)結(jié)構(gòu)層次的一種過渡態(tài)構(gòu)象。超二級(jí)結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)中兩個(gè)或三個(gè)具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的肽段在空間上相互接近，形成一特殊的組合體，又稱為模體（motif）。通常有，等，例如鈣結(jié)合蛋白質(zhì)中的螺旋-環(huán)-螺

19、旋模序及鋅指結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位，是在超二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步繞曲折疊有獨(dú)特構(gòu)象和部分生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)。對(duì)于較小的蛋白質(zhì)分子或亞基，結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)是一個(gè)意思，即這些蛋白質(zhì)是單結(jié)構(gòu)域的；對(duì)于較大的蛋白質(zhì)分子或亞基，多肽鏈往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上的相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域締合成三級(jí)結(jié)構(gòu)。三、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)（tertiary structure）指一條多肽鏈中所有原子的整體排布，包括主鏈和側(cè)鏈。維系三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力主要是次級(jí)鍵（疏水相互作用、靜電力、氫鍵等）。在序列中相隔較遠(yuǎn)的氨基酸疏水側(cè)鏈相互靠近，形成“洞穴”或“口袋”狀結(jié)構(gòu)，結(jié)合蛋白質(zhì)的輔基往往鑲嵌其內(nèi)，形成功能活性部位，而親水基團(tuán)則在外，

20、這也是球狀蛋白質(zhì)易溶于水的原因。1963年Kendrew等從鯨肌紅蛋白的X射線衍射圖譜測(cè)定它的三級(jí)結(jié)構(gòu)（153個(gè)氨基酸殘基和一個(gè)血紅素輔基，相對(duì)分子質(zhì)量為17800）。由AH 8段-螺旋盤繞折疊成球狀，氨基酸殘基上的疏水側(cè)鏈大都在分子內(nèi)部形成一個(gè)袋形空穴，血紅素居于其中，富有極性及電荷的則在分子表面形成親水的球狀蛋白。四、蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu) (quaternary structure)有些蛋白質(zhì)的分子量很大，由2條或2條以上具有獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈通過非共價(jià)鍵相互結(jié)合而成，稱為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。構(gòu)成四級(jí)結(jié)構(gòu)的每條多肽鏈稱為亞基 (subunit)，亞基單獨(dú)存在時(shí)一般沒有生物學(xué)功能，構(gòu)成四級(jí)結(jié)構(gòu)的

21、幾個(gè)亞基可以相同或不同。如血紅蛋白(hemoglobin,Hb) 是由兩個(gè)-亞基和兩個(gè)-亞基形成的四聚體（22）。五、蛋白質(zhì)分子中的化學(xué)鍵蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是由共價(jià)鍵形成的，如肽鍵和二硫鍵。而維持空間構(gòu)象穩(wěn)定的是非共價(jià)的次級(jí)鍵。如氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、范德華引力等。第三節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ) 20世紀(jì)60年代初，美國科學(xué)家C.Anfinsen進(jìn)行牛胰核糖核酸酶的變性和復(fù)性實(shí)驗(yàn)，提出了蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu)的命題。核糖核酸酶由124個(gè)氨基酸殘基組成，有4對(duì)二硫鍵。用尿素和-巰基乙醇處理該酶溶液，分別破壞次級(jí)鍵和二硫鍵，肽鏈完全伸展，

22、變性的酶失去催化活性；當(dāng)用透析方法去除變性劑后，酶活性幾乎完全恢復(fù)，理化性質(zhì)也與天然的酶一樣。 概率計(jì)算表明，8個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合成4對(duì)二硫鍵，可隨機(jī)組合成105種配對(duì)方式，而事實(shí)上只形成了天然酶的構(gòu)象，這說明一級(jí)結(jié)構(gòu)未破壞，保持了氨基酸的排列順序就可能回復(fù)到原來的三級(jí)結(jié)構(gòu)，功能依然存在。（二）種屬差異 大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，一級(jí)結(jié)構(gòu)相似的多肽或蛋白質(zhì)，其空間結(jié)構(gòu)和功能也相似，不同種屬的同源蛋白質(zhì)有同源序列，反映其共同進(jìn)化起源，通過比較可以揭示進(jìn)化關(guān)系。 例如哺乳動(dòng)物的胰島素，其一級(jí)結(jié)構(gòu)僅個(gè)別氨基酸差異（A鏈5、6、10位，B鏈30位），它們對(duì)生物活性調(diào)節(jié)糖代謝的生理功能不起決定作用。從各種生物的

23、細(xì)胞色素C(cytochrome c ) 的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析，可以了解物種進(jìn)化間的關(guān)系。進(jìn)化中越接近的生物，它們的細(xì)胞色素c的一級(jí)結(jié)構(gòu)越近似。（三）分子病分子病是指機(jī)體DNA分子上基因缺陷引起mRNA分子異常和蛋白質(zhì)生物合成的異常，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體某些功能和結(jié)構(gòu)隨之變異的遺傳病。在1904年，發(fā)現(xiàn)鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病。大約花費(fèi)了40多年才清楚患病原因，患者的血紅蛋白（HbS）與正常人的（HbA）相比，僅-鏈的第6位上，Val取代了正常的Glu。目前全世界已發(fā)現(xiàn)有異常血紅蛋白400種以上。二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，空間結(jié)構(gòu)變化，其功能也隨之改變。肌紅蛋白（Mb）和

24、血紅蛋白（Hb）是典型的例子。肌紅蛋白（Mb）和血紅蛋白（Hb）都能與氧進(jìn)行可逆的結(jié)合，氧結(jié)合在血紅素輔基上。然而Hb是四聚體分子，可以轉(zhuǎn)運(yùn)氧；Mb是單體，可以儲(chǔ)存氧，并且可以使氧在肌肉內(nèi)很容易地?cái)U(kuò)散。它們的氧合曲線不同，Mb為一條雙曲線，Hb是一條 S型曲線。在低p(O2)下，肌紅蛋白比血紅蛋白對(duì)氧親和性高很多，p(O2)為2.8torr(1torr133.3Pa)時(shí)，肌紅蛋白處于半飽和狀態(tài)。在高p(O2)下，如在肺部（大約100torr）時(shí)，兩者幾乎都被飽和。其差異形成一個(gè)有效的將氧從肺轉(zhuǎn)運(yùn)到肌肉的氧轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。Hb未與氧結(jié)合時(shí)，其亞基處于一種空間結(jié)構(gòu)緊密的構(gòu)象（緊張態(tài)，T型），與氧的親和力

25、小。只要有一個(gè)亞基與氧結(jié)合，就能使4個(gè)亞基間的鹽鍵斷裂，變成松弛的構(gòu)象（松弛態(tài)，R型）。T型和R型的相互轉(zhuǎn)換對(duì)調(diào)節(jié)Hb運(yùn)氧的功能有重要作用。一個(gè)亞基與其配體結(jié)合后能促進(jìn)另一亞基與配體的結(jié)合是正協(xié)同效應(yīng)，其理論解釋是Hb是別構(gòu)蛋白，有別構(gòu)效應(yīng)。第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和氨基酸相似，有兩性解離及等電點(diǎn)、紫外吸收和呈色反應(yīng)。作為生物大分子，還有膠體性質(zhì)、沉淀、變性和凝固等特點(diǎn)。要了解和分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系就要利用其特殊的理化性質(zhì)，采取鹽析、透析、電泳、層析及離心等不損傷蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的物理方法分離純化蛋白質(zhì)。一、蛋白質(zhì)的高分子性質(zhì)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量在1萬100萬，其顆粒平均直

26、徑約為4.3 nm（膠粒范圍是1100nm）。準(zhǔn)確可靠的測(cè)定方法是超離心法，蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量可用沉降系數(shù)（S）表示。在球狀蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)形成時(shí)，親水基團(tuán)位于分子表面，在水溶液中與水起水合作用，因此，蛋白質(zhì)的水溶液具有親水膠體的性質(zhì)。顆粒表面的水化膜和電荷是其穩(wěn)定的因素，調(diào)節(jié)pH至pI、加入脫水劑等，蛋白質(zhì)即可從溶液中沉淀出來。透析法是利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的性質(zhì)，去掉小分子物質(zhì)，達(dá)到純化的目的。大小不同的蛋白質(zhì)分子可以通過凝膠過濾分開。又稱分子篩層析。二、蛋白質(zhì)的兩性解離蛋白質(zhì)和氨基酸一樣是兩性電解質(zhì)，在溶液中的荷電狀態(tài)受pH值影響。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨

27、勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。pHpI時(shí)，該蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，反之則帶正電荷。在人體體液中多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)接近pH5，所以在生理pH7.4環(huán)境下，多數(shù)蛋白質(zhì)解離成陰離子。少量蛋白質(zhì)，如魚精蛋白、組蛋白的pI偏于堿性，稱堿性蛋白質(zhì)，而胃蛋白酶和絲蛋白為酸性蛋白。三、蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固蛋白質(zhì)在某些理化因素的作用下，空間結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致理化性質(zhì)改變，生物學(xué)活性喪失，稱為蛋白質(zhì)的變性（denaturation）。蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)是多肽鏈從卷曲到伸展的過程，不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變（如加熱破壞氫鍵，酸堿破壞鹽鍵等）。變性作用不過于劇烈，是一種可逆反應(yīng)，去除

28、變性因素，有些蛋白質(zhì)原有的構(gòu)象和功能可恢復(fù)或部分恢復(fù)，稱為復(fù)性（denaturation）。蛋白質(zhì)變性的主要表現(xiàn)是失去生物學(xué)活性，如酶失去催化能力、血紅蛋白失去運(yùn)輸氧的功能、胰島素失去調(diào)節(jié)血糖的生理功能等。變性蛋白溶解度降低，易形成沉淀析出；易被蛋白水解酶消化。蛋白質(zhì)變性具有重要的實(shí)際意義。蛋白質(zhì)自溶液中析出的現(xiàn)象，稱為蛋白質(zhì)的沉淀。鹽析、有機(jī)溶劑、重金屬鹽、生物堿試劑都可沉淀蛋白質(zhì)。鹽析沉淀蛋白質(zhì)不變性，是分離制備蛋白質(zhì)的常用方法。如血漿中的清蛋白在飽和的硫酸銨溶液中可沉淀，而球蛋白則在半飽和硫酸銨溶液中發(fā)生沉淀。乙醇、丙酮均為脫水劑，可破壞水化膜，降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)的解離程度降低，

29、表面電荷減少，從而使蛋白質(zhì)沉淀析出。低溫時(shí)，用丙酮沉淀蛋白質(zhì)，可保留原有的生物學(xué)活性。但用乙醇，時(shí)間較長則會(huì)導(dǎo)致變性。重金屬鹽（Hg2+、Cu2+、Ag+），生物堿（如三彔乙酸、苦味酸、鞣酸）與蛋白質(zhì)結(jié)合成鹽而沉淀，是不可逆的。蛋白質(zhì)變性不一定沉淀（如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿作用變性后仍然能溶解于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿溶液中，將pH調(diào)至等電點(diǎn)，出現(xiàn)絮狀物，仍可溶解于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿溶液，加熱則變成凝塊，不再溶解）。凝固是蛋白質(zhì)變性發(fā)展的不可逆的結(jié)果。沉淀的蛋白質(zhì)不一定變性（如鹽析）。四、蛋白質(zhì)的紫外吸收和呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)含芳香族氨基酸，在280nm波長處有特征性吸收峰，用于定量測(cè)定。蛋白質(zhì)分子中的多種化學(xué)基團(tuán)具有特定的化學(xué)性能

30、，與某些試劑產(chǎn)生顏色反應(yīng)，可用于定性、定量分析。如蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，在堿性溶液與硫酸銅反應(yīng)產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物（雙縮脲反應(yīng)）。酪氨酸含酚基，與米倫試劑生成白色沉淀，加熱后變紅色。Folin-酚試劑與酪氨酸反應(yīng)生成藍(lán)色。色氨酸與乙醛酸反應(yīng)，慢慢注入濃硫酸，出現(xiàn)紫色環(huán)。第五節(jié) 蛋白質(zhì)的分類自然界蛋白質(zhì)分布廣泛，種類繁多，有10121013種。目前仍無法按蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確的分類，一般按蛋白質(zhì)的分子形狀、分子組成、生物功能進(jìn)行分類。1按分子形狀分為球狀蛋白質(zhì)和纖維狀蛋白質(zhì)。2按分子組成分為簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)和結(jié)合蛋白質(zhì)。簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)完全水解的產(chǎn)物僅為-氨基酸。這類蛋白質(zhì)按其溶解度等

31、理化性質(zhì)分為7類。包括清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、精蛋白、組蛋白和硬蛋白。結(jié)合蛋白質(zhì)由簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)（輔基）組成。根據(jù)輔基的不同，這類蛋白質(zhì)可分為5類。如核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、色蛋白和磷蛋白。細(xì)胞核中的核蛋白是DNA與組蛋白結(jié)合而成，細(xì)胞質(zhì)中的核糖體是RNA與蛋白質(zhì)組成的，已知的病毒也是核蛋白。免疫球蛋白是一類糖蛋白，由蛋白質(zhì)與糖以共價(jià)鍵相連而成；脂蛋白由蛋白質(zhì)與脂類通過非共價(jià)鍵相連，存在生物膜和動(dòng)物血漿中。3按蛋白質(zhì)功能分為活性蛋白質(zhì)和非活性蛋白質(zhì)。活性蛋白質(zhì)包括有催化功能的酶、有調(diào)節(jié)功能的激素、有運(yùn)動(dòng)、防御、接受和傳遞信息的蛋白質(zhì)以及毒蛋白、膜蛋白等。膠原、角蛋白、彈性蛋白、

32、絲心蛋白等是非活性蛋白質(zhì)。第二章 核酸的化學(xué)教學(xué)目標(biāo)：1.掌握DNA和RNA在化學(xué)組分、分子結(jié)構(gòu)和生物功能上的特點(diǎn)。2.掌握DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和t-RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的要點(diǎn)，了解核酸的三級(jí)結(jié)構(gòu)。3.熟悉核酸的性質(zhì)（一般性質(zhì)、DNA熱變性、復(fù)性與分子雜交）。4.掌握基因組的概念，原核生物和真核生物基因組的特點(diǎn)。了解DNA測(cè)序的原理。導(dǎo)入：核酸是生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)。它的發(fā)現(xiàn)和研究進(jìn)展如何？1868年瑞士青年醫(yī)生Miescher從膿細(xì)胞核中分離出一種含磷量很高的酸性化合物，稱為核素。其繼任者Altman發(fā)展了從酵母和動(dòng)物組織中制備不含蛋白質(zhì)的核酸的方法，于1889年提出核酸（nucleic acid）

33、這一名稱。早期核酸研究因“四核苷酸假說”的錯(cuò)誤進(jìn)展緩慢。1943年Chargaff等揭示了DNA的堿基配對(duì)規(guī)律，1944年美國Avery利用致病肺炎球菌中提取的DNA使另一種非致病性的肺炎球菌的遺傳性狀發(fā)生改變而成為致病菌，發(fā)現(xiàn)正是DNA攜帶遺傳信息。Astbury、Franklin和Wilkins用X射線衍射法研究DNA分子結(jié)構(gòu)，得到清晰衍射圖。Watson 和Crick在此基礎(chǔ)上于1953年提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，說明了基因結(jié)構(gòu)、信息和功能三者之間的關(guān)系，奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。1958年Crick提出“中心法則”；60年代破譯遺傳密碼，闡明3類RNA參與蛋白質(zhì)生物合成的過程；70年代誕

34、生了基因重組和DNA測(cè)序生物技術(shù)，90年代提出人類基因組計(jì)劃，21世紀(jì)進(jìn)入后基因組時(shí)代。核酸的研究成了生命科學(xué)中最活躍的領(lǐng)域之一。第一節(jié) 核酸的化學(xué)組成天然存在的核酸有兩類，即脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）。DNA分子是生物體的遺傳信息庫，分布在原核細(xì)胞的核區(qū)，真核細(xì)胞的核和細(xì)胞器以及病毒中；RNA分子參與遺傳信息表達(dá)的一些過程，主要存在于細(xì)胞質(zhì)。一、核酸的基本組成單位核酸是一種多聚核苷酸，用不同的降解法得到其組成單位核苷酸。而核苷酸又由堿基、戊糖和磷酸組成。（一） 戊糖 DNA含-D-2-脫氧核糖，RN

35、A含-D-核糖。這是核酸分類的依據(jù)。核糖中的C記為15。（二）堿基（base） 核酸中的堿基有兩類：嘌呤堿和嘧啶堿。有5種基本的堿基外，還有一些含量甚少的稀有堿基。DNA和RNA中常見的兩種嘌呤堿是腺嘌呤（adenine，A）、鳥嘌呤（guanine，G）。而嘧啶堿有所不同：RNA主要含胞嘧啶（cytosine，C）、尿嘧啶（uracil，U），DNA主要含胞嘧啶、胸腺嘧啶（thymine，T）。tRNA中含有較多的稀有堿基（修飾堿基），多為甲基化的。（三）核苷是堿基和戊糖生成的糖苷。通過C1- N9或C1- N1糖苷鍵連接，用單字符表示，脫氧核苷則在單字符前加d。常見的修飾核苷有：次黃苷或肌

36、苷為I、黃嘌呤核苷X、二氫尿嘧啶核苷D、假尿苷等。注意符號(hào)的意義，如m5dC。（四）核苷酸是核苷的磷酸酯。生物體內(nèi)游離存在的多是5- 核苷酸（如pA、pdG等）。常見的核苷酸為AMP、GMA、CMP、UMP。常見的脫氧核苷酸有dAMP、dGMA、dCMP、dTMP。AMP是一些重要輔酶的結(jié)構(gòu)成分（如NAD+、NADP+、FAD等）；環(huán)化核苷酸（cAMP/cGMP）是細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)分子和信號(hào)分子。ATP在能量代謝中起重要作用。核苷酸是兩性電解質(zhì)，有等電點(diǎn)。核苷酸有互變異構(gòu)和紫外吸收。（含氧的堿基有酮式和烯醇式兩種互變異構(gòu)體，在生理pH條件下主要以酮式存在）二、核苷酸的連接方式RNA和DNA鏈都有

37、方向性，從5 3。前一位核苷酸的3- OH與下一位核苷酸的5位磷酸基之間形成3，5-磷酸二酯鍵，從而形成一個(gè)沒有分支的線性大分子，兩個(gè)末端分別稱為5末端和3末端。大分子的主鏈由相間排列的戊糖和磷酸構(gòu)成，而堿基可看作主鏈上的側(cè)鏈基團(tuán)，主鏈上的磷酸基是酸性的，在細(xì)胞pH下帶負(fù)電荷；而堿基有疏水性。討論：列表說明DNA和RNA在化學(xué)組成、分子結(jié)構(gòu)和生物功能方面的主要特點(diǎn)。第二節(jié) DNA的分子結(jié)構(gòu)一、 DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu) (primary stucture)DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指分子中脫氧核苷酸的排列順序，常被簡(jiǎn)單認(rèn)為是堿基序列（base sequence）。堿基序有嚴(yán)格的方向性和多樣性。一般將5- 磷酸

38、端作 為多核苷酸鏈的“頭”，寫在左側(cè)，如pACUGA（ 5 3） 。 在DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)中，有一種回文結(jié)構(gòu)的特殊序列，所謂回文結(jié)構(gòu)即DNA互補(bǔ)鏈上一段反向重復(fù)順序，正讀和反讀意義相同，經(jīng)反折可形成“十字形”結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)錄成RNA后可形成“發(fā)夾”樣結(jié)構(gòu)，有調(diào)控意義。 GCTA GTTCA CTC TGAAC AATT CGAT CAAGT GAG ACTTG TTAA DNA分子很大，最小的病毒DNA約含5000b。1965年Holley用片段重疊法完成酵母tRNAala 76nt 序列測(cè)定；1977年Sanger利用雙脫氧法（酶法）測(cè)定了X174單鏈DNA5386b的全序列。1990年實(shí)施的人類基

39、因組計(jì)劃（HGP），用15年，投資30億美元，完成人類單倍體基因組DNA3×109bp全序列的測(cè)定。該計(jì)劃由美、英、日、法、德、中六國科學(xué)家合作，于2003年提前完成，生命科學(xué)進(jìn)入后基因組時(shí)代，研究重點(diǎn)從測(cè)序轉(zhuǎn)向?qū)蚪M功能的研究。二、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)雙螺旋(double helix) 1953年，Watson和Crick根據(jù)Wilkins 和Franklin拍攝的DNA X-射線照片（DNA有0.34nm和3.4nm兩個(gè)周期性變化）以及Chargaff等人對(duì)DNA的堿基組成的分析（A=T，G=C，A+G=C+T），推測(cè)出DNA是由兩條相互纏繞的鏈形成。Watson-Crick 雙螺

40、旋結(jié)構(gòu)模型如下圖：1兩條反向平行的多核苷酸鏈形成右手螺旋。一條鏈為5 3，另一條為3 5。（某些病毒的DNA是單鏈分子ssDNA）2堿基在雙螺旋內(nèi)側(cè)，A與T，G與C配對(duì)，A與T形成兩個(gè)氫鍵，G與C形成三個(gè)氫鍵。糖基-磷酸基骨架在外側(cè)。表面有一條大溝和一小溝。3螺距為3.4 nm，含10個(gè)堿基對(duì)（bp），相鄰堿基對(duì)平面間的距離為0.34 nm。螺旋直徑為2 nm。氫鍵維持雙螺旋的橫向穩(wěn)定。堿基對(duì)平面幾乎垂直螺旋軸，堿基對(duì)平面間的疏水堆積力維持螺旋的縱向穩(wěn)定。4堿基在一條鏈上的排列順序不受限制。遺傳信息由堿基序所攜帶。5DNA構(gòu)象有多態(tài)性。Watson和Crick根據(jù)Wilkins 和Frankl

41、in拍攝的DNA X-射線照片是相對(duì)濕度92%的DNA鈉鹽所得的衍射圖，因此Watson-Crick 雙螺旋結(jié)構(gòu)稱B-DNA。細(xì)胞內(nèi)的DNA與它非常相似。另外還有A-DNA、C-DNA、D-DNA。1979年Rich發(fā)現(xiàn)Z-DNA（左手螺旋、螺距4.5nm、直徑1.8nm）三、DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)DNA 雙螺旋進(jìn)一步盤曲所形成的空間構(gòu)象稱DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)。某些病毒、細(xì)菌、真核生物線粒體和葉綠體的DNA是環(huán)形雙螺旋，再次螺旋化形成超螺旋；在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的DNA是很長的線形雙螺旋，通過組裝形成非常致密的超級(jí)結(jié)構(gòu)。 1環(huán)形DNA可形成超螺旋 當(dāng)將線性過旋或欠旋的雙螺旋DNA連接形成一個(gè)環(huán)時(shí)，都會(huì)自動(dòng)

42、形成額外的超螺旋來抵消過旋或欠旋造成的應(yīng)力，目的是維持B構(gòu)象。過旋DNA會(huì)自動(dòng)形成額外的左手螺旋（正超螺旋），而欠旋形成額外的右手螺旋（負(fù)超螺旋）。一段雙螺旋圈數(shù)為10的B-DNA連接成環(huán)形時(shí)，不發(fā)生進(jìn)一步扭曲，稱松弛環(huán)形DNA（雙螺旋的圈數(shù)=鏈繞數(shù)，即T=L，超螺旋數(shù)W=0；L=T+W），但將這一線形DNA的螺旋先擰松一圈再連接成環(huán)時(shí)，解鏈環(huán)形DNA存在的扭曲張力，可導(dǎo)致雙鏈環(huán)向右手方向扭曲形成負(fù)超螺旋（T10，L=9，W = -1）。在生物體內(nèi)，絕大多數(shù)超螺旋DNA以負(fù)超螺旋的形式存在，也就是說，一旦超螺旋解開，則會(huì)形成解鏈環(huán)形DNA，有利于DNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄。 螺旋具有相同的結(jié)構(gòu)，但L值不

43、同的分子稱為拓?fù)洚悩?gòu)體。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶切斷一條鏈或兩條鏈，拓?fù)洚悩?gòu)體可以相互轉(zhuǎn)變。W的正表示雙鏈閉環(huán)的螺旋圈在增加，W的負(fù)表示減少。L和T的正負(fù)表示螺旋方向，右手為正，左手螺旋為負(fù)；L值必定是整數(shù)。2真核細(xì)胞染色體 真核細(xì)胞DNA是線形分子，與組蛋白結(jié)合，其兩端固定也形成超螺旋結(jié)構(gòu)。DNA被緊密地包裝成染色體來自三個(gè)水平的折疊：核小體、30nm纖絲和放射環(huán)。核小體是染色體的基本結(jié)構(gòu)單位，是DNA包裝的第一步，它由DNA結(jié)合到組蛋白上形成復(fù)合物，在電鏡下顯示為成串的“念珠”狀。組蛋白是富含精氨酸和賴氨酸的堿性蛋白質(zhì)，其氨基酸序列在進(jìn)化中是高度保守的。組蛋白有5種，H2A、H2B、H3和H4各兩

44、分子組成的八聚體是核小體核心顆粒，DNA纏繞其上，相鄰核小體間的DNA稱為連接DNA且結(jié)合H1。200 bpDNA的長度約為68nm，被壓縮在10nm的核小體中。壓縮比約為7。30nm纖絲是第二級(jí)壓縮，每圈含6個(gè)核小體，壓縮比是6。30nm螺旋管再纏繞成超螺旋圓筒，壓縮比是40。再進(jìn)一步形成染色單體，總壓縮近一萬倍。典型人體細(xì)胞的DNA理論長度應(yīng)是180 cm，被包裝在46個(gè)5m的染色體中。四、DNA和基因組1DNA分子中的最小功能單位稱作基因，為RNA或蛋白質(zhì)編碼的基因稱結(jié)構(gòu)基因，DNA中具調(diào)節(jié)功能而不轉(zhuǎn)錄生成RNA的片段稱調(diào)節(jié)基因?；蚪M（genome）是某生物體所含的全部基因，即全部DN

45、A或完整的單套遺傳物質(zhì)（配子中的整套基因）。2細(xì)菌、噬菌體、大多數(shù)動(dòng)植物病毒的基因組即指單個(gè)DNA分子。最小病毒如SV40的基因組僅有5226b，含5個(gè)基因。大腸桿菌含4.6×106 bp，有30004000個(gè)基因，DNA完全伸展總長約1.3mm。原核生物基因組的特點(diǎn)是：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)煉，絕大部分為蛋白質(zhì)編碼（結(jié)構(gòu)基因）；有轉(zhuǎn)錄單元，即功能相關(guān)的基因常串聯(lián)一起，并轉(zhuǎn)錄在同一mRNA（多順反子mRNA）中；有基因重疊現(xiàn)象，即同一段DNA攜帶兩種不同蛋白質(zhì)的信息。3真核生物基因一般分布在若干條染色體上，其特點(diǎn)是：有重復(fù)序列（按重復(fù)次數(shù)分單拷貝序、中度重復(fù)序和高度重復(fù)序）；有斷裂基因（由不編碼的內(nèi)

46、含子和編碼的外顯子組成）。酵母基因組有1.35×107bp，含6374個(gè)基因。人類基因組有3×109 bp，含4萬個(gè)基因。第三節(jié) RNA的分子結(jié)構(gòu)RNA通常以單鏈形式存在，比DNA分子小得多，由數(shù)十個(gè)至數(shù)千個(gè)核苷酸組成。RNA鏈可以回折且通過A與U，G與C配對(duì)形成局部的雙螺旋，不能配對(duì)的堿基則形成環(huán)狀突起，這種短的雙螺旋區(qū)和環(huán)稱為發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 RNA的C2位羥基是游離的，是一個(gè)易發(fā)生不良反應(yīng)的位置，它使RNA的化學(xué)性質(zhì)不如DNA穩(wěn)定，能較DNA產(chǎn)生更多的修飾組分。RNA的種類、大小、結(jié)構(gòu)都比DNA多樣化，按照功能的不同和結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，RNA主要分為tRNA、rRNA和mRNA三

47、類。此外，細(xì)胞的不同部位還存在著另一些小分子RNA，如核內(nèi)小RNA（snRNA）、核仁小RNA（snoRNA）、胞質(zhì)小RNA（scRNA）等，分別參與mRNA的前體（hnRNA）和rRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)和加工過程。一、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA）1分子量最小的RNA，約占總RNA的15%。主要功能是在蛋白質(zhì)生物合成過程中，起著轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的作用。21965年Holley等測(cè)定了酵母丙氨酸t(yī)RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，并提出二級(jí)結(jié)構(gòu)模型。一級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：核苷酸殘基數(shù)在7395；含有較多的稀有堿基（如mG、DHU等）；5-末端多為pG，3- 末端都是-CCA。3tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)為“三葉草”形，包括

48、4個(gè)螺旋區(qū)、3個(gè)環(huán)及一個(gè)附加叉。各部分的結(jié)構(gòu)都和它的功能有關(guān)。5端17位與近3端6772位形成的雙螺旋區(qū)稱氨基酸臂，似“葉柄”，3端有共同的-CCA-OH結(jié)構(gòu)，用于連接該RNA轉(zhuǎn)運(yùn)的氨基酸。3個(gè)環(huán)是二氫尿嘧啶環(huán)（D環(huán)）、反密碼子環(huán)、TC環(huán)。419731975年S.H.Kim的X射線衍射分析表明，tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)呈倒L字母形，反密碼環(huán)和氨基酸臂分別位于倒L的兩端。二、信使RNA（messenger RNA，m RNA）1細(xì)胞內(nèi)含量較少的一類RNA，約占總RNA的3%。其功能是將核內(nèi)DNA的堿基順序（遺傳信息）按堿基互補(bǔ)原則轉(zhuǎn)錄至核糖體，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。2種類多，作為不同蛋白質(zhì)合成的模板，其一

49、級(jí)結(jié)構(gòu)差異很大。真核細(xì)胞的mRNA有不同于原核細(xì)胞的特點(diǎn)：3- 末端有多聚A（polyA）尾，5-末端加有一個(gè)“帽”式結(jié)構(gòu),（m7 Gppp）。 3代謝活躍，壽命較短。三、核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）1約占細(xì)胞總RNA的80%。主要功能是與多種蛋白質(zhì)組成核糖體，是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所。2核糖體在結(jié)構(gòu)上可分離為大小兩個(gè)亞基。原核細(xì)胞的rRNA有3種，23S與5S rRNA在大亞基，16S在小亞基。真核細(xì)胞有4種rRNA，其中大亞基含28S、5.8S、5S，小亞基只有18S。3. 各種rRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)中的核苷酸殘基數(shù)及其順序都不相同，且有特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。第四節(jié) 核酸的性質(zhì)一、

50、一般理化性質(zhì)1DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末；都微溶于水，不溶于一般有機(jī)溶劑。常用乙醇從溶液中沉淀核酸。2具有大分子的一般特性。分子大小可用Da、b或bp、S、鏈長（m）表示。一個(gè)bp相當(dāng)?shù)暮塑账崞骄肿恿繛?60Da；1m長的DNA雙螺旋相當(dāng)3000bp或2×106Da。3兩性電解質(zhì)。各種核酸的大小及所帶的電荷不同，可用電泳和離子交換法分離。RNA在室溫下易被稀堿水解，DNA較穩(wěn)定，此特性用來測(cè)定RNA的堿基組成和純化DNA。4紫外吸收，最大吸收峰在260nm處，核酸的變性或降解，吸光度A升高，稱為增色效應(yīng)。二、核酸的變性和復(fù)性1變性的概念在理化因素作用下，核酸的雙螺旋區(qū)

51、氫鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，形成單鏈無規(guī)線團(tuán)狀態(tài)的過程。變性的因素有熱、酸、堿、乙醇、尿素等。變性的本質(zhì)是次級(jí)鍵的變化。變性的結(jié)果是紫外吸收值明顯增加（增色效應(yīng)），DNA粘度下降，生物學(xué)功能部分或全部喪失。2DNA的熱變性和TmDNA熱變性過程中，紫外吸收值增高，有一個(gè)特征性曲線稱熔解曲線，通常將熔解曲線的中點(diǎn)，即紫外吸收值達(dá)到最大值50%時(shí)的溫度稱為解鏈溫度，又叫熔點(diǎn)（Tm）。DNA的熱變性是爆發(fā)式的，像結(jié)晶的溶解一樣，只在很狹窄的溫度范圍內(nèi)完成，一般在70800C之間。變性溫度與堿基組成、DNA長度及變性條件有關(guān)。GC含量越高，Tm越大；DNA越長，Tm越大；溶液離子強(qiáng)度增高，Tm增加。3DN

52、A的復(fù)性與分子雜交 變性DNA在適當(dāng)條件下，兩條互補(bǔ)鏈可重新配對(duì)，恢復(fù)天然雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火（annealing）。影響復(fù)性速度的因素很多，如單鏈DNA的起始濃度、溫度（最適復(fù)性溫度是比Tm約低250C）、鹽濃度、片斷長度、序列復(fù)雜性等。分子雜交是以核酸的變性和復(fù)性為基礎(chǔ)，只要不同來源的核酸分子的核苷酸序列含有可以形成堿基互補(bǔ)配對(duì)的片段，就可以形成DNA/DNA，RNA/RNA或DNA/RNA雜化雙鏈，這個(gè)現(xiàn)象稱為核酸分子雜交（hybridization）。標(biāo)記一個(gè)來源的核酸（放射性同位素或熒光標(biāo)記），通過雜交可以檢測(cè)與其有互補(bǔ)關(guān)

53、系的DNA或RNA，這種標(biāo)記的核酸稱為基因探針（gene probe），也就是一段帶有檢測(cè)標(biāo)記，且順序已知，與目的基因互補(bǔ)的核酸序列?；蛱结樀摹凹苫?就是基因芯片（gene chip）。是把已經(jīng)測(cè)序的基因固定在硅片或玻璃片上制成的。在醫(yī)療診斷和科學(xué)研究中已被快速地運(yùn)用。三、核酸的序列測(cè)定DNA序列是指攜帶遺傳信息的DNA分子中的A、C、G、T的序列。分析方法主要有兩種，一種是Maxam-Gilbert化學(xué)法，另一種是Sanger的雙脫氧法?，F(xiàn)在一般都采用后者，其基本原理是：1用凝膠電泳分離待測(cè)的DNA片段（用作模板）。2將模板、引物、4種dNTP、合適的聚合酶置于4個(gè)試管，每一試管按精確

54、比例各加入一種ddNTP，用同位素或熒光物質(zhì)標(biāo)記。3利用ddNTP可特異地終止DNA鏈延長的特點(diǎn)，4個(gè)試管的聚合反應(yīng)可以得到一系列大小不等、被標(biāo)記的片段。4將4個(gè)反應(yīng)管同時(shí)加到聚丙烯凝膠上電泳，標(biāo)記片段按大小分離，放射自顯影后可按譜型讀出DNA序列。在以上兩種方法的基礎(chǔ)上，通過與計(jì)算機(jī)技術(shù)和熒光技術(shù)的結(jié)合，發(fā)明了自動(dòng)測(cè)序儀。目前，常用的測(cè)序策略是“鳥槍法”，形象地說是將較長的基因片段打斷，構(gòu)建一系列的隨機(jī)亞克隆，然后測(cè)定每個(gè)亞克隆的序列，用計(jì)算機(jī)分析以發(fā)現(xiàn)重疊區(qū)域，最終對(duì)大片段的DNA定序。第三章 酶教學(xué)目標(biāo)：1掌握酶的概念和作用特點(diǎn)，了解酶的分類與命名。2熟悉酶的分子組成、結(jié)構(gòu)與功能（單純酶

55、和結(jié)合酶，酶的輔因子、維生素的類別與功能，酶的活性部位，酶原激活，同工酶、變構(gòu)酶和抗體酶）。3熟悉酶的作用機(jī)制。4熟悉影響酶促反應(yīng)的因素（酶濃度、底物濃度、溫度、pH、激活劑與抑制劑；掌握酶促反應(yīng)速度的表示、米氏方程和米氏常數(shù)的意義）。5了解酶的制備與應(yīng)用。第一節(jié) 概 論導(dǎo)入：酶學(xué)知識(shí)來源于生產(chǎn)與生活實(shí)踐。我們祖先很早就會(huì)制醬和釀酒。西方國家于1810年發(fā)現(xiàn)酵母可將糖轉(zhuǎn)化為酒精；1833年，Payen及Persoz從麥芽的水抽提物中用酒精沉淀得到一種熱不穩(wěn)定物，可使淀粉水解成可溶性糖；1878年德國科學(xué)家屈內(nèi)（Kuhne）首先把這類物質(zhì)稱為酶（enzyme，其意“在酵母中” ）。1860年法國

56、科學(xué)家巴斯德（Pasteur）認(rèn)為發(fā)酵是酵母細(xì)胞生命活動(dòng)的結(jié)果，細(xì)胞破裂則失去發(fā)酵作用。1897年，Buchner兄弟首次用不含細(xì)胞的酵母提取液實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵，證明發(fā)酵是酶作用的化學(xué)本質(zhì)，獲得1911年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1926年，美國生化學(xué)家Sumner第一次從刀豆得到脲酶結(jié)晶，并證明是蛋白質(zhì)。1930年，Northrop得到胃蛋白酶的結(jié)晶（1946年二人共獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）。1963年測(cè)定第一個(gè)牛胰RNaseA序列（124aa）；1965年揭示卵清溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)（129aa）。一、酶的概念酶是由活細(xì)胞合成的，對(duì)其特異底物起高效催化作用的生物催化劑（biocatalyst）。已發(fā)現(xiàn)的有兩類：主要的一

57、類是蛋白質(zhì)酶（enzyme），生物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)4000多種，數(shù)百種酶得到結(jié)晶。美國科學(xué)家Cech于1981年在研究原生動(dòng)物四膜蟲的RNA前體加工成熟時(shí)發(fā)現(xiàn)核酶“ribozyme”，為數(shù)不多，主要做用于核酸（1989年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）。二、酶的作用特點(diǎn)酶所催化的反應(yīng)稱為酶促反應(yīng)。在酶促反應(yīng)中被催化的物質(zhì)稱為底物，反應(yīng)的生成物稱為產(chǎn)物。酶所具有的催化能力稱為酶活性。酶作為生物催化劑，具有一般催化劑的共性，如在反應(yīng)前后酶的質(zhì)和量不變；只催化熱力學(xué)允許的化學(xué)反應(yīng)，即自由能由高向低轉(zhuǎn)變的化學(xué)反應(yīng)；不改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)。但是，酶是生物大分子，又具有與一般催化劑不同的特點(diǎn)。1極高的催化效率 酶的催化效率通常比非催化反應(yīng)高1081020倍，